文摘gydF4y2Ba
虽然DNA甲基化已经承认在特发性肺纤维化(IPF)的发病机理,具体机制尚未完全解决。在此,我们证明肺起源于IPF患者和老鼠后博来霉素(BLM)全身的肺纤维化的特点是改变DNA甲基化以及过度的myofibroblasts methyl-CpG-binding域2 (MBD2),读者解读DNA methylome-encoded信息负责。具体来说,损耗的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba在成纤维细胞或myofibroblasts保护小鼠免受BLM-induced肺纤维化加上显著减少成纤维细胞的分化。从力学上看,将生长因子(TGF) -β1诱导TGF-β受体之间的正反馈调节循环我(TβRI), Smad3 Mbd2和红细胞分化调节器1 (Erdr1)。TGF-β1诱导成纤维细胞进行全球DNA甲基化以及Mbd2过度TβRI / Smad3依赖的方式,和Mbd2选择性地绑定到DNA甲基化CpG内gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子抑制其表达,通过它增强TGF-β/ Smad信号促进纤维母细胞分化成myofibroblast和加剧肺纤维化。因此,加强Erdr1表情惊人逆转肺纤维化。总的来说,我们的数据支持策略旨在压制Mbd2或增加Erdr1可能是可行的治疗方法预防和治疗肺纤维化的临床设置。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
MBD2调节在myofibroblasts IPF患者,从纤维母细胞促进myofibroblast的过渡gydF4y2Ba通过gydF4y2BaTβRI / Smad3 / Mbd2 / Erdr1监管的积极反馈循环gydF4y2Bahttps://bit.ly/3q0PhHAgydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性、进行性纤维化肺病,通常在3 - 5年内导致死亡后诊断(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。尽管过去的广泛的研究,但patho-aetiology底层IPF仍然知之甚少,这使得它的主要治疗失败(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。一般来说,IPF的特点是上皮损伤和侵入性的成纤维细胞的分化gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。纤维母细胞的分化myofibroblast纤维化过程中发挥了至关重要的作用,有助于IPF肺组织的组织学特性(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。纤维等因素的刺激转化生长因子(TGF) -β和血小板源生长因子(PDGF),肺成纤维细胞分化成myofibroblasts,然后产生丰富的数量的纤丝的细胞外基质(ECM)的蛋白质包括I型胶原、纤连蛋白诱发的发展矩阵刚度和病态矩阵沉积在肺间质gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
先前的研究表明,DNA甲基化,主要表观遗传因素之一,参与IPF的发病机制,但详细的潜在机制尚未完全阐明,(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。DNA methylome编码的信息通常是由一个家庭阅读methyl-CpG-binding域(MBD)蛋白(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaMBD1、MBD2 MBD4 MeCP2),选择性地绑定到甲基化CpG DNA,从而抑制或增加目标基因的转录gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。特别是MBD2拥有最高的DNA甲基化CpG[绑定能力gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),因此参与肥胖的发病机制(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba],缺血性损伤[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),自身免疫(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)、糖尿病(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba和肿瘤发生gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。有趣的是,MBD2也发现IPF患者的肺中高度表达和老鼠后博来霉素(BLM)全身的肺纤维化。因此,在本报告中,我们生成的小鼠模型与具体gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏在成纤维细胞或myofibroblasts。这是指出的损失gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba在成纤维细胞或myofibroblasts显著保护小鼠免受BLM-induced肺纤维化以及显著减少myofibroblasts抑制成纤维细胞分化。机械的研究特征TGF-β受体I (TβRI) / Smad3 / Mbd2 / Erdr1监管的积极反馈循环。具体来说,TGF-β1诱导成纤维细胞进行全球DNA甲基化以及Mbd2过度TβRI / Smad3-dependent方式;虽然Mbd2选择性地结合高度甲基化gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子抑制其表达,通过它增强了TGF-β/ Smads信号向myofibroblast促进纤维母细胞分化。总的来说,我们的数据支持,改变MBD2表达成纤维细胞对肺纤维化的发展至关重要,因此,策略旨在压制MBD2或增加Erdr1可以减弱纤维发展的可行疗法在临床的设置。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
试剂和抗体gydF4y2Ba
I型胶原抗体买来EMD微孔(Schwalbach、德国),而抗体prosurfactant蛋白C (pro-SPC)、纤连蛋白和α-SMA从Abcam订购(马、美国)。抗体对p-Smad2、p-Smad3 Pi3kp85 p-Pi3kp85, p-Akt, Erk1/2, mTOR, p-mTOR, p-Erk1/2,物,p-Jnk, P38和p-P38从细胞信号技术(马、美国)。抗体MBD2和甘油醛3 -磷酸脱氢酶从圣克鲁斯生物技术(美国CA)和Erdr1抗体获得抗体研究公司(美国密苏里州)。小鼠得到重组TGF-β1 PeproTech(英国伦敦),而所有其他试剂购自σ(美国密苏里州),除非另有说明。gydF4y2Ba
人类的样本gydF4y2Ba
从nonsmall切除para-carcinoma肺组织细胞性肺癌(NSCLC)患者(n = 6)和IPF患者肺外植体材料(n = 8)收集在同济医院(武汉,中国)知情同意。IPF诊断是根据欧洲呼吸学会/美国胸科学会共识诊断标准(188bet官网地址gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。部分肺组织被最佳切削温度复合(10月)嵌入;这些标本切片免疫染色。剩余肺组织切除到0.5 - 1厘米gydF4y2Ba3gydF4y2Ba并保存在液氮免疫印迹或DNA甲基化分析。批准的研究人类保证同济医院委员会(TJ-IRB20210942)。提供临床资料gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
博来霉素诱导的肺纤维化gydF4y2Ba
