文摘
本研究的目的是确定supercontractile平滑肌细胞的发展,导致哮喘病人的特异性的代航空公司,是由于转化生长因子(TGF) -β。
在培养平滑肌细胞饥饿切除10%胎牛血清7天,经济增长被逮捕;30%变得细长,证明超级收缩性。条件培养基的研究表明TGF-β区分因素。钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)进行逮捕细胞条件培养基。两个蛋白质乐队确定为基质金属蛋白酶(MMP) 2和TGF-β1。确定第二信使信号通过SMAD2,免疫印迹和共焦显微镜了。
条件培养基从逮捕文化显示MMP-2的存在和TGF-β1,揭示了sds - page;68 -和25-kDa乐队。证实了分化upregulation标记蛋白质,平滑肌肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链型激酶。确认是通过下调这些蛋白质与decorin治疗,从而降低的水平积极TGF-β和adenoviral显性负突变II型TGF-β-receptor向量编码。激活第二信使信号被磷酸化的存在证明了采用SMAD2和SMAD4。
转变增长factor-β可能是区分因素负责这些supercontractile平滑肌细胞的发展。这些细胞的发展在活的有机体内戒烟后的哮喘发作可能导致航空公司出现在患者的特异性的代答。
最重要的进步1- - - - - -5在慢性哮喘的发病机制一直是识别,它是一种慢性炎性疾病相关的气道平滑肌细胞肥大和增生(ASMC)。随着ASMC的变化,产生增生,伴有调制的细胞分泌表型与收缩性降低,看起来,哮喘气道狭窄是由于更多的几何变化比收缩性增加。然而,收缩性的增加可能是一个重要的因素。
逮捕ASMC在文化
支持上述观点来自研究培养犬气管平滑肌细胞(台积电)。这些细胞通常无力地合成类型和收缩。然而,如果复制不到10%胎牛血清(的边后卫)刺激被逮捕在融合70%血清,30%的细胞表型改变,成为supercontractile6。他们表达成熟平滑肌收缩和监管型蛋白质和分化成成熟的细胞。
改变增长factor-β1
证据显示的贡献因素,如转化生长因子(TGF) -β,哮喘的发病机制7,8。TGF-β分泌作为一个潜在的复杂9,10。多个进程可以激活TGF-β,允许它绑定到II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体(TβR) II10。配体结合TβRII TβRI引起胞内域的磷酸化。反过来,TβRI磷酸化receptor-activated Smad2 (R-Smad2),形成一个复杂的和常见的中介Smad4 (co-Smad4);这二聚体,直接或间接地与不同的目标基因,之后把从细胞质到细胞核。
Decorin
TGF-β作为受体激活需要绑定的活跃,激活潜伏TGF-β是必要的。这是活动带来的基质金属蛋白酶(MMP) 211- - - - - -13。Decorin,细胞外基质的另一个组件,只是绑定激活,而不是TGF-β的潜在形式4随后块TGF-β函数14,15,这表明监管作用。之前的研究表明co-localisation decorin和TGF-β人体结缔组织9,16,因此作为TGF-β水库。
ASMC TGF-β释放,这可能促进分化。血清饥饿气道平滑肌细胞条件培养液的文化报道新supercontractile表型有关6。推测在这些条件下,TGF-β被释放,这反过来,自分泌的诱导分化作用。
表达的adenovirus-mediated dn-TGF-β-receptor II型
TβRII TGF-β所需信号17。后者通过绑定TβRII行为,然后激活TβRI18。使用突变TβRII已被证明阻止TGF-β信号19- - - - - -25。这一块是预防磷酸化的影响下游效应器,如Smad蛋白质21。这种技术被报道是有效的在不同的细胞类型25,26。
Smad蛋白质
