抽象的
原发性纤毛运动障碍(PCD)的诊断有时需要反复刷鼻以排除继发性纤毛改变。我们的目的是评估使用一种新的鼻上皮细胞培养方法是否可以加快可疑病例的PCD诊断,并通过多层人工神经网络(ANN)来识别哪些是信息量最大的参数。
涉嫌PCD患者进行横截面研究。所有患者均接受鼻刷的睫状运动分析,超微结构评估和筛选后综合函数的评价。
研究了151名受试者。在117个鼻胶凝中获得诊断悬浮细胞培养物。PCD的诊断是在36个科目中进行的(其中29名儿童)。在36例患者中,仅在第二次刷牙后诊断,因为在第一次检查时两种测试的结果也是如此。在这些受试者中,通过细胞培养结果证实了PCD的诊断。
通过ANN评估的悬浮细胞培养可以在培养5天后将PCD从继发性纤毛运动障碍患者中分离出来,对可疑病例可以进行诊断,从而避免了第二次样本的需要。
原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种罕见的遗传性疾病,其特征是上呼吸道和下呼吸道的慢性感染[1,2]通常通过临床特征的组合诊断出与鼻刷活组织检查的独特透射电子显微镜(TEM)图像和睫状运动分析(CMA)的频率和模式的频率和模式[3.].在这些检测方法不明确的相对较少的患者中,还有其他可用的检测方法,包括纤毛培养、纤毛蛋白免疫荧光和基因检测[4].偶尔需要更复杂的测试是有关的,因为由于感染或炎症的呼吸上皮损伤,PCD的诊断可能是困难的。此外,尽管睫状搏动模式的改变强烈暗示着原发性疾病,超微结构发现可能是正常的。5].在这些患者中,辅助测试可能特别有价值。如果怀疑次要损害,通常建议在抗生素和抗炎治疗期后推荐第二个样品,但即使通过这种策略,第二次刷牙可能不会诊断≥5%的病例[1].或者,当CMA和TEM提供等焦发现时,可以随着纤毛细胞的培养而达到PCD诊断,因为在培养物中含有纤西发生后几乎不存在。成功的培养物与人呼吸上皮的纤西发生有关,当聚集的细胞浮过球状体形式的培养基时,在培养的24-48小时后发生。这些由一层呼吸上皮细胞组成,其维持细胞极性,并且在没有PCD的受试者中,在其外表面上表现出正常的击打纤毛(在线补充视频剪辑1)。
如果在培养后坦率地区的睫状运动模式仍然存在诊断是PCD [6].过去,培养主要是对鼻钳活检获得的细胞进行培养[6,这是痛苦的。最近,我们证明了直接从刷过的鼻上皮细胞进行细胞培养是可能的,从而减少了第二次和更多创伤性采样的需要[7].通过我们的简化文化系统,当新的纤毛形成肯定发生时,才能在第21天的悬浮培养物中进行评估。然而,由于材料的数量有限,我们无法进行电子显微镜,PCD中的一个关键诊断测试之一,这是该技术的弱点。因此,我们假设,使用我们的简化文化系统中功能参数的软计算分析,我们可以准确诊断PCD,即使没有结构分析,才能在我们的单位(PISA大学,比萨斯,意大利大学医院的Dept of Pisa,Pisa,意大利)平均时间为2个月。基于软计算的模型[8)使用方法,如多层人工神经网络(ann),试图模仿人类思维,指导计算机处理不精确、不确定性和部分真理,并包括所有数据在算术算法能够平衡精度和不确定性在某种程度上类似于人类的大脑(8].他们可以分析复杂的医疗数据,利用有意义的关系,帮助医生诊断,治疗和预测临床结果。
因此,本研究的第一个目的是确定使用刷过的鼻上皮细胞,通过悬浮培养纤毛活性的精确评估本身是否能够在更短的时间内确定PCD的诊断。研究的次要目的是确定哪些参数的纤毛活动评估是最有帮助的最终诊断。我们每5天评估培养中不同的纤毛活动参数,然后,在软计算分析的帮助下,我们评估是否可以区分最终诊断为PCD的患者和没有PCD的患者。
材料和方法
主题
