文摘
慢性炎症在哮喘和慢性阻塞性肺疾病病理结构改造的航空公司。使用tiotropium溴乙酰胆碱最近被确定为发挥重大的监管作用在气管平滑肌改造正在进行的过敏性哮喘豚鼠模型。本研究的目的是探讨气道重塑和比较的其他方面的有效性tiotropium糖皮质激素的布地奈德。
Ovalbumin-sensitised豚鼠被质疑为12周aerosolised卵白蛋白。
卵白蛋白诱导气道平滑肌增厚,hypercontractility气管平滑肌,增加肺收缩蛋白质丰度(平滑肌肌凝蛋白),粘液腺肥大,黏液的增加5 A和C亚型(MUC5AC)阳性的杯状细胞数量和嗜酸性粒细胞。此前有报道称治疗tiotropium抑制气管平滑肌增厚和收缩蛋白表达,并防止气管hypercontractility。这项研究表明tiotropium也完全阻止allergen-induced粘液腺肥大,和部分的增加减少MUC5AC-positive杯状细胞数量和嗜酸性粒细胞浸润。布地奈德治疗也阻止气道平滑肌增厚,收缩蛋白表达,气管hypercontractility和粘液腺肥大,部分减少MUC5AC-positive杯状细胞数量和嗜酸性粒细胞。
这项研究表明tiotropium和布地奈德也同样有效地抑制气道重塑的几个方面,提供进一步的证据的有利影响溴化tiotropium可能超过bronchodilation。
乙酰胆碱是主要的副交感神经递质在航空公司和自分泌或旁分泌激素的分泌non-neuronal起源,包括气道上皮细胞和炎症细胞1- - - - - -4。在呼吸系统,乙酰胆碱是传统与诱导气管平滑肌收缩和粘液分泌有关5;这些影响都是由毒蕈碱的受体,主要参与的毒蕈碱的M3受体亚型6- - - - - -9。副交感神经活动增加阻塞性气道疾病,包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)2。因此,毒蕈碱的受体拮抗剂,如短效ipratropium溴溴化和长效tiotropium,经常使用支气管扩张剂对于这些疾病,尤其是在慢性阻塞性肺病,迷走神经的语气似乎是主要的可逆的气道阻塞的组件10。
最近的证据表明,乙酰胆碱的功能作用在呼吸系统超过单纯气管平滑肌收缩和粘液分泌的感应。在体外毒蕈碱的受体的研究表明,长期刺激提高气管平滑肌收缩蛋白表达,pro-mitogenic信号和细胞增殖1,11,12。此外,毒蕈碱的受体刺激诱导原代培养的肺成纤维细胞的细胞增殖13和触发器促炎症介质的释放,包括白三烯B4,从气管平滑肌和气道上皮细胞和炎症细胞14- - - - - -17。这些炎性的乙酰胆碱可能增强炎症气道疾病,因为M3表达和功能增加慢性阻塞性肺病患者的中性粒细胞18。此外,在以前的研究中,发现气管平滑肌质量证据,收缩性和收缩蛋白表达增加反复allergen-challenged豚鼠气管平滑肌,这些特征改造(部分或全部)减少治疗的长效毒蕈碱的受体拮抗剂tiotropium溴离子19。这表明乙酰胆碱,作用于毒蕈碱的受体,可能导致哮喘和慢性阻塞性肺病的病理生理学和发病机制在更大程度上比目前感激2。
抗胆碱能类的潜在anti-remodelling影响allergen-induced气道重构的特点,除了在气管平滑肌,迄今为止还没有被描述。此外,没有研究直接比较了anti-remodelling tiotropium溴其他治疗策略的影响。因此,本研究的目的是比较的有效性tiotropium溴化与糖皮质激素布地奈德proprionate,并调查这些治疗策略的影响上气道重塑的各个方面,包括气管平滑肌改造、细胞外基质沉积和食用的感应细胞。
材料和方法
动物
远雄specific-pathogen-free Dunkin-Hartley豚鼠(哈伦,希斯菲尔德,英国)重250 - 300克被敏感卵白蛋白(OVA)使用Al (OH)3作为辅助。动物实验4周后使用。本研究中描述的所有协议批准的格罗宁根大学动物实验委员会(格罗宁根的格罗宁根大学、荷兰)。
挑衅是由吸入aerosolised解决方案的卵子(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)或生理盐水有意识的和无限制的条件,如前所述20.。过敏原吸入时停止呼吸窘迫的最初迹象。没有需要预防过敏性休克抗组胺剂。