在大多数哺乳动物系统,TβRI磷酸化Smad2 (R-Smad2),形成一个复杂co-Smad4;这把细胞核与细胞质蛋白质输入蛋白α的帮助23和结果复杂的绑定到适当的基因启动子。尽管Smad复合物结合DNA,这个反应需要绑定的低亲和力的额外因素有效的转录21。
结果报道在此建议气管平滑肌细胞的分化机制。目前作者表明,血清饥饿培养细胞伴随着TGF-βI和MMP-2的表达增加。这是伴随着增殖的平滑肌细胞表达蛋白质的转换(nonmuscle类型的肌球蛋白重链(MHC)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK))的分化细胞(平滑肌类型(sm) MHC和激酶)。这些变化可以部分避免使用decorin阻止抗体和通过转染adenovirus-dominant负TβRII结构。而这种分化报道在血管27和其他类型的平滑肌,当前报告是最早对气道平滑肌6,28的角色,唯一一个TGF-β研究作为区分因素。分化的过程可能发生在任何光滑的肌肉发生炎症和增殖。
材料和方法
细胞培养
马犬台积电是孤立的et al。6。推荐的程序是那些动物伦理委员会的作者的机构(温尼伯马尼托巴大学、MB、加拿大)。对于每一个实验,播种密度为5.0×104细胞·厘米−2镀,直径100毫米的塑料培养皿中。70%的融合,文化转向无血清培养基(F12)含有硒(1纳米)胰岛素(1纳米)和转铁蛋白(65.8 nM;坐),保持在这个状态只要要求逮捕。每组5细胞株用于动物。
收集的条件培养基
孵化后的细胞需要一段时间,条件培养基收集从文化,放置在一个无菌埃普多夫管1 mg·毫升−1每个亮抑酶肽抑肽酶和胃酶抑素,储存在-80°C。
测量单个细胞力学
逮捕细胞获得如上所述。方法详细描述之前了et al。6。单个细胞可以分开使用的包和力学性能的研究。后的包的数目足够多(20 - 30)收集从培养皿中,他们被用于研究MHC和MLCK亚型。倒置显微镜细胞长度测量。最大限度的缩短应用电脉冲刺激细胞引起的(10 Hz、40 V, 1 ms宽度)。细胞的图像记录使用摄像机安装在显微镜。细胞缩短最大缩短能力(Δ然后分析l马克斯缩短)和最大速度(Vo)。缩短测量是在零负荷应用。增加Vo和Δl马克斯由电场刺激引起的手术被称为“supercontractility”6。
免疫印迹、免疫蛋白免疫印迹和免疫检测
培养、融合性的狗台积电(70%)在150年被细胞溶解µL修改里帕裂解缓冲(pH值8.0;40毫米三(pH值8.0),150毫米氯化钠,1% IGEPAL (NP-40), 1%去氧胆酸,μg·5毫升−1每个亮抑酶肽抑肽素和抑肽酶,20毫米氟化钠)。蛋白质含量测定采用bicinchoninic酸法。蛋白质提取物(25µg)和广泛分子量标记相隔8 - 12%(重量/体积(w / v))钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),然后转移到硝化纤维膜。一夜之间,阻塞后,膜被孵化在4°C,在稀释的溶液1µg·µL−1的单克隆antimouse MLCK(σ克隆K36;σ,圣路易斯,密苏里州,美国),anti-α-smooth肌肉肌动蛋白(σ1 a4)克隆,anti-MHC(σ克隆HSM-V) anti-rabbit TβRII, anti-rabbit TGF-βI或多克隆抗体anti-mouse MMP-2抗体在0.01% TBS-T包含5%的脱脂奶粉。屁股都洗,然后用streptavidin-horseradish孵化过氧化物酶共轭(1:4,000)稀释TBS-T含有1%脱脂奶粉1 h在室温下。墨迹是视觉效果增强化学发光,受到微。
荧光免疫细胞化学