所有有PCD临床病史和体征的患者[22009年1月至2011年1月,Pisa大学儿科学系连续评估了反复出现的上呼吸道和下呼吸道感染和/或原位反转、鼻窦炎和/或支气管扩张。所有受试者在4周以上无呼吸道感染时,按照标准方法进行CMA、纤毛培养后纤毛超微结构评估和纤毛功能评估[9].第一次对所有受试者进行睫状体培养。因此,本研究的序列为涂刷和CMA,并将样品送往TEM和培养(如图。1).PCD和继发性纤毛运动障碍(SCD)的鉴别诊断在TEM应用前,通过CMA对鼻刷和培养纤毛发生(即。不使用ANN数据)。当TEM变得可用时,它被用作识别测试,以区分PCD和SCD。
PCD的明确诊断是基于刷毛和培养的结构和/或功能纤毛异常,考虑跳动频率和模式,如前所述[7].排除PCD,视纤毛异常为获得性时,诊断为SCD。在CMA和TEM首次评估结果不确定的受试者中,在适当的抗生素和抗炎治疗后,大约4个月后重复测试。从一开始,只有一位研究者(F. Montemurro),他在研究期间没有参与任何临床决策,知道细胞培养结果,这将用于神经网络的决定。在研究结束和软计算评估之前,CMA也由首席研究员(M. Pifferi)进行。刷牙的知情同意从每个成年患者和儿童的父母。当地医院伦理委员会(比萨大学医院)批准了这项研究方案。
悬浮细胞培养
如前所述进行细胞培养物[7].简而言之,当聚集的细胞漂浮通过球状体形式的介质时,发生人呼吸上皮的纤西发生。使用逆显微镜(倒置显微镜TE2000-S; in = 60的培养物(倒置显微镜TE2000-S; X 60)的培养物后鉴定了球状体并每5天进行睫状体活性的评估,直至培养的第20天。诊断基于对五个参数的观察,被认为是协调睫状体活性的表达,即。:1)旋转球体(是或否);2)迁移球状体(是或否);3)纤毛去除碎片或红细胞的能力(是或否);4)正常运动类型;5)如果发现≥40%的观察领域,则病理运动类型。通过对比度,普通睫状拍图案,或者,通过对比,例如减少的睫毛搏动频率,具有明显受限的节拍幅度和僵硬的纤毛运动模式[10.,或异常的非柔性搏动模式和多动搏动[11.],可以很容易地识别。这些参数每5天评估每5天,与最终诊断为二元变量:0:缺席,1:由ANN的存在和评估。
细胞培养结果的统计分析和软计算评价
基线变量用组均值±表示sd或作为中位数和四分位数范围(IQR),当变量是非正态分布。如前所述,在通常诊断途径的最后通过纤毛运动分析、TEM评价以及培养纤毛发生后基于纤毛活动评价获得的诊断被认为是评价细胞培养悬液不同参数的金标准[7].
使用标准方程产生对悬浮细胞培养的睫状活性评价的睫状活性评估的参数PCD的敏感性和特异性。所有统计计算都是使用SPSS版本18.0软件进行个人计算机的Windows(SPSS,Chicago,IL,USA)进行。
在TEM可用的结果之前,将软计算模拟方法应用于培养中的纤西发生期间的纤毛组合,以进行PCD或SCD的诊断。在该研究中,通过多层ANN识别模型。这是生物脑的数字化模型,可以检测受抚养人之间的复杂非线性关系以及数据中的独立变量,人类大脑可能无法检测到[12.].为了评估的时间诊断效率模型来预测最后的诊断,交叉验证过程的不同细胞培养特性(球状体的旋转,球状体的迁移,纤毛的清除能力碎片,正常的纤毛击败模式和病理纤毛击败模式)在天5,10,应用15和20。有关细胞培养结果的软计算评估的进一步细节可在在线补充材料中获得。
结果
研究对象为151名(如图。1).117例(77.5%;男性65人,儿童91人,年龄1.5个月至57.0岁;151名受试者的中位年龄(IQR)为9.30(12.0)岁(所有细节见在线补充表S1)。23例(15.2%)患者的培养在前48小时内被感染,11例(7.3%)患者的培养不成功,要么是因为刷样中缺乏细胞,要么是因为在整个培养期间球形体中没有发现纤毛。此外,由于样本较少,在117例患者中有9例(7.7%)和10例(8.5%)的细胞悬液培养时间(通常为20天)分别缩短为10天和15天。