研究设计
豚鼠是挑战与卵子或盐水一旦每周一次,连续12周,诱导气道重构如前所述19,21。tiotropium治疗、动物收到nebulised溴化剂tiotropium(勃林格殷格翰集团、殷格翰集团、德国)在盐水(0.1毫米的解决方案;前3分钟)30分钟每个挑战生理盐水或卵子。布地奈德治疗,动物收到nebulised剂量的布地奈德(格罗宁根大学的礼物H.W. Frijlink)悬浮在盐水补充1%渐变80(1毫米悬挂;前15分钟)24和1 h每个挑战。治疗组如下:OVA-sensitised / saline-challenged (n = 9);OVA-sensitised / OVA-challenged (n = 10);OVA-sensitised / saline-challenged tiotropium-treated (n = 8);OVA-sensitised / OVA-challenged tiotropium-treated (n = 7);OVA-sensitised / saline-challenged budesonide-treated (n = 9); and OVA-sensitised/OVA-challenged/budesonide-treated (n = 7). For all of the tiotropium-treated animals and for some of the OVA-sensitised/saline-challenged (n = 5) and OVA-sensitised/OVA-challenged (n = 6) animals, lung material stored from a previous study19是用于组织学分析。OVA-sensitised / saline-challenged和OVA-sensitised / OVA-challenged动物,从先前生成的数据存储和新获得的肺材料集中生产单一OVA-sensitised / saline-challenged对照组和单个OVA-sensitised / OVA-challenged对照组。在为期12周的挑战协议,豚鼠体重监控周报;没有发现体重增加治疗组之间的差异。
组织收购
牺牲了豚鼠实验性脑震荡之后快速放血后24 h最后的挑战。肺都被立即切除并保持在冰上进行进一步处理。气管被转移到Krebs-Henseleit解决方案(37°C)饱和5% / 95%的氧气,二氧化碳组成如下(毫米):氯化钠117.5;氯化钾5.6;MgSO41.18;CaCl22.5;不2阿宝41.28;NaHCO325.0;和葡萄糖5.5,(pH值7.4)。
组织化学
横截面的主支气管肺左派和右派的叶被用于的形态学分析;部分被染色,以确定他们的各种组件。平滑肌被确认使用免疫组织化学染色smooth-muscle-specific肌凝蛋白重链(SM-MHC;美国Neomarkers, Fremont, CA),细胞外基质被确认使用马森三色的染色,和食用细胞被确定使用周期acid-Schiff (PAS)染色和免疫组织化学染色粘蛋白5 A和C亚型(MUC5AC;Neomarkers)。用于MUC5AC的抗体免疫组织化学曾被证明与豚鼠MUC5AC可交叉反应的22。主要使用horseradish-peroxidase-linked二级抗体和diaminobenzidine形象化的抗体。嗜酸性粒细胞在haematoxylin-and-eosin-stained肺部分被确定。航空公司内部分数码拍摄和subclassified软骨或noncartilaginous。所有免疫组织化学测量使用量化软件进行数字化23。
西方的分析
肺匀浆准备如前所述19。蛋白溶解产物被electophoresis dodecylsulphate-polyacrylamide钠凝胶分离,其次是标准的免疫印迹技术。抗体的视觉使用增强化学发光(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。照片的印迹分析densitometrically (TotallabTM;非线性动力学、纽卡斯尔、英国)。