免疫荧光分析如前所述6。新孤立的细胞被镀在酸化six-well菜肴,alcohol-treated盖玻片。70%的融合,细胞被逮捕了7天,固定在1% paraformaldehyde-PBS (pH值7.6),permeabilised Triton x - 100然后阻塞为0.1%。主要抗体(包括稀释1:25)兔anti-smooth肌肉(sm) MLCK鼠标anti-smMHC和anti-smooth肌肉α-actin(α-SMA)。与二次抗体治疗后,盖玻片洗,细胞核染色染料(20µg·赫斯特33342毫升−1;分子探针,尤金,或者美国)。使用尼康Diaphot显微镜幻灯片拍摄。
易位Smad2复杂的从细胞质到原子核是由共焦显微镜检测采用phosphospecific Smad2抗体。
TGF-βELISA
的Duo-Set®TGF-β酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)是用来确定TGF-β内容中立的培养基(代表活跃TGF-β)或培养基酸化,随后中和(代表总TGF-β)根据制造商的指示。鼠标anti-TGF-β捕获抗体(100μL)被涂布到96孔酶标在室温下过夜。洗后(3×200µL)清洗缓冲(PBS Tween-2 0.05%, pH值7.2 - -7.4),样品与200年被封锁µL阻断缓冲区(Tween-20 5%, 5%与0.05%蔗糖在PBS南3)在室温下至少1 h。盘子被(3×200µL)洗缓冲区,然后孵化100µL生物素化的鸡反TGF-β检测抗体(稀释到300 ng·毫升−1在试剂稀释剂)在室温下24小时。盘子里然后洗(3×200µL)清洗缓冲然后孵化100µL streptavidin-horseradish过氧化物酶(稀释下)在每个20分钟在室温和保护从直接光。底物的解决方案由一个1:1的混合颜色试剂(H2O2试剂B)和颜色(tetramethylbenzidine)。50毫升1 M H2所以4被用来阻止colourimetric反应。颜色复杂的光密度是阅读使用功率波标采用KC4软件一套基于windows的个人电脑在562海里,与此同时测量值的密度在450 nm减去产生修正光学密度。TGF-β浓度计算出的样本的四个参数/逻辑回归方程系数KC4计划。
此处则的双重质量光谱分析
检查差异表达蛋白,1毫升条件从serum-starved媒体收集,逮捕了台积电。媒介在PBS透析24小时在4°C和蛋白质分离使用10% (w / v) sds - page和彩色银染色工具包(蛋白质;Amersham,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)根据制造商的指示。∼68 kDa乐队被切除并受减少carboxyamidomethylation和胰蛋白酶消化。胰蛋白酶的肽是由微细管分析、反相高效液相色谱法和nano-electrospray串联质谱在哈佛微量化学和蛋白质组学分析工具(美国Cambridge, MA)。肽测序也进行了。与目前的测序结果,识别潜在的匹配进行了同源性搜索的援助基本局部比对算法搜索工具(爆炸)29日。
Decorin预处理
Decorin预处理可用于部分块增加TGF-βI蛋白质积累在细胞条件培养基从serum-deprived文化。Decorin调节矩阵组装绑定到胶原蛋白9,16。它还结合其他蛋白质,重要的其中是TGF-β16。Co-localisation decorin和TGF-β一直在报道支气管活检30.。复杂的两个可能作为水库TGF-β它可以被适当的刺激中解放出来。重组体人decorin于100年从商业来源购买µg很多在1毫升10 nM PBS稀释的Ca2 +和毫克2 +。在实验中需要decorin, 100 nm dismeter培养皿中含有犬气道细胞冲洗与100 nm PBS的Ca2 +和毫克2 +(2×3毫升)和样本处理µg·5毫升−13毫升F-12 insulin-transferrin-selenium补品中含有1%(它;Gibco / BRL,伯灵顿,美国)24 h。在完成治疗,培养皿冲洗10 nM PBS免费的Ca2 +和毫克2 +(2×3毫升)和10毫升F-12中含有1%的添加和细胞进一步serum-deprived所需的持续时间。