的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2BaC57BL / 6小鼠背景定期使用集群生成中间短回文的重复序列(CRISPR) Bioray -Cas9系统实验室(上海,中国)。两个gydF4y2BaloxPgydF4y2Ba在内含子插入序列侧翼外显子2的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba描述的一样,gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba。gydF4y2BaColl1a2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2gydF4y2Ba和gydF4y2BaActa2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2gydF4y2Ba转基因小鼠购自上海生物模型中心(上海,中国)。的gydF4y2BaColl1a2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2Ba和gydF4y2BaActa2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2Ba老鼠了,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba小鼠产生gydF4y2BaColl1a2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba或gydF4y2BaActa2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba老鼠,分别。gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba成纤维细胞缺乏或myofibroblasts腹腔内注射引起的它莫西芬(75 mg·公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba连续五天)gydF4y2BaColl1a2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba或gydF4y2BaActa2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba诱导fibroblast-specific 8-week-old老鼠gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏(定义为gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CFKO老鼠),或myofibroblast-specificgydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏(定义为gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CMKO老鼠)。同窝出生的(gydF4y2BaColl1a2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 -gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba或gydF4y2BaActa2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2−gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba老鼠)管理与同等剂量的三苯氧胺被用作控制(定义为gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba- c)。传统的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba基因敲除小鼠C57BL / 6(定义为背景gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠)请提供的艾德里安鸟(英国爱丁堡爱丁堡大学)。野生型C57BL / 6小鼠(WT)定义了从北京Huafukang生物科学(中国,北京)。gydF4y2Ba
Mbd2gydF4y2Ba- c,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CFKO,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CMKO,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba和WT曝露老鼠1%戊巴比妥钠(60 mg·公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba),其次是气管内的注入0.5毫克公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2BaBLM(日本Kayaku、东京、日本)在40μL生理盐水的高压雾化烧针(BJ-PW-M;生物简贸易有限公司、上海、中国)。老鼠同样体积的生理盐水作为管理控制。gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒颗粒(1×10gydF4y2Ba7gydF4y2BaIFU(传染性单位))注入到犀牛动物气管内的10天BLM之后注入。老鼠管理与模拟慢病毒粒子作为控制。老鼠的安乐死后21天BLM挑战评估肺纤维化。四叶的肺(上部叶,中部叶,叶低劣和post-caval叶)立即在液态氮冷冻和储存在−80°C。所有老鼠都安置在指定的无菌设施在同济医院用12/12小时光/暗周期。所有实验程序批准的动物保健和使用委员会在同济医院(tjh - 201901015)。gydF4y2Ba
组织学和免疫组织化学分析gydF4y2Ba
老鼠的左肺膨胀与200μL 4%中性缓冲多聚甲醛,从中部地区和切片。左肺上地区放在新鲜4%中性缓冲多聚甲醛在室温下24 h。石蜡包埋后,从每个老鼠肺部切片为5-μm部分(三个部分,间隔200μm)和苏木精和伊红())和马森染色。一个幻灯片,五视觉领域被随机选择100×放大获得意味着阿什克罗夫特评分由两位病理学家蒙蔽的方式(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。左肺低地区与10月嵌入化合物和存储−80°C。疣状,OCT-embedded人类和小鼠肺切成7-μm部分。冻结部分与抗体探测α-SMA, pro-SPC, Mbd2 Erdr1,其次是与Alexa染色萤石594 -标签anti-mouse /兔子或Alexa萤石488 -共轭anti-rabbit /鼠标抗体(表达载体、钙、美国),分别。图片是在荧光显微镜获得的(奥林巴斯、新宿、日本)。gydF4y2Ba
文化和治疗原发性肺成纤维细胞gydF4y2Ba
主要从肺肺成纤维细胞来源于小鼠,IPF患者和对照组,(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。细胞种植在37°C和5%与10%胎牛血清的DMEM补充二氧化碳(的边后卫)和青霉素和链霉素。媒介是每三天更换一次。成纤维细胞分化的细胞被刺激与重组TGF-β1 (10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在表示时间点)。gydF4y2Ba
小干扰RNA转染gydF4y2Ba
小干扰rna (siRNAs)具体MBD2和相应的炒siRNA买来RiboBio(广州),然后是暂时性的转染到主肺成纤维细胞使用Lipofectamine 3000(英杰公司、上海、中国),报道(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。简而言之,主肺成纤维细胞被播种在转染前12-well板24小时。核转染细胞达到60%融合进行了一次。转染效率监测使用逆转录酶聚合酶链反应(RT)或转染48 h后免疫印迹。以下两个siRNAs用于MBD2: siRNA1 5ʹgca AGA GCG 8月UCU ACU a - 3ʹsiRNA2 5ʹGCG AAA CGA UCC UCU CAA u - 3ʹ(RiboBio)。为gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba核转染,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba肺成纤维细胞在DMEM培养与10%的边后卫被转染的补充gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba小干扰rna (RiboBio)可以阻止或控制,如前所述。转染细胞与小鼠重组下刺激TGF-β1 (10 ng·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba表示时间点),其次是比较myofibroblast转换。gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
上叶的肺组织老鼠和人类被试和培养细胞单一化里帕裂解缓冲(Beyotime、上海、中国)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑(罗氏,武汉,中国),和蛋白质受到西方墨点法表示主要抗体,先前报道(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。简而言之,等量的溶解产物分离10%钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶和聚偏二氟乙烯膜转移。膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下1 h,然后孵化主要抗体在一夜之间在4°C。接下来,膜被孵化1 h在室温下用辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Servicebio,武汉,中国),之前的可视化乐队使用化学发光试剂(皮尔斯发射极耦合逻辑;热科学,乌尔姆,德国)。这些墨迹使用x射线胶片记录和实验室6.0.1中使用图像分析软件(Bio-Rad,慕尼黑,德国)。gydF4y2Ba