等长张力测量
如前所述的等距浓度实验19。简单地说,浆液性结缔组织的气管是免费的准备。单一open-ring epithelium-denuded准备安装了等距记录在器官浴含有Krebs-Henseleit解决方案在37°C和二氧化碳饱和5% / 95%的氧气。平衡后,静息张力调整到0.5克;其次是pre-contractions使用20和40毫米氯化钾。冲洗后,另一个平衡段30分钟,累计量效曲线建立了使用醋甲胆碱。
数据分析
所有数据都意味着±扫描电镜。除非另有规定,统计差异意味着使用单向方差分析计算,其次是Newman-Keuls多个比较测试。差异意味着被认为是重要的假定值< 0.05。
结果
气道平滑肌
在先前的研究中,人们发现反复过敏原吸入气管平滑肌质量增加,肺收缩蛋白表达和气管平滑肌的收缩性,所有的气管平滑肌改造的说明19。这些变化被治疗部分完全阻止tiotropium溴离子。自从tiotropium对气管平滑肌的影响数据改造已经出版19,这些数据列于表1⇓。
相同类型的试验计划,以探讨布地奈德治疗的影响。类似于以前的报告,重复卵子挑战增加气道平滑肌质量noncartilaginous航空公司,没有在气管平滑肌质量变化大的软骨航空(图1所示⇓)。气道平滑肌质量量化使用抗体特定SM-MHC,严格的气道平滑肌收缩表型标记24。saline-challenged控制相比,SM-MHC-positive面积增加了66±15%重复接触过敏原后(p < 0.001)。这种增长是完全阻止通过与布地奈德治疗(图。1⇓)。布地奈德比tiotropium更有效地降低平滑肌增厚,这部分防止SM-MHC-positive区域,增加了76%,之前报道(表1⇑)19。
根据这些观察,在协议与以前的报告19,西方分析演示了一个标记为4.8±0.7倍增加肺SM-MHC表达式OVA-challenged动物(图2所示⇓)。观察气管平滑肌厚度,增加被布地奈德治疗几乎完全逆转。布地奈德并没有显著降低SM-MHC-positive区域和肺SM-MHC saline-challenged动物的表达。布地奈德的影响在肺SM-MHC表达式OVA-challenged动物比tiotropium的抑制作用更加明显,这部分减少了allergen-induced增加,38%,之前报道(表1⇑)19。
此外,重复卵子接触气管平滑肌的收缩性增加了32±1% saline-challenged动物(图3所示⇓)。虽然布地奈德治疗本身没有影响saline-treated动物相比,它完全逆转OVA-induced增加收缩性(图3所示⇓)。Tiotropium治疗也完全逆转OVA-induced气管收缩,增加额外的好处,因为它降低了最大收缩,甚至在saline-challenged动物,正如前面报告(表1⇑)19。总的来说,这些结果表明,布地奈德和tiotropium都有效地降低allergen-induced在豚鼠气管平滑肌改造。
食用细胞
粘液分泌过多是一个病态特性,在哮喘和慢性阻塞性肺病,这大大有助于气流限制27,28。粘液分泌过多,在这些患者中,伴随着粘液腺肥大,杯状细胞增生27,28。因此,食用易使用PAS染色细胞在肺的部分被量化。气道上皮内杯状细胞和粘膜下粘液腺体呈阳性染色。粘液腺和杯状细胞软骨中发现的主要航空公司;因此,只有软骨航空公司在这些实验评估。重复卵子接触诱导明显粘液腺地区45±7%的增长。尽管tiotropium溴和布地奈德在saline-challenged动物没有效果,两种治疗方法完全避免allergen-induced粘液腺肥大(图5⇓)。重复接触过敏原也倾向于诱导增加豚鼠总杯状细胞数;然而,这种差异没有达到显著性(p = 0.06)。有趣的是,布地奈德治疗部分总杯状细胞数减少,无论后续过敏原的挑战;溴化tiotropium杯状细胞数量也减少saline-challenged动物(图5 b⇓)。