包含突变TβRII与腺病毒载体转染
犬台积电转染有一个adenoviral向量表达变异人类类型TβRII截断的激酶结构域(Adv-dn TβRII);它是由目前的作者(f·谢赫和公共广播Cattini)。这种构造废除TGF-βligand-mediated细胞质丝氨酸/苏氨酸域的信号,因为删除防止细胞内信号传播的介质19。百分之七十汇合的文化与Adv-dn转染TβRII(感染复数(MOI) 10)或控制腺病毒(Adv-TrLacZ,表示细菌牛乳糖),在无血清培养基24 h在37°C的5%被孵化有限公司2,然后被serum-starved 6天。
半乳糖苷固定细胞的染色
采用无血清犬台积电转染了Adv-TRLacZ 24 h时37°C 5%孵化有限公司2,然后serum-starved进一步6天。细胞与PBS含有1.25%戊二醛固定在室温下5分钟。铁氰化钾溶液(5毫米,5毫米铁氰化钾,2毫米氯化镁在PBS)添加在1:40稀释半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d半乳糖苷)产生“最后半乳糖苷的解决方案”。以下两个洗Ca2 +无PBS,最后半乳糖苷的解决方案是添加和细胞在37°C 5%孵化有限公司2直到一个蓝色4 - 6 h内发达。这种染色时停止细胞包含Ca与PBS冲洗2 +/毫克2 +使用电荷耦合器件相机和图像捕获。
胶基质zymography
评估的影响血清剥夺MMP-2表达式和活动,分析了条件培养基,in-gelatine zymography。简单、样品(50µL)上运行一个8% (w / v) SDS聚丙烯酰胺凝胶含有1毫克·毫升−1猪明胶和洗了三次以去除SDS和允许酶复性。一夜之间,凝胶被孵化MMP激活缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值7.5,含1.25% Triton x - 100, 5毫米CaCl21μM ZnCl2)染色前0.25% (w / v) Coomassie蓝色的解决方案。清除gelatinolytic活动的区域观察使脱色。
数据分析
数据表示为±se。确定无疑,单向方差分析是用来分析之间的差异在不同的跨度为平均值。邓肯的新的多个测试被用来确定哪些平均值差异表示负责。比较蛋白表达的差异,统计显著性是由未配对t检验,p < 0.05被认为是重要的。
结果
形态学supercontractile表现型的饿狗台积电在文化
形态,两种不同种类的细胞被培养immunocytology, 15-day-arrested台积电,如前所报道6。图1⇓显示一组出现小,平的,明亮的细胞(细胞);数值,这些由∼70%的细胞在文化和第二组(长细胞)显示一个细长,主轴对齐的平行束的形状。Halaykoet al。31日报道的存在对逮捕的肌纤维膜细胞毒蕈碱的M3受体;之间的缝隙连接也看到后者类型的细胞。他们被发现拥有一个闪亮的肌纤维膜和(意味着±se)190±25.5µm平均长度的第七天血清剥夺。数值,他们由28.5±4.6%的细胞,但由于其细胞质体积几乎占领了这道菜的总面积的40%。由于super-contractility,只是试图确定这些细胞被转换到骨骼肌细胞。然而,在五个实验,没有sarcomeric MHC的表达式,肌钙蛋白C或T,或MyoD观察。
力学犬supercontractile表现型的台积电在文化:标记蛋白质
缩短容量(细胞最佳长度或百分比lo)与时间显示,逮捕了细胞缩短两倍的新孤立控制细胞(控制)。的Vo逮捕的细胞控制的两倍。
使用特定的抗体免疫印迹分析表明,长细胞包含了smMHC smMLCKα-SMA。Nonmuscle细胞类型相同的蛋白表达下调。显示主要有丝分裂增殖小细胞的蛋白表达模式,即。MHC和MLCK nonmuscle类型。
识别∼68 kda的蛋白带礼物只在serum-deprived条件媒体