纤毛运动分析(异常运动模式,包括纤毛不动和/或纤毛跳动频率很低)和纤毛TEM评估(中央对的改变和动力蛋白臂的缺陷,有36例(30.8%)患者(29例儿童)最终确诊为PCD。在九36例,诊断后才获得了第二个刷因为模棱两可的结果在一个主题或正常的纤毛超微结构的存在和刚性的运动机能亢进的纤毛运动模式在八个科目在第一次考试(所有细节在线补充表S2)所示。在这9名受试者中,在通过细胞培养结果获得TEM结果之前(表格1)(在线补充视频2)。
其余81例(69.2%)患者(68例儿童)的纤毛运动分析显示,少数纤毛异常,纤毛粗大,纤毛跳动频率低,与SCD兼容(有一例患者在抗生素强化和延长治疗后第二次刷牙后才发现继发性变化,但从培养中正确识别出SCD)。在这81名受试者中,TEM评估清楚地显示了与慢性炎症兼容的非特异性异常(肿胀纤毛和复合纤毛的流行)。在所有这些患者中,先前的细胞培养结果都有力地提示了SCD的诊断。
而且,可以看出表格1,纤毛活动评估,在整个20天悬浮细胞培养的时期,展示了一个旋转的球状体64年81例(79%)受试者SCD的最后诊断,且仅在一个(2.8%)的患者36 PCD(一个球体的旋转细胞培养开始后10天)。本例患者的诊断是由DNAH11复合杂合突变[11.].81例SCD患者中有14例(17.3%)发现球体移动,但未发现PCD患者;81例SCD患者中有6例(7.4%)纤毛能够清除碎片,PCD患者中无一例。当检测到纤毛持续运动,但未观察到纤毛清除碎片的球形体的移动或旋转时,81名SCD患者中有52名(64.2%)在CMA中观察到纤毛正常跳动模式,但没有PCD患者。相比之下,在36例PCD患者中有12例(33.3%),但在没有SCD的患者中,观察到病理纤毛模式(表格1).特别是,分别在4名和8名受试者中检测到纤毛搏动频率降低,搏动幅度明显受限,纤毛运动模式僵硬或异常非柔性搏动模式多动。
报道了PCD诊断的不同参数的敏感性,特异性,PPV和NPV表2..
考虑到球状体的旋转,割光球体的迁移,纤毛的能力除去5-20天的碎屑和睫状运动的类型,基于安基尔的模型能够识别几乎所有病例的最终诊断(PCD 99.5±0.3%; SCD 98.8±1.2%)。
此外,由于球状体的旋转证明了敏感性和特异性的最佳组合,我们分析了基于ann的模型正确区分PCD和SCD的能力,并将此参数和其他三个参数一起考虑。
在报道表3,该模型在考虑球体旋转和睫状体运动类型的情况下几乎都能正确识别PCD或SCD。这在细胞培养的第五天是正确的。其他组合就不那么准确了。
讨论
该研究的主要发现是,在鼻刷悬浮细胞中的培养是可以在约80%的样品中获得的,并且在我们手中使用ANNS,这允许在1周内将PCD的分化为SCD,并且以前均匀TEM结果可用。
该研究的优势包括使用ann对数据进行客观分析,即。由计算机生成的数学算法。通过这种方法,我们已经能够识别这两个参数,当合并时,是最准确的诊断(球体旋转和纤毛运动类型)。仅培养5天后,这些方法已被用于准确识别近95%的PCD患者。神经网络从标准数据中学习并获取数据中包含的知识。进一步的优势包括与钳活检相比,刷诊的相对非创伤性。最初,用于培养的细胞是通过更多的创伤性方法获得的,如穿刺活检,这可能会导致疼痛和出血。穿刺活检还有一个缺点是,与刷取细胞相比,建立细胞培养需要更长的时间[7,13.,14.].然而,这项技术具有高产栽培的优点。穿刺活检和刷活检所得的纤毛气液培养物[14.]的结果是培养出足够的纤毛组织,可以用电子显微镜观察纤毛,这是我们的简化技术不可能做到的,但该技术的成功率只有54% [14.而不是这里的80%。与气液技术,然而,文化成功率降低到26%患者更严重的继发性变化,也就是说,在集团的风险谁假阳性诊断是更有可能的是,和之前必须培养的细胞为21天,增加失败的风险(7].这是通过起始材料的缺乏加剧,这在随后的通道中倾向于进一步减少。然而,本研究清楚地表明,长期的文化是不需要进行PCD的诊断。