卵子在杯状细胞增生的相对较小的影响可能与大量的杯状细胞,存在于豚鼠气道,即使在控制saline-challenged动物,可能掩盖进一步归纳过敏原。因此,额外的实验针对量化MUC5AC在气道上皮细胞染色。MUC5AC粘液分化中高度表达文化29日据报道,几乎检测不到航空公司控制的老鼠,尽管杯状细胞的存在30.。基于这些研究,提出,MUC5AC会比不是一个更加敏感的标记染色测量粘液在气道上皮细胞分化。的确,组织化学指示MUC5AC表达几乎缺席在saline-challenged豚鼠气道,而这个糖蛋白是高度诱导OVA-challenged动物(图。6⇓)。布地奈德和tiotropium治疗并没有改变MUC5AC-positive杯状细胞数量在saline-challenged动物,但部分MUC5AC感应减少了卵子(图6 b⇓)。总的来说,这些数据显示,布地奈德和tiotropium同样有效地降低allergen-induced食用细胞改造的航空公司。
讨论
结合前面的研究19,本研究的结果表明,溴化长效抗胆碱能代理tiotropium防止allergen-induced在豚鼠气道重构的几个方面,包括气道平滑肌增厚,肺收缩蛋白表达增加,hypercontractility气管平滑肌,由杯状细胞和粘液腺肥大、MUC5AC表达气道嗜酸性粒细胞。集体,内源性乙酰胆碱,作用于毒蕈碱的受体,发挥着广泛的作用在慢性过敏性气道疾病的病理,并针对这些影响与抗胆碱能类有一些承诺治疗asthma-associated病理生理学。
目前的结果还表明,tiotropium溴的anti-remodelling效应非常相似的布地奈德。比较这些药物的影响报道在前面和当前研究列于表1⇑。显然,tiotropium溴和布地奈德proprionate是有效预防allergen-challenged豚鼠气管平滑肌改造,尽管存在一些微小的差异。虽然定量比较两种药物的潜力是有限的在缺乏详细的剂量反应关系,浓度的tiotropium和布地奈德在目前的研究中,使用布地奈德治疗似乎更有效预防气管平滑肌增厚noncartilaginous航空公司;此外,布地奈德治疗废除收缩蛋白积累的增加,而溴化tiotropium是部分的抑制作用。相反,溴化tiotropium减少气管平滑肌的收缩性更大程度上比布地奈德。这些药物的影响粘液腺肥大和MUC5AC表达具有可比性。总的来说,数据表明,布地奈德和tiotropium也同样有效预防allergen-induced气道重塑。目前不清楚,然而,tiotropium是否也有效地扭转了气道结构改变。的皮质类固醇fluticasone有效地防止在布朗挪威大鼠气道重构,但不充分反向建立气道结构改变在同一动物模型31日。这种差异可以解释为什么糖皮质激素通常不能完全有效地扭转人类哮喘气道结构改变32。显然,未来的研究是必要的为了调查tiotropium的潜在影响建立气道重塑。
反复过敏原对气管平滑肌的影响改造是依赖于气道大小。在小noncartilaginous航空,观察气道平滑肌增厚,未见软骨大航空公司。尽管如此,气管平滑肌收缩性增加,这表明气道平滑肌改造在这个模型的特点是一个airway-generation-dependent气管平滑肌增厚和表型成熟。肺SM-MHC allergen-induced变化表达式支持这一论点,增加自∼65%气管平滑肌的noncartilaginous航空不足以解释总肺smooth-myosin大约增加到了原来的4倍。这表明SM-MHC /平滑肌细胞的表达必须增加,因此解释气管hypercontractility在类似平滑肌质量。
小说的结果本研究提供重要的见解的机制调节粘液腺肥大和MUC5AC表达由杯状细胞对过敏原的挑战。现在发现这些疾病预防tiotropium溴化提出一个重要的监管作用在食用的改造细胞毒蕈碱的受体。这是第一次研究证明粘液腺改造和MUC5AC表达过敏原是由内源性乙酰胆碱的反应。Tiotropium没有影响粘液腺体或MUC5AC表达健康的航空公司,这表明乙酰胆碱引起的病理生理改造气道炎症的存在是有条件的。这是支持的结果使用抗炎药布地奈德,产生效果惊人地相似。此外,溴化tiotropium阻止气道嗜酸性粒细胞allergen-challenged动物。有可能是乙酰胆碱促进从气道结构细胞趋化因子和细胞因子的释放,报道气道上皮细胞和气管平滑肌14- - - - - -16,航空公司为了吸引炎症细胞,和功能上与这些细胞所释放的生长因子或细胞因子诱导改造直接影响结构靶细胞,类似于对气管平滑肌改造所观察到的2,11。尽管transactivation表皮生长因子受体的毒蕈碱的受体已经被报道在结膜杯状细胞33的角色,没有详细的分子研究调查毒蕈碱的受体气道粘液腺增生和肥大的存在。需要未来的分子和细胞的研究为了阐明细胞内信号机制支撑毒蕈碱的受体的反应。