胰蛋白酶的肽是由微细管分析、反相高效液相chromatography-nano-electrospray串联质谱学在哈佛微量化学和蛋白质组学分析设施(美国Cambridge, MA)。识别潜在的匹配与孤立的蛋白质,测序进行并取得了以下独特的序列:WYDVLR。调查是否饥饿血清差异表达蛋白,从增殖条件培养基,7天serum-deprived犬台积电检查。∼68 kDa蛋白质带(图。2⇓),切除和减少受到carboxyamidomethylation和胰蛋白酶消化。随后与特定的抗体免疫印迹分析证实了这一点。
图3一⇓显示西方滴MMP-2条件媒体获得天的3、6和9的血清饥饿。图3 b⇓是一种酶谱显示蛋白水解活性MMP-2作为时间的函数。
增加血清饥饿的持续时间
增加TGF-β蛋白质在细胞条件培养基从文化受到的持续时间增加血清饥饿。犬类的条件培养基台积电TGF-βI蛋白质含量进行了分析。介质的分离、蛋白质分离使用8% (w / v) sds - page,转移到硝基和接受放射自显影法。免疫印迹的条件培养基显示TGF-β蛋白质含量高细胞增殖(天0)时,变得没有饥饿的第三天,然后重新出现在天6浓度增加,9和12。这表明时间的TGF-βserum-starved细胞蛋白表达MMP-2的模仿。值得注意的是,虽然蛋白质含量有增加了9天,它远远小于在天0。类似TGF-β增加了6天使用Duoset酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。Decorin预处理减毒血清deprivation-induced TGF-β总数和活跃。
decorin对TGF-β1蛋白表达的影响
ELISA检测到一个显著增加活动和总TGF-β1蛋白质条件培养液中达到峰值的6天血清饥饿培养细胞。
Decorin预处理(5µg·毫升−1)24小时阻止血清deprivation-induced增加6天。邓肯双向方差分析相结合的新的多重范围测试进行了到达上面的结论(p < 0.05)。
添加外源TGF-β对细胞长度的影响
TFG-β加入文化增殖并逮捕了细胞浓度的1、2、10和20 ng·毫升−1。这些被添加到独立的文化在天1,3,4,7,分别是10岁、11岁和14岁。使用客观镜头显微镜细胞长度测量。数据的三维图如图4所示⇓。serum-fed细胞意味着细胞长度的6天,当扩散文化汇合的70%,是85.4±1.9µm (n = 60)。这个时候,血清饥饿是开始对未来“逮捕”细胞,称为天0细胞。他们的平均长度是81.3±1.8µm (n = 60)。而峰值增殖细胞长度是106±2.0µm达到7天,serum-starved细胞为155.7±4.2µm被捕。此后,逮捕了细胞变得更小。
TβRII蛋白质积累与decorin serum-deprived犬台积电预处理
没有显著的影响(p > 0.05) serum-deprivation或decorin预处理TβRII蛋白质表达。结合交联实验数据,这些数据表明,TGF-β封锁通过可能出现decorin扰乱TGF-βTβRII TβRI协会,并且效果不加剧了TβRII水平的改变。
Adv-dn TβRII块积累的台积电表型标记
进一步证实假设TGF-β台积电在文化的区分因素,预计差别其对这些基因与表型的改变从分化到合成,与相应的标记蛋白的变化。狗因此,台积电转染的adenoviral向量表达人类II型TGF-β受体突变(Adv-decorin (dn) -TGF-βRII)。先前的研究32表明,这种构造的丝氨酸/苏氨酸催化域被截断,干扰细胞内TGF-βI-βRII-βRI信号。
ASMC培养与10%的边后卫然后serum-starved 24 h。仔细分析显示,细胞形态均匀。显示的字段从四个随机选择的选择,来自四个不同的菜肴的细胞。这些数据表明,长,supercontractile表型的细胞最初没有出现在任何明显的数量(< 5%),和以后的发展。时间进程的研究需要确定何时开始变化。文化增殖的细胞感染Adv-TβII-βGal (MOI = 10)。24 h后,serum-fed介质代替血清和细胞进一步剥夺了一个附加的6天。细胞培养与半乳糖苷(1毫克·毫升−1),4 h在37°C到蓝色象征β-galactosidase被认为成功的基因转移。细胞核的细胞染色的蓝色也可以看到平均为90%,表明高效腺病毒感染。