定量rt - pcr分析gydF4y2Ba
中部叶的总RNA分离小鼠肺癌和培养细胞使用TRlzol试剂(豆类,大连,中国)。RNA数量和质量是衡量使用NanoDrop 2000分光光度计(美国马热科学)。使用Moloney互补DNA合成进行了小鼠白血病病毒逆转录酶工具包(表达载体、钙、美国)。定量rt - pcr进行使用SYBR预混料Taq交货(豆类),和每个目标基因的相对表达正常化了gydF4y2BaActbgydF4y2Ba表达式,如前所述gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。提供了用于每个目标基因的引物gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
羟脯氨酸测定gydF4y2Ba
羟脯氨酸含量下叶的肺用羟脯氨酸测定工具包(南京建成研究所,南京,中国),如前所述[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。短暂的,新鲜的肺组织称重和碱性水解为20分钟100°C。调整后的pH值为6.0 - -6.8,玉米胚芽蛋白酶解物精制25 mg活性炭和离心机1150×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。上层清液,然后进行一系列的化学反应,与光密度值测定使用标550海里(ELx800, BioTek仪器、Winooski VT,美国)。提出了肺组织羟脯氨酸含量随着μg每g肺组织羟脯氨酸与羟脯氨酸的标准提供。gydF4y2Ba
RNA深度测序gydF4y2Ba
从WT rna,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba肺成纤维细胞提取使用RNA隔离设备(试剂盒、上海、中国),分别。RNA质量和完整性决定使用Nanodrop 2000分光光度计和安捷伦生物分析仪(美国CA)。RNA深度测序(RNA-seq)库是多路复用和加载到Illumina公司HiSeq流动池v3。所有测序协议按照制造商的说明进行使用Illumina公司HiSeq 1000系统和HiSeq控制软件。gydF4y2Ba
染色质免疫沉淀反应试验gydF4y2Ba
染色质免疫沉淀反应(芯片)进行了化验使用芯片检测工具(Beyotime)此前报道gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。简单地说,1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba肺成纤维细胞与甲醛交联,染色质分散进行了根据协议提供。这稀释可溶性染色质的解决方案准备因此一夜之间被孵化的Mbd2抗体与旋转4°C。正常兔免疫球蛋白是用来确定特异性的绑定。接下来,蛋白质的混合物被孵化+ G琼脂糖珠,洗后和protein-DNA复合物被筛选了。筛选了DNA受到ChIP-PCR表示引物。使用的引物gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba在芯片内测定5ʹggc TTT TTT AAA CTC手枪CCG-3ʹ(向前),5ʹggc gg法案ACA法案CCC AG-3ʹ(反向)。gydF4y2Ba
全球DNA甲基化分析gydF4y2Ba
全球使用MethylFlash甲基化DNA DNA甲基化是确定量化工具(美国纽约Epigentek)根据制造商的指示。简单地说,使用捕获和检测的DNA甲基化检测抗体5-methylcytosine (5-mC),然后量化colorimetrically使用微型板块读者通过阅读吸光度在450海里(ELx800)。gydF4y2Ba
亚硫酸氢DNA测序分析gydF4y2Ba
基因组DNA的制备亚硫酸氢进行了转换使用EZ DNA Methylation-Direct工具包(美国CA Zymo研究),先前报道(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。由此产生的产品被用作模板来放大目标序列,和PCR产物直接克隆到质粒测序。每个目标序列的甲基化状态然后使用DNA测序分析。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
对比使用棱镜组进行软件(Prism 8. lnk;美国CA GraphPad软件)。使用双尾t检验两组实验进行对比(数据与正态分布、方差齐性)或双尾Mann-Whitney测试(数据没有正态分布)。一旦超过两组比较,单向或双向方差分析与图基的多重比较检验与正态分布(数据)或与Dunn的克鲁斯卡尔-沃利斯检验gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba测试(数据没有正态分布)。所有实验至少有三个独立的复制。并给出了数据均值±gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ba/gydF4y2BasdgydF4y2Ba。在所有情况下,p < 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
IPF MBD2表达和DNA甲基化改变的特性gydF4y2Ba
解决在IPF MBD2和DNA甲基化的作用,我们首先检查MBD2表达式在IPF患者肺部和老鼠BLM-induced肺纤维化。指出这是IPF患者出现明显高于表达α-SMA myofibroblasts(标记),和更高的倍MBD2表达式指出,相对于对照组的肺(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。同样,从小鼠肺BLM感应后也表现出几乎Mbd2表达高3倍比控制,以及过度的α-SMA肺纤维化(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。这些结果促使我们描述细胞显示改变MBD2表达式。我们首先检查肺泡上皮II型细胞(AECII),作为他们的损伤和细胞凋亡的一个主要风险因素引发的IPF (gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。与对照组相比,co-immunostaining MBD2和pro-SPC AECII标记,未能发现MBD2 pro-SPC超表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaAECIIs IPF患者肺部分(gydF4y2Ba补充图S1agydF4y2Ba),和类似的结果在肺部分源于BLM-induced老鼠(gydF4y2Ba补充图印地gydF4y2Ba)。一致,没有检测到不同的AECII观察细胞凋亡之间BLM WT和挑战gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠(gydF4y2Ba补充图就是S1cgydF4y2Ba),这进一步证实了类似的表达pro-apoptotic蛋白质伯灵顿(gydF4y2Ba补充图S1dgydF4y2Ba)。然后我们开始间充质细胞,这是一个主要贡献者矩阵沉积和组织变形的发展过程中IPF发展(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。MBD2指出是IPF患者肺间质细胞中高度表达,就是明证PDGFR-βco-immunostaining (gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。同样,Mbd2几乎检测不到肺部分源于控制老鼠,而来自纤维化小鼠肺部分积累特征的间充质细胞连同Mbd2超表达(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。鉴于α-SMAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba和PDGFRαgydF4y2Ba+gydF4y2Ba间充质细胞代表两种不同的种类,不同的基因表达谱在成人的肺gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),我们下一个检查MBD2在间充质细胞的表达模式。事实上,α-SMA数量的增加gydF4y2Ba+gydF4y2BaMBD2gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和PDGFRαgydF4y2Ba+gydF4y2BaMBD2gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞在肺中发现部分IPF患者和肺纤维化小鼠(gydF4y2Ba图1 e和fgydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图S2a和bgydF4y2Ba)。然而,更多的α-SMAgydF4y2Ba+gydF4y2BaMBD2gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,PDGFRα少gydF4y2Ba+gydF4y2BaMBD2gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞中观察到肺部分来源于IPF患者和肺纤维化小鼠。进一步证实了这种观察,我们与TGF-β1诱导WT原发性肺纤维母细胞分化,并指出Mbd2分化myofibroblasts出现超表达(gydF4y2Ba图1 ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
