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Wnt5a/Wnt11可作为SARS-CoV-2患者潜在的ARDS生物标志物https://bit.ly/3lxEGRA
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由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染引起的2019冠状病毒病在全球蔓延,导致宣布大流行紧急状态[1].COVID-19患者有肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症等多种感染症状。一些已知的抗病毒药物,包括瑞德西韦,被认为是治疗SARS-CoV-2感染的有效药物[2,3.].随着潜在疗法的发展,迫切需要减轻SARS-CoV-2的传播和经济危机通过识别生物标志物,可快速指示受感染患者的疾病严重程度。Wnt配体是分泌的糖蛋白,其下游信号在胚胎发育和组织稳态中起着关键作用。随着免疫学领域的显著进展,Wnt信号作为各种炎症疾病的关键调控因子受到了广泛关注。大量证据表明,Wnt配体是由免疫细胞分泌的,如外周血单核细胞(PBMCs)和非免疫细胞,包括基质细胞,调节炎症反应和免疫细胞调节[4- - - - - -7].除了它们在炎症中的作用,研究报告称这些Wnt配体在组织损伤和修复中也发挥着关键作用[6].有趣的是,通过分析严重败血症或败血鼠小鼠模型的患者血清,先前的研究报告了与其他WNT配体相比的WNT5A和WNT11表达的显着改变[4,8].已知Wnt5a信号在脓毒症或ARDS中激活,并在肺部炎症和纤维化中发挥关键作用[5,9而Wnt11蛋白已被报道通过调节NF-κB活性来抑制炎症细胞因子的诱导[10,11].先前的研究表明,Wnt5a和Wnt11在炎症反应中具有相反的功能[12,13];因此认为Wnt5a具有促炎作用,Wnt11可能具有抗炎作用。因此,我们以Wnt5a和Wnt11为重点,探讨其与covid -19相关疾病的潜在相关性。在本研究中,我们报道了Wnt5a和Wnt11作为监测SARS-CoV-2患者病理进展的可靠生物标志物。
当这些患者在大邱公共卫生中心被诊断为SARS-CoV-2感染时,在Yeungnam大学医学中心(大邱,大韩民国)从入院的SARS-CoV-2患者中采集了全血。入院时,所有患者均未服用任何药物或使用任何机械设备。该研究方案(YUH 2020-03-057, 2020-05-031-001)已获得Yeungnam大学医院机构审查委员会的批准。
根据制造商的说明书,使用市售的ELISA试剂盒定量SARS-CoV-2患者血浆中Wnt5a、Wnt11或细胞因子的浓度。人重组WNT11蛋白(H00007481-P01;Abnova,亚琛,德国),抗wnt5a抗体(MAB645;R&D Systems, Minneapolis, MN, USA),抗wnt11抗体(ab31962;人蛋白Wnt-5a ELISA Kit (MBS2886311;MyBioSource, San Diego, CA, USA), and Human Protein Wnt-11 ELISA Kit (MBS281148;MyBioSource)。
肝素化的血液样品在4 h内新鲜使用,并使用Ficoll-paque从血液中分离PBMCsTMPLUS (17-1440-02, GE Healthcare,乌普萨拉,瑞典)或NycoPrep (PROGEN Biotechnik,奥斯陆,挪威)。随后,得到了更精细的pbmc通过MACSprepTM人PBMC分离试剂盒(130-115-169,Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)。为验证Wnt5a中和抗体或重组人Wnt11对细胞因子分泌和NF-κB活化的抑制作用,将SARS-CoV-2患者外周血单核细胞与Wnt5a抗体(20 μg·mL)孵卵−1)或重组人Wnt11 (10 ng·mL−1)浸泡6 h。上清用于细胞因子ELISA分析,裂解液用于NF-κB家族转录因子检测试剂盒(43 296;Active Motif公司,美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。所有实验均独立进行至少3次。统计学差异采用非配对t检验确定。Prism软件(GraphPad, La Jolla, CA, USA)用于统计分析。
为了建立可靠的诊断生物标志物,我们对Yeungnam大学医学中心收治的SARS-CoV-2重症患者的临床表现和各种危险因素进行了前期研究[14,15].我们进行了研究,根据患者的年龄、体重指数和合并症(图1一个).SARS-CoV-2患者血浆样本按病情严重程度分为:正常(对照组,检测SARS-CoV-2感染,阴性);SARS-CoV-2病人;SARS-CoV-2合并ARDS患者;以及因SARS-CoV-2感染住院后出院的个人。ELISA分析显示,SARS-CoV2感染组与对照组的Wnt5a分泌水平存在边际差异。SARS-CoV-2急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血液中Wnt5a蛋白水平分别显著升高(图1 b(我))。有趣的是,Wnt5a蛋白质水平被拯救在出院的个体(图1 b(我))。这在存活的患者中是一致的,血浆中Wnt5a水平仍然很低,但在死亡的患者中仍观察到明显的高水平Wnt5a,从而证明了Wnt5水平与疾病的严重程度的相关性(图1 b(2))。相比之下,SARS-CoV2患者和出院患者血浆中Wnt11蛋白水平显著升高,但在SARS-CoV-2急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血浆中Wnt11蛋白水平仍处于正常水平,其中Wnt5a水平最高(图1 b(iii)和(iv))。
