瑞德西韦和氯喹可在体外有效抑制新冠病毒(2019-nCoV)

2019年12月，拥有1100万人口的中国中部城市武汉出现了一种由未知病原体引起的新型肺炎。最初的病例与武汉一个海鲜市场的接触有关。¹截至2020年1月27日，中国内地报告确诊病例2835例，死亡81例。新增香港、澳门、台湾地区确诊病例19例，泰国、日本、韩国、美国、越南、新加坡、尼泊尔、法国、澳大利亚、加拿大等地输入病例39例。病原体很快被确认为新型冠状病毒(2019-nCoV)，与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)密切相关。²目前，对新病毒没有具体治疗。因此，迫切需要鉴定有效的抗病毒剂是为了打击这种疾病。

有效的药物发现方法是测试现有的抗病毒药物是否有效治疗相关病毒感染。2019年 - Ncov属于Betacoronavirus.其中还包括SARS-CoV和中东呼吸综合征CoV。一些药物，如利巴韦林、干扰素、洛匹那韦-利托那韦、皮质类固醇，已用于SARS或中东呼吸综合征患者，尽管一些药物的疗效仍存在争议。^3.在本研究中，我们评估了fad批准的5种药物，包括利巴韦林、喷昔洛韦、硝唑沙尼德、纳莫司他、氯喹和两种著名的广谱抗病毒药物瑞德西韦(GS-5734)和法韦匹拉韦(T-705)对一种新型冠状病毒临床分离株的体外抗病毒效果。

采用标准检测方法测定这些化合物对2019- ncov的细胞毒性、病毒产量和感染率的影响。首先，采用CCK8法测定候选化合物在Vero E6细胞(ATCC-1586)中的细胞毒性。然后用nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019感染Vero E6细胞²在不同浓度的试验药物存在下，多重感染(MOI)为0.05。对照组使用DMSO。通过实时定量RT-PCR (qRT-PCR)对细胞上清中病毒拷贝数进行定量评价，并通过免疫荧光显微镜观察病毒核蛋白(NP)表达，确认感染后48小时(p.i)的疗效(感染时的细胞病变效应不明显)。在七种试验药物中，三种核苷类似物的高浓度包括利巴韦林(半最大有效浓度(EC_50.= 109.50 μM，半细胞毒浓度(CC_50.> 400 μM，选择性指数(SI) > 3.65_50.= 95.96 μm, cc_50.> 400 μM, SI > 4.17)和favipiravir (EC_50.= 61.88 μm, cc_50.> 400 μM, SI > 6.46)可以减少病毒感染(图。1A和补充信息。S1)．然而，favipiravir已被证明在保护小鼠抵抗埃博拉病毒挑战方面100%有效，尽管其EC_50.在Vero E6细胞中的值高达67 μM，^4.建议在体内研究进一步建议评估这种抗病毒核苷。Nafamostat，一种预防膜融合的MERS-COV的有效抑制剂对2019年 - NCOV感染（EC_50.= 22.50 μm, cc_50.> 100 μm, si > 4.44)。Nitazoxanide是一种商业化的抗原虫药物，具有对包括人类和动物冠状病毒在内的多种病毒的抗病毒潜力，在低微摩尔浓度(EC)下抑制2019-nCoV_50.= 2.12μM;CC_50.> 35.53μM;如果> 16.76)。建议进一步对该药物抗2019-nCoV感染的体内评价。值得注意的是，两种化合物瑞德西韦(EC_50.= 0.77μM;CC_50.> 100μM;SI > 129.87_50.= 1.13μM;CC_50. > 100 μM, SI > 88.50) potently blocked virus infection at low-micromolar concentration and showed high SI (Fig.1 a, b)．

Remdesivir最近被