如前所述,MBD2充当读者解读DNA methylome-encoded信息;这些结果使我们比较全球DNA甲基化水平在肺部IPF患者和对照组之间以及在肺纤维化小鼠BLM感应。的确,一个重要的全球DNA脱甲基指出从IPF患者肺部(gydF4y2Ba图1 hgydF4y2Ba),也获得了类似的调查结果在小鼠的肺纤维化(gydF4y2Ba图1我gydF4y2Ba)。总的来说,这些数据支持,肺纤维化的感应功能MBD2超表达随着全球DNA甲基化水平的降低。gydF4y2Ba
Mbd2过度依赖TgydF4y2BaβgydF4y2BaRI-Smad3信号gydF4y2Ba
接下来,我们进行免疫印迹和rt - pcr分析在初级TGF-β1刺激后小鼠的肺成纤维细胞,并证明TGF-β1诱发Mbd2过度剂量依赖性的方式(gydF4y2Ba图2 a和bgydF4y2Ba)。自正则TGF-β信号来说是至关重要的功能TGF-β1 [gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),我们执行co-immunostaining Mbd2和p-Smad2/3在这些细胞1 h TGF-β1刺激。正如所料,Mbd2 colocalised p-Smad2和分化myofibroblasts p-Smad3 (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。这些发现让我们假设Mbd2可能发挥它的功能下游TGF-β1-induced纤维化信号。为了解决这个概念,主要与SB431542鼠肺成纤维细胞治疗,TGF-β受体的选择性抑制剂我(TβRI)和SIS3-HCl (Smad3特定抑制剂)其次是TGF-β1刺激,分别。TGF-β1强烈诱导成纤维细胞分化就是明证和α-SMA myofibroblast标记纤粘连蛋白的表达而抑制的TβRI SB431542 (10 nM) (gydF4y2Ba图2 d和egydF4y2Ba()或Smad3 SIS3-HCl(5海里)gydF4y2Ba图2 f和ggydF4y2Ba)防止upregulation纤连蛋白和α-SMA。更重要的是,添加SB431542 (gydF4y2Ba图2 d和egydF4y2Ba)或SIS3-HCl (gydF4y2Ba图2 f和ggydF4y2Ba)完全废除TGF-β1-induced Mbd2表达,支持Mbd2过度被规范化TGF-β信号控制,TβRI和Smad3是重要的介质。gydF4y2Ba
需要Mbd2 myofibroblast纤维母细胞分化gydF4y2Ba
评估的功能相关性Mbd2在成纤维细胞过度表达,我们检查的影响gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏对成纤维细胞分化。值得注意的是,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏显著抑制成纤维细胞分化、减毒的纤连蛋白的表达,证明了胶原蛋白后我和α-SMA TGF-β1刺激(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)。rt - pcr分析,gydF4y2BaFn1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba),gydF4y2BaCol1a1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba),gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)进一步证实了这一观察。符合这些结果,TGF-β1时间诱导Mbd2表达式,和最高的表达是指出后48 h的刺激(gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba)。此外,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba超表达与纤维母细胞分化、高度相关的检测就是明证正相关gydF4y2BaFn1gydF4y2Ba(右gydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.4832,p < 0.005;gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba),gydF4y2BaCol1a1gydF4y2Ba(右gydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.7755,p < 00001;gydF4y2Ba图3 ggydF4y2Ba),gydF4y2BaActa2gydF4y2Ba表达式(RgydF4y2Ba2gydF4y2Ba= 0.9097,p < 0.0001;gydF4y2Ba图3 hgydF4y2Ba)。更重要的是,抑制核MBD2表达式的肺成纤维细胞来源于IPF患者和对照组明显减毒纤连蛋白的表达,胶原蛋白我和α-SMA (gydF4y2Ba图3我gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba)。总的来说,我们的数据表明,感应Mbd2超表达对成纤维细胞分化至关重要。在支持这一概念,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏对成纤维细胞迁移(没有显示显著影响gydF4y2Ba补充图S4agydF4y2Ba)、增殖(gydF4y2Ba补充图S4bgydF4y2Ba和细胞凋亡gydF4y2Ba补充图自己gydF4y2Ba),由Transwell试验,分别EdU染色法和膜联蛋白V / PI染色。在一起,这些数据表明Mbd2可能选择性地调节成纤维细胞myofibroblast分化。gydF4y2Ba
Mbd2gydF4y2Ba缺乏在成纤维细胞或myofibroblasts保护小鼠免受BLM-induced肺损伤和纤维化gydF4y2Ba
需要自Mbd2 myofibroblast两极分化,下一个关键的问题是gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏在成纤维细胞保护小鼠免受肺纤维化。我们生成的gydF4y2BaColl1gydF4y2BaαgydF4y2Ba2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba老鼠所描述gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏在成纤维细胞(gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba腹腔内注射-CFKO)诱导的连续五天(三苯氧胺gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba前12天BLM归纳。gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏胶原蛋白我gydF4y2Ba+gydF4y2Ba证实了细胞co-immunostaining肺部分(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba,箭头),验证通过pcr检测无效等位基因(gydF4y2Ba补充图S5agydF4y2Ba箱),gydF4y2BaColl1gydF4y2BaαgydF4y2Ba2gydF4y2Bacre等位基因在DNA隔离肺组织(gydF4y2Ba补充图S5bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
老鼠牺牲后21天BLM归纳。而控制(gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba- c)的老鼠,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CFKO老鼠显示显著减弱肺损伤和纤维化所体现的)和马森的三色的染色(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba左面板)和低得多的阿什克罗夫特得分为肺纤维化的严重程度(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba右面板)。羟脯氨酸的含量明显低于一致,所有类型的纤维胶原蛋白的重要组成部分,也被检测到的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CFKO老鼠(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。免疫印迹分析myofibroblast标记纤连蛋白,胶原蛋白和α-SMA肺溶解产物还表示中表达水平明显降低gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CFKO老鼠(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba),验证通过rt - pcr分析(gydF4y2Ba图4 f-hgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