文化在70% confluency然后转染Adv-dn-TGF-βRII (MOI 10)或控制腺病毒(Adv-TGF-βR-LacZ,表示细菌牛乳糖)在无血清培养基24 h,而37°C 5%孵化有限公司2然后serum-starved 6天(图。6⇑)。
转染与Adv-dn-TGF-βRII能够表达下调血清starvation-induced smMLCK积累和smMHC而控制向量(图7所示⇓)。此外,无论是构造α-SMA表达的变化引起的。
讨论
本研究确定TGF-β,表达更丰富的条件培养基培养细胞进行血清饥饿,可以分化因素supercontractile,分化的细胞,在这些条件下发展。为了达到这个目标,标记蛋白质被确定为这些细胞。smMHC和MLCK被证明是有效的分化状态的标记。增殖细胞显示非常低水平的这些标记,而上调水平的MHC和nonmuscle类型MLCK nonmuscle类型。因此这些标记蛋白的表达应该帮助识别各种细胞的表型。
的最高浓度TGF-β在从增殖细胞中被发现。白天在启动血清饥饿、水平急剧下降3和增殖率大大减少。天6和9的水平增加,尽管从未在0天一样的水平。众所周知,而高水平的TGF-β扩散,低水平支持细胞凋亡或分化。来测试假设TGF-β水平在天6,9和12可以这些supercontractile细胞的区分因素,downregulation进行了研究。被使用,差别两种方法对这些如下:1)与decorin逮捕了细胞的治疗,它返回逮捕细胞部分增殖状态;与Adv-dn-TβR-II和2)转染的细胞,产生相同的改变33,34。
确定TGF-β补充体内增殖的培养基,并逮捕了(serum-starved)细胞会显示相同的定性影响仅作为逮捕的那些细胞,适当的进行实验(图4所示⇑)。图4⇑描述细胞长度的函数在文化,并清晰地显示细胞增殖并逮捕了细胞间的长度的差异。
有趣的是,尽管增殖细胞从一个较小的比预期的长,他们随着时间的推移,逐步增加到14天。逮捕细胞显示大幅增加1天,没有添加TGF-β体内。这可能是由于内源性TGF-β的生产和出口培养基。在ng·1毫升的浓度−1体内添加过渡政府-β细胞长度是观察到相当大的增加。此后,在10到20 ng·毫升的浓度−1,细胞长度减少增殖的细胞。这种行为的一种解释是发生在serum-deprived细胞的接触抑制时细胞长度增加,相互联系35- - - - - -37。必须指出,虽然在增殖细胞的数量大于文化,逮捕了细胞的细胞质的数量更大,更容易建立细胞间联系。
进一步证明提供的TGF-β的作用是显示特定的第二信使信号可以由TGF-β。逮捕的细胞,采用phospho-specific Smad2抗体在细胞质中表达磷酸化Smad2示威。它的存在表明核易位的发生和其参与基因表达的可能性。描绘下游机制,进一步研究平滑肌α22日启动子的激活和MHC和MLCK启动子的激活将在未来,随着诱导物的评估活动,若分子,和激活特定的基因。
细胞增殖和分化类型的转换并不是独一无二的,由李报告了类似的结果et al。27。目前,只有可能猜测的洞察平滑肌分化的重要意义。开发这些细胞在哮喘患者的气道,可以大大有助于支气管收缩。场景存在炎性渗出液出现哮喘急性发作期间,生长因子,它们包含导致气道肌细胞增生和肥大,进而导致气道阻塞。一旦急性发作减少,类似于目前的研究状态的培养细胞生长在serum-deprived媒体可以开发的合成开发supercontractile细胞表型。时机出现时将会发生特异性的航空公司的代答,这通常遵循一个哮喘的急性发作。周et al。38也报告了类似的结果在人类支气管平滑肌细胞培养。
确认
作者想感谢p·劳进行文字处理专家。
- 收到了2005年12月1日。
- 接受2007年6月19日。
- ©人期刊有限公司