本研究的主要缺点是不可能采用透射电镜技术,但不同纤毛运动模式的ppv结果>98.5%的准确性,因此几乎可以诊断所有患者。当然,TEM,当诊断(例如,外动力蛋白手臂缺陷)时,是一个重要的测试,但它不是金标准,因为有正常超微结构的PCD病例都有很好的描述[5,11.].这是我们的8名患者的情况,他们从一开始就通过培养中纤毛形成的研究被正确识别。即使我们不能执行电子显微镜在细胞培养的简化技术,软计算允许我们诊断PCD前第二次刷牙和TEM没有提供一个额外的22%的病人在不到一个星期的第一个鼻刷牙,不诉诸于第二次刷牙。结果是令人惊讶的,考虑到悬浮培养的上皮细胞球状体在第一周失去纤毛,而在1-2周后才发展出新的纤毛[15.].我们推测恢复正常睫状体活性,在没有先天性缺陷的情况下,不需要形成完整的新纤毛,但可能由于细胞基体与纤毛之间的正常贩运蛋白质复合物的正常流动而发生提示根据纤毛的装配,维护和功能所需[16.].在这种情况下,值得注意的是,第二睫状基因突变独联体可以纠正第一个,好奇地造成的异常表型,有时有时候,没有明显恢复缺失的子结构[17.- - - - - -20.].我们建议光学获取和软计算算法的专用系统中的集成将允许评估时间依赖的细胞培养结果迅速获得,从而节省成本。因此,在获得结果的延迟延迟时,TEM将成为一个确认工具。
理想情况下,我们将在第二组患者中验证这些发现,但这将需要相当长的时间来产生足够多的新患者。然而,网络是通过n倍交叉验证方法进行验证的。交叉验证是对不可见数据估计模型性能的几种方法之一。在n倍交叉验证中,原始数据集被随机划分为n个子集。对于每个交叉验证步骤,一个单独的子集被保留为验证集(或测试集,即。验证队列),剩余的N-1子子集用作训练集。然后重复交叉验证过程n次,每个N子集合用一旦作为测试集使用一次。然后,折叠的N结果可以平均(或以其他方式组合)以产生单个估计。在我们的作品中,应用了在第5,10,15和20天的不同细胞培养特征的五倍的交叉验证过程;每个折叠由随机选择的数据组成,并且每个类别索引至少一个包含在每个折索引中。我们认为这种交叉验证非常强大;比仅仅使用一半作为发现队列和一个用于验证的一半仅将队列分成一半。
我们的研究暗示PCD是一种罕见且难以诊断的疾病,可疑病例可能需要反复检测[21.,22.].首先,问题包括,TEM变化可能是次要的环境粘膜损伤,例如炎症和细菌或病毒感染,过敏和吸烟[23.,或可能因标本制备不当而引致[24];第二,在少数纤毛不动的患者中,纤毛超微结构可能正常或接近正常[25- - - - - -28].在这方面,最近讨论了确定金标准诊断的复杂性[4].我们相信这项新技术将使可疑病例的诊断明显变得容易。
如果有诊断疑问,鉴定致病性遗传突变将是理想的,如我们非常非典型的PCD患者在具有旋转球状体的旋转,但PCD是遗传异质疾病,已经确定了超过250个潜在的候选基因[29].此外,遗传学研究具有区分疾病产生免受无害多态性的问题。诸如鼻氮氧化氮的其他研究是诊断过程的一部分[30.],但在罕见的PCD患者中可能是正常的,而在其他疾病如上呼吸道感染和囊性纤维化的受试者中可能是低的[31].在这些挑战性的情况下,纤毛细胞的培养非常有帮助,因为在培养的纤毛上皮的再生后几乎不存在二次变化,而原发性缺陷保持不变[32,33].
总之,使用简单的培养技术与ANNS的使用一起[34]为PCD与继发性纤毛运动障碍的可靠鉴别提供了新的机会。
致谢
我们要感谢P. Macchia(Pisa大学,意大利PISA,意大利大学医院),以便在睫状体障碍患者研究中的持续鼓励和支持,并在组织外关诊所的努力这种疾病。
脚注
这篇文章的补充材料可从www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这个项目是由NIHR呼吸疾病生物医学研究单位在皇家布朗普顿和哈里菲尔德NHS基金会信托和伦敦帝国理工学院(伦敦,英国)和由此基金会卡洛Laviosa.
兴趣表
没有宣布。
- 收到了2012年3月4日。
- 接受8月2日,2012年。
- ©2013人队