进一步确认Mbd2的关键作用的过程中,成纤维细胞分化gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,我们进一步生成myofibroblast-specificgydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba通过穿越缺乏小鼠模型gydF4y2BaActa2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2Ba老鼠的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba如前所述,老鼠和gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏myofibroblasts (gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CMKO)诱导它莫西芬连续五天腹腔注射后第十天BLM感应(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)。gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏α-SMAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba证实了细胞co-immunostaining肺部分(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba,白色箭头)和基因分型(gydF4y2Ba补充图S5c和dgydF4y2Ba)。事实上,gydF4y2BaMbd2 -gydF4y2BaCMKO小鼠表现出明显减轻肺损伤和纤维化,就是明证病理染色和阿什克罗夫特的得分越低,相比之下gydF4y2BaMbd2 -gydF4y2BaC小鼠后21天BLM注入(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。此外,值得注意的是低水平的羟脯氨酸被观察到的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CMKO老鼠(gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)。一致,纤维化标志物的表达明显减弱gydF4y2BaMbd2 -gydF4y2BaCMKO老鼠被西方墨点法(gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba)和rt - pcr分析(gydF4y2Ba图5 fgydF4y2Ba- h)。gydF4y2Ba
为了进一步验证观察表型,传统gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba小鼠肺纤维化的进一步用于感应。类似的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CFKO和gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba-CMKO老鼠,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠非常耐BLM-induced肺损伤和纤维化(gydF4y2Ba补充图S6gydF4y2Ba)。综上所述,我们损失的数据支持gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba在成纤维细胞或myofibroblasts能保护小鼠免受BLM-induced肺纤维化。gydF4y2Ba
Mbd2gydF4y2Ba压制Erdr1表达促进纤维母细胞分化gydF4y2Ba
地址更详细的机制gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏变弱成纤维细胞myofibroblast转换,我们着手TGF-β下游信号分子使用gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba随着TGF-β1刺激成纤维细胞。我们早些时候的数据表明TGF-β1诱导Mbd2过度依赖TβRI-Smad3信号(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba),而事实上,TGF-β1刺激p-Smad2/3表达式的稳步增长。然而,它是指出,缺乏gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba显著的减毒TGF-β1诱导p-Smad2/3表达式(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba),但gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺陷并不影响增殖蛋白激酶和磷酸肌醇3-kinase信号就是明证p-P38方面没有显著差异,p-Jnk, p-Erk1/2, p-P85, p-Akt p-mTOR表达式之间TGF-β1-stimulated WTgydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞(gydF4y2Ba补充图S7a和bgydF4y2Ba)。同样的,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba没有显示出明显的不足影响Smad7抑制因子的表达(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba),SMAD特定E3泛素蛋白连接酶1 (Smurf1;gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)和Smurf2 (gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba),TGF-β-Smad2/3信号。总的来说,我们的数据显示可能的积极反馈监管循环TGF-β-Smads信号和Mbd2表达之间的肺成纤维细胞。gydF4y2Ba
RNA-seq是用来比较基因的表达模式与WT和纤维母细胞分化有关gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba肺成纤维细胞。代表Mbd2-associated基因改变了超过2.5倍被列入热图(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba)和火山情节(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)。我们发现1276 mrna, 418 lncRNAs ncRNA被调节,而1001 mrna, 185 lncRNAs和两个ncRNAs相比在WT肺成纤维细胞表达下调的gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba肺成纤维细胞后TGF-β1治疗。正如所料,RNA-seq和rt - pcr的结果表明Mbd2 WT成纤维细胞中高度表达(gydF4y2Ba图6克gydF4y2Ba)。指出Erdr1,已知与压力相关的生存因素抑制滑膜成纤维细胞迁移在类风湿性关节炎的进展(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),包含在一个集群中的基因表达的调节gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)。rt - pcr分析证实TGF-β1-inducedgydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba表达式是增长了6.5倍gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba肺成纤维细胞相比,在WT肺成纤维细胞(gydF4y2Ba图6 hgydF4y2Ba)。重要的是,在WT TGF-β1刺激成纤维细胞表现出一个倍减少gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba信使rna水平(gydF4y2Ba图6 hgydF4y2Ba)。一致地,惊人地下降Erdr1 mRNA表达在肺组织起源于IPF患者和对照组(gydF4y2Ba补充图S8gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