tiotropium溴的anti-remodelling影响最深远的粘液腺和气道平滑肌。两者都受迷走神经的神经支配,尤其是在近端航空公司和表达毒蕈碱的受体2。此外,溴化tiotropium还部分阻止MUC5AC表达通过气道杯状细胞,并倾向于减少杯状细胞数量在盐水和OVA-challenged动物。气道上皮细胞的神经支配,包括杯状细胞,不同物种之间34;然而,众所周知,这些细胞表达acetylcholine-synthesising酶胆碱乙酰转移酶、转运分子的排泄乙酰胆碱和乙酰胆碱本身35- - - - - -38。目前尚不清楚乙酰胆碱参与allergen-induced粘液气道上皮的分化神经元或non-neuronal起源。然而,在体外和体外研究表明毒蕈碱的受体对肺成纤维细胞增殖的影响13和气道炎症15- - - - - -18和目前的观察,tiotropium降低气道嗜酸性粒细胞募集non-neuronal乙酰胆碱的现实可能性的航空公司可能是一个因素在哮喘和COPD气道重塑;明确指明了未来的研究在这个领域。
反复过敏原挑战不产生可衡量的变化在马森气道壁内的三色的染色,在软骨或noncartilaginous航空公司。然而,由于毒蕈碱的受体调节人类肺成纤维细胞的增殖13这种可能性的存在,这种受体系统调节矩阵生产在一定程度上患者的气道壁内。抗胆碱能药物的潜在影响上气道壁内细胞外基质沉积,因此,需要进一步调查。
目前的早些时候与布地奈德确认结果在活的有机体内和在体外发现证明预防糖皮质激素对气管平滑肌增厚的影响39。抗增殖的机制,解释糖皮质激素对气管平滑肌的影响尚未完全阐明,但似乎涉及抑制细胞周期调控蛋白的细胞周期蛋白D1和细胞周期抑制p21蛋白的刺激Waf1 / Cip139- - - - - -41。此外,目前的研究提供了一些新颖的见解糖皮质激素的行动,因为它已经证明了布地奈德是有效预防气管平滑肌的收缩蛋白表达和hypercontractility。这表明,糖皮质激素治疗可以防止气道平滑肌表型成熟在活的有机体内,这符合最近的研究使用培养的人气道平滑肌细胞,表明糖皮质激素抑制收缩蛋白质积累42。糖皮质激素的目标的机制尚未研究在体外并要求调查。
布地奈德避免食用细胞在当前模型的改造。抑制作用的布地奈德allergen-induced杯状细胞增生小鼠均有描述43。虽然在豚鼠布地奈德杯状细胞数量减少,这种效应出现独立的后续过敏原的挑战。这也是观察tiotropium,杯状细胞减少saline-challenged动物的数量。豚鼠表达大量杯状细胞,甚至saline-challenge条件下;显然,基底杯状细胞数量可以通过针对糖皮质激素和调制毒蕈碱的受体,建议本构趋化因子/细胞因子的参与和乙酰胆碱释放在维护杯状细胞数量在几内亚猪。布地奈德也阻止了allergen-induced增加MUC5AC-positive杯状细胞和粘液腺区。由于气道炎症是粘液分泌过多的发展的关键44布地奈德的抑制性行为可能不是完全意想不到的。此外,直接糖皮质激素对粘蛋白基因表达的影响的报告在体外45。结合使用溴化tiotropium获得的结果,这些数据表明,糖皮质激素和抗胆碱能药物都可能有效预防改造食用细胞在过敏性气道疾病。
总之,本研究的结果表明,tiotropium有效防止多个特性多次allergen-challenged豚鼠气道重塑。这表明一个重要的监管作用,乙酰胆碱,通过毒蕈碱的受体,在过敏性气道疾病的病理生理学。的anti-remodelling影响tiotropium相媲美的糖皮质激素布地奈德。因此抗胆碱能药物的有益的治疗效果,如tiotropium溴化,可能超过他们的bronchodilatory效应,可能会减少气道重塑和肺功能下降患者遭受慢性呼吸道疾病。
- 收到了2007年1月13日。
- 接受2007年5月18日。
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