为了评估SARS-COV-2的WNT5A和WNT11表达的调节,从SARS-COV-2,SARS-COV-2 ARDS和排放患者中分离PBMC。基于使用实时定量PCR的转录分析,观察到每个等离子体样品中的分泌与差异相关WNT5a和Wnt11外周血单核细胞mRNA表达水平(图1 b(v)和(vi))。SARS-CoV-2型ARDS患者Wnt5水平显著升高,Wnt11水平显著降低。出院患者的Wnt5水平有相似的恢复,而Wnt11水平较高(图1 b(v)和(vi))。这些结果提示,Wnt5a水平升高与SARS-CoV-2 ARDS患者病情严重程度相关,而Wnt11水平低与抑制和缓解炎性细胞因子诱导的SARS-CoV-2能力不足相关。为了进一步证实我们的研究结果并扩大其临床意义,我们对正常、SARS-CoV-2、SARS-CoV-2 ARDS和出院患者分离的PBMCs进行了培养并进行了免疫细胞化学分析。SARS-CoV-2型急性呼吸综合征(ARDS)患者外周血单核细胞经特异性抗体免疫染色,Wnt5a高表达,而Wnt11表达较少(图1 c(我))。的确,从SARS-CoV-2急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中分离出来的PBMCs显示Wnt5a蛋白分泌高于其他组(图1 c(2))。相反,SARS-CoV-2 ARDS分离的PBMCs中Wnt11蛋白的分泌水平保持在最低水平,出院个体分离的PBMCs中Wnt11蛋白的分泌显著增加(图1 c(3))。进一步研究Wnt5a和Wnt11对小鼠抗炎反应的影响。患者外周血单核细胞用抗wnt5a中和抗体或重组(r)Wnt11治疗。NF-κB活化分析表明,抗wnt5a抗体治疗并不能显著降低SARS-CoV-2 ARDS (图1 d(我))。此外,各种细胞因子的分泌,包括白细胞介素(IL)-6、IL-1β、IL-4、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在抗wnt5a抗体治疗后没有明显改变(图1 d(ii-vii))。然而,rWnt11治疗SARS-CoV-2 ARDS PBMCs显示出显著的抑制NF-κB活化和细胞因子产生的作用(图1 d(ii-vii))。这些结果提示Wnt11蛋白在减轻SARS-CoV-2感染引起的炎症反应方面有很大的疗效,但Wnt5a不太可能成为潜在的治疗靶点。此前,转化生长因子(TGF)-β可上调Wnt5a的表达,从而诱导肺纤维化[9,最近的一项研究报告了COVID-19患者血清中TGF-β显著增加[16].因此,严重COVID-19患者血清中Wnt5a的升高可能是由于tgf介导的肺损伤的进展,因此抑制Wnt5a可能不能有效地从炎症反应中恢复。
总之,我们在韩国开展了一项单中心观察研究,以确定可用于监测SARS-CoV-2患者病情进展和严重程度的生物标志物。通过分析不同病理严重程度患者的血浆和PBMCs,我们发现Wnt5a和Wnt11在SARS-CoV-2 ARDS患者中表现出相反的表达模式。基于我们的结果,测量SARS-CoV-2 ARDS患者的Wnt5a水平可能是预后不良的良好指标,而Wnt11水平可能是疾病生存能力的良好指标。考虑到Wnt11有效抑制炎症反应和细胞因子的产生,而不是Wnt5a,它可以作为治疗SARS-CoV-2 ARDS患者的治疗靶点。
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我们感谢参与这项研究的患者。
脚注
作者贡献:蔡e.y., H.H. Park, W. Kim, j . s。裴和w·李设计并指导了这项研究。H. Kim, H. n . Kim和W. Lee进行了ELISA, Western blot,免疫细胞化学和细胞因子分析。蔡奕仪采集了患者的血液样本。崔E.Y. j s。裴俊浩、I. Kim、S. Jeon和W. Lee负责数据分析。H.H. Park, W. Kim和W. Lee写了手稿。所有作者都审阅了手稿并同意对作者的贡献进行描述。
利益冲突:蔡奕悦没有什么可透露的。
利益冲突:H.H. Park没有披露任何信息。
利益冲突:H. Kim没有什么可透露的。
利益冲突:金正恩没有什么可透露的。
利益冲突:I.金没有什么可透露的。
利益冲突:S. jeon没有披露。
利益冲突:w·金没有什么可透露的。
利益冲突:j。裴俊浩没有透露任何信息。
利益冲突:w·李没有什么可透露的。
支持声明:本研究由教育部韩国国家研究基金资助(no . NRF- 2018r1d1a1b07050422和no . NRF- 2018r1c1b600274913)。韩国国家科研基金资助项目(no . NRF) (no . MSIT) (no . NRF- 2020r1a2c1004131)该研究由韩国卫生产业发展研究所(KHIDI)的韩国卫生技术研发项目资助,该项目由韩国卫生与福利部资助(赠款号:HI15C0001)。本文的资金信息已存入Crossref资助者注册表.
- 收到了2020年5月2日。
- 接受2020年8月21日。
- 版权©2020人队
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