鉴于Mbd2作为读者解读DNA甲基化(编码的信息gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),数据促使我们分析基因组DNA和DNA甲基化状态gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba子通过亚硫酸氢全球DNA甲基化分析和DNA测序,分别。肺成纤维细胞的IPF患者表现出更高的全球基因组DNA甲基化比来自对照组(gydF4y2Ba补充图S9gydF4y2Ba)。值得注意的是,TGF-β1诱发全球基因组DNA甲基化在小鼠成纤维细胞(gydF4y2Ba图6我gydF4y2Ba),但无明显差异的DNA甲基化是指出WT -gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞(gydF4y2Ba图6我gydF4y2Ba)。然而,生物信息学分析(分子医学实验室,gydF4y2Bawww.urogene.org/index.htmlgydF4y2Ba)预测中的一个CpG岛gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子(gydF4y2Ba图6 jgydF4y2Ba)。亚硫酸氢DNA测序证实TGF-β1诱导gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子进行DNA甲基化区域从896个基点−−842 bp(转录起始站点+ 1),其中包含12 CpG网站,6显示重要的甲基化差异(gydF4y2Ba图6 kgydF4y2Ba)。类似地,gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba子显示可比WT与甲基化水平gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞(gydF4y2Ba图6 kgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
下一个关键问题是Mbd2选择性地结合hypermethylated CpG dna中gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子。芯片进行了试验和分析的结果证实Mbd2绑定到ChIP-PCR产品gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子区域位于954个基点−−682个基点,其中包括hypermethylated CpG DNA (gydF4y2Ba图6 lgydF4y2Ba)。重要的是,DNA methylation-dependent荧光素酶记者化验证实的转录活动gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba高在myofibroblasts突变质粒DNA(没有CpG地区从896个基点−−842 bp)比WT TGF-β1刺激后质粒(gydF4y2Ba图6米gydF4y2Ba)。总的来说,我们的数据支持,TGF-β1诱发Mbd2肺成纤维细胞的过度增强TβRI-Smad3信号、和Mbd2反过来加剧TGF-β1诱导Smad2/3激活;TGF-β1同时诱导成纤维细胞接受全球DNA甲基化,特别的gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba子,Mbd2结合DNA甲基化CpG镇压Erdr1表达式。gydF4y2Ba
Erdr1函数作为抑制因子抑制纤维母细胞的分化gydF4y2Ba
接下来,我们试图解决的功能相关性Erdr1表达成纤维细胞分化。我们第一次进行BLM-induced肺组织化学染色部分。值得注意的是,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞被更高数量的α-SMA特色gydF4y2Ba−gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,而WT成纤维细胞的特征是明显更多的α-SMAgydF4y2Ba+gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba),这表明Erdr1可能抑制成纤维细胞分化。接下来,WT肺成纤维细胞与模拟或第一传导gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒TGF-β1刺激紧随其后。rt - pcr证实了6倍增长gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba表达Erdr1-transduced比mock-transduced成纤维细胞(成纤维细胞gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)。正如所料,mock-transduced成纤维细胞相比,gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba转导成纤维细胞纤连蛋白的表达显著降低,胶原蛋白过程中我和α-SMA TGF-β1刺激(gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)。重要的是,抑制gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba在核gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞(gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba后)恢复能力分化成myofibroblast TGF-β1刺激(gydF4y2Ba图7 egydF4y2Ba)。为了进一步证实了这些结果,我们比较TGF-β下游信号分子的表达和模拟之间gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒转导成纤维细胞。TGF-β1刺激之前,这两种类型的viral-transduced肺成纤维细胞只显示低水平的p-Smad2 p-Smad3,虽然转导gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒几乎完全废除TGF-β1-induced Smad2和Smad3磷酸化(gydF4y2Ba图7 fgydF4y2Ba)。重要的是,廉价的gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba由核几乎完全废除的影响gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏抑制纤维母细胞的分化(gydF4y2Ba图7 ggydF4y2Ba)。值得注意的是,Erdr1依次减毒Mbd2表达,就是明证Mbd2表达越低gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒转导成纤维细胞(gydF4y2Ba补充图S10gydF4y2Ba)。总的来说,我们的数据支持,Erdr1充当强劲阻遏TGF-β-induced纤维母细胞分化。gydF4y2Ba
Erdr1能保护小鼠免受BLM-induced肺纤维化gydF4y2Ba
最后,我们试图建立异位Erdr1表达式是否会保护小鼠免受BLM-induced肺纤维化。我们首先确认转导gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒(1×10gydF4y2Ba7gydF4y2BaIFU)气管内的注入导致了单层褶皱超表达的gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba在肺(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。WT下受到诱导小鼠肺纤维化的BLM注入,和模拟gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒是气管内的传递进入肺部后第十天BLM归纳。的确,转导gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba病毒显著缓解BLM-induced肺纤维化)所示,马森的三色的染色(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba(左)和纤维化评分(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba,对吧)。一致地,gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba慢病毒转导老鼠表现出更低水平的肺中羟脯氨酸(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)加上纤连蛋白的表达显著减少,胶原蛋白我和α-SMA (gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)。在一起,我们的数据表明,异位Erdr1表达显著逆转肺纤维化。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
IPF进步和致命的肺间质纤维化,缺乏有效的治疗方法在临床设置(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。我们进行了研究病人和动物解剖MBD2的影响,读者对DNA methylome-encoded信息,在肺纤维化的发展。我们说明IPF患者和老鼠BLM-induced后出现了肺纤维化MBD2表达和DNA甲基化改变。特别是,MBD2在myofibroblasts在肺纤维化过程中流程。因此,损失gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba在成纤维细胞或myofibroblasts提供保护对BLM注射后的肺纤维化小鼠myofibroblast削弱纤维母细胞的分化。机械的研究特征TβRI / Smad3 / Mbd2 / Erdr1监管的积极反馈循环。具体来说,TGF-β诱发Mbd2过度TβRI / Smad3-dependent方式,和Mbd2选择性地结合的区域gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba包含hypermethylated CpG的启动子dna抑制其表达,通过Mbd2增强TGF-β/ Smads信号向myofibroblast促进纤维母细胞分化。两极分化myofibroblast然后分泌大量的纤丝的ECM蛋白质导致矩阵刚度和病态矩阵沉积在肺间质,诱发肺纤维化的发展(gydF4y2Ba图8 egydF4y2Ba)。这些结果不仅提供了新颖的见解的理解DNA甲基化基础肺纤维化的作用,但也证明证据表明针对Mbd2或Erdr1可能是一个可行的方法来抑制成纤维细胞转变。gydF4y2Ba
虽然大量的努力最近致力于解剖patho-aetiology潜在的肺纤维化,准确的分子机制仍然知之甚少。缺乏相关信息大大阻碍了小说的发展与这种毁灭性疾病有效的治疗方法,这使得IPF患者的5年生存率小于30%后诊断。有人指出发生甲基化的基因内CpG岛纤维化密切相关,包括肺纤维化(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),肝纤维化(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),肾纤维化(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba心脏纤维化(),gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)和皮肤纤维化(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。在此,我们证明了肺起源于IPF患者和老鼠出现肺纤维化显示DNA甲基化改变加上MBD2超表达。这些观察结果与之前的研究相一致,DNA甲基化的改变配置文件被标注在IPF患者的肺gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。此外,DNA methylation-related蛋白质的水平,如DNA甲基转移酶1 (Dnmt1) Dnmt3a, Dnmt3b, MeCP2和Mbd2高度升高大鼠的肺肺尘埃沉着病模型,并由5-aza-dC抑制DNA甲基化,Dnmt抑制剂,显著减弱肺纤维化gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。在一起,这些数据支持DNA甲基化与肺纤维化的发病机制,但潜在的机制尚未完全解决。gydF4y2Ba
最令人兴奋的发现在这个报告是TGF-β1诱发肺成纤维细胞进行全球DNA甲基化以及Mbd2超表达。诱导Mbd2然后选择性地结合到甲基化CpG DNA中gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba子而不影响内的甲基化水平gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba表达启动子,Mbd2压制Erdr1 myofibroblast促进纤维母细胞的分化,从而诱发IPF的发展。有趣的是,Mbd2似乎并没有产生重大影响成纤维细胞迁移、增殖或凋亡。似乎矛盾的全球的DNA hypomethylation和甲基化gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子在肺纤维化的设置。事实上,监管机制DNA甲基化在肺纤维化的进展非常复杂。好看的,DNA甲基化对肺纤维化的影响依赖于基因的hypomethylation赞成纤维化以及关键基因的甲基化与纤维化关键类型的细胞(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba巨噬细胞和成纤维细胞),而不是全球hypomethylation或甲基化dna来自肺细胞gydF4y2Ba。gydF4y2Ba例如,Thy-1纤维化抑制基因,已经说明是由DNA甲基化。具体来说,纤维母细胞gydF4y2BaThy-1gydF4y2Ba启动子区域发生DNA甲基化纤维的刺激因素,阻碍Thy-1表达,导致持续分化成纤维细胞的肺纤维化过程中(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
关键问题是策略来解剖相关的通路Mbd2调节成纤维细胞分化。先前的研究提出令人信服的证据表明TGF-β/ Smads纤维化疾病的信号是一个常见的特性和已被证明导致纤维母细胞的过渡gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。这些观察结果促使我们关注规范化TGF-β信号在我们的案例中。的确,我们发现Mbd2过度纤维化状态依赖于规范化TGF-β信号和特征TβRI Smad3作为重要的介质。此外,损失Mbd2明显抑制TGF-β1诱导Smad2 Smad3磷酸化和显示的p-Smad2和p-Smad3含量明显降低gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞相比WT成纤维细胞。总的来说,这些数据提供了证据支持,Mbd2规范化TGF-β信号增强,从而导致肺纤维化持续的成纤维细胞分化。gydF4y2Ba
最后一个重要的问题是如何Mbd2促进TGF-β/ Smads信号。RNA-seq当时用来解决底层机制。Erdr1与压力相关的生存因素,已经发现的抑制减弱风湿性关节炎滑膜成纤维细胞迁移(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),他被认为是增加了6.5倍gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞相比WT成纤维细胞。有趣的是,在生理条件下,gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子是hypomethylated。相比之下,在TGF-β1刺激,gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba在成纤维细胞启动子进行了DNA甲基化,稳定和Mbd2选择性地绑定到DNA甲基化CpG,它抑制Erdr1表达式。鉴于Mbd2本身并不影响DNA甲基化的效果,而通过解释DNA甲基化对基因表达的抑制(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),因此,gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba缺乏呈现无法破译的信息编码的DNA甲基化的变化gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子TGF-β1刺激后,虽然DNA甲基化的改变确实是诱导。我们进一步采用得失的功能研究和证实Erdr1作为负调节抑制成纤维细胞分化通过抑制TGF-β/ Smads信号。根据这些结果,气管内的管理gydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba明显慢病毒减毒BLM-induced肺纤维化。由于异位Erdr1表达式是管理在“纤维”阶段的模型,更适用,反光IPF患者的临床管理。gydF4y2Ba
我们的研究有一些局限性。作为人类ERDR1没有商业抗体可以获得目前,我们没有检测蛋白质的ERDR1 IPF患者和对照组的肺,尽管通过rt - pcr分析,我们得到了一致的结果。虽然我们证明Mbd2调节了TGF-β1 TβR1 / Smad3-dependent方式,但具体机制尚未完全阐明。此外,在当前的研究中我们没有解决如何Erdr1作为一个高度保守的自分泌因子压制TGF-β/ Smads信号,这将是一个主要关注我们的后续研究。gydF4y2Ba
总之,我们已经表明,肺起源于IPF患者和小鼠肺纤维化发病的特点是改变了DNA甲基化以及MBD2超表达。因此,损失gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba在成纤维细胞或myofibroblasts可以保护小鼠免受BLM-induced肺纤维化。从力学上看,我们已经确定了一个积极的反馈监管TβRI之间循环,Smad3, Mbd2 Erdr1。具体来说,激活TβRI / Smad3信号诱发Mbd2过度,和Mbd2反过来又进一步增强了TGF-β/ Smads信号通过抑制Erdr1的表达。TGF-β1刺激后,成纤维细胞进行全球DNA甲基化以及Mbd2超表达。Erdr1作为负调节抑制纤维母细胞分化成myofibroblast,而CpG中的dnagydF4y2BaErdr1gydF4y2Ba启动子TGF-β1刺激后,高度甲基化的和Mbd2选择性地结合甲基化CpG dna镇压Erdr1表达式,Mbd2促进纤维母细胞的分化加剧肺纤维化。鉴于Mbd2本身不涉及DNA甲基化的变化,似乎是可有可无的生理条件下,我们的数据支持,战略旨在压制Mbd2或增加Erdr1可能是一个可行的治疗方法预防和治疗肺纤维化的临床设置。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
请注意:gydF4y2Ba补充材料并不是由编辑部,编辑和上传已由作者提供。gydF4y2Ba
补充表Sl。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - table_s1gydF4y2Ba
补充表S2。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - table_s2gydF4y2Ba
补充图S1。代表结果coimmunostaining MBD2 pro-SPC,标记的AECII肺部分患者对照组和IPF患者(a) (b)和BLM-induced肺部分。细胞核被DAPI染色蓝,原始和图像被放大×400。c)代表结果TUNEL检测肺部分源于BLM-induced WTgydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠。核与DAPI染色(蓝色)和图像捕获×200放大。d)免疫印迹分析肺起源于WT,伯灵顿的表情gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠在BLM诱导。pro-SPC: Prosurfactant蛋白c四到五老鼠包含在每个学习小组。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s1gydF4y2Ba
补充图S2。代表结果coimmunostaining MBD2和PDGFR -ɑ肺部分患者对照组和IPF患者(a) (b)和BLM-induced肺部分。细胞核被DAPI染色蓝,原始和图像被放大×400。总共8 IPF患者和6个对照组进行分析。四只老鼠被包含在每个学习小组。数据被表示为均值±SD。*:p < 0.05;* *:p < 0.01。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s2gydF4y2Ba
补充图S3。rt - pcr分析gydF4y2BaMBD2gydF4y2Ba表达后gydF4y2BaMBD2gydF4y2BasiRNA-2 transinfected。rt - pcr分析FN1的表达,COL1A1 ACTA2 IPF患者(b)和控制主体(c)肺成纤维细胞。数据被表示为三个独立实验的均值±SEM。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s3gydF4y2Ba
补充图S4。一)Transwell WT和化验分析gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞迁移。b) EdU WT和染色分析gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba纤维母细胞增殖。细胞核被DAPI染色蓝色,图片放大×200下。c)膜联蛋白V / PI染色WT和分析gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba成纤维细胞凋亡。数据被表示为三个独立实验的均值±SEM。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s4gydF4y2Ba
补充图S5。基因分型的结果gydF4y2BaColl1ɑ2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba等位基因(a和b)基因分型的结果gydF4y2BaActa2gydF4y2BacregydF4y2BaERT2 +gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba液氧/液氧gydF4y2Ba等位基因(c和d)。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s5gydF4y2Ba
补充图S6。)组织学分析小鼠肺纤维化的严重性后BLM归纳。左面板,代表图像)(上)和马森染色(底部)。右面板:条形图显示了纤维化的严重程度的量化平均评分。b)量化WT和羟脯氨酸含量的差异gydF4y2BaMbd2gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠在BLM的挑战。胶原蛋白c水平的纤连蛋白免疫印迹分析,我和ɑsma。左面板:代表免疫印迹结果。右面板:条形图显示了意味着在每组数据从所有老鼠分析。五到六老鼠包含在每个学习小组。BLM,博来霉素;心房纤颤,纤连蛋白;上校我,胶原蛋白我;ɑsma, alpha-smooth肌肉肌动蛋白。五到六老鼠包含在每个学习小组。 *: p<0.05; **: p<0.01.erj - 03697 - 2020. - figure_s6gydF4y2Ba
补充图S7。一)的时间进程分析水平的Erk1/2, p-Erk1/2,物,p-Jnk, P38和p-P38 TGF-β1后成纤维细胞治疗。b)时间进程免疫印迹分析P85 p-P85, Akt, p-AKT, mTOR p-mTOR TGF-β1刺激后成纤维细胞表达。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s7gydF4y2Ba
补充图S8。结果rt - pcr分析gydF4y2BaERDR1gydF4y2Ba表达IPF患者和对照组的肺组织。*:p < 0.05。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s8gydF4y2Ba
补充图S9。全球的成纤维细胞DNA甲基化率IPF患者和对照组的肺。*:p < 0.05。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s9gydF4y2Ba
补充图S10。结果时间进程Mbd2表达的免疫印迹分析TGF-β1-induced WT模拟或Erdr1慢病毒转导后成纤维细胞。左面板:代表免疫印迹结果。右面板:条形图显示了三个复制结果。* * *:p < 0.001。gydF4y2Baerj - 03697 - 2020. - figure_s10gydF4y2Ba
可共享的PDFgydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢艾德里安鸟(威康信托中心的细胞生物学,爱丁堡大学,爱丁堡,英国)提供传统Mbd2基因敲除小鼠。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这篇文章一篇社论评论:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1183/13993003.01536 - 2022gydF4y2Ba
作者的贡献:咦,Lei,邓黄Guo-Rao Wu清周,Fa-Xi Wang Long-Min范陈和太阳进行实验;Yongjian徐,建平赵挥拦张提供人类肺组织和临床数据;Yongman Lv, Weikuan顾、Jungang谢,范,张蜀,麒麟Yu Ping,威宁熊和Cong-Yi王设计实验,分析数据,并支持手稿的准备;Cong-Yi王领导调查和写的手稿。gydF4y2Ba
利益冲突:作者声明没有经济利益的竞争。gydF4y2Ba
支持声明:本研究得到了国家自然科学基金(82130023,82130023,81920108009,81770823,81873656,81800068),科学技术部(2016 yfc1305002和2017 yfc1309603), NHC药物发现项目(2017 zx09304022-07),湖北省健康中心(3202415),湖北省科学技术部门(2020 dcd014),同济医院(HUST)优秀青年科学家(2020 yq03),基础和转化研究的创新资金从同济医院。资金信息,本文已沉积的gydF4y2BaCrossref资助者注册表gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2020年10月1日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2021年12月9日。gydF4y2Ba
- 版权©2022年作者。gydF4y2Ba
这个版本分布在创作共用署名非商业性许可证的条款4.0。商业生殖权利和权限接触gydF4y2Ba权限在}{ersnet.orggydF4y2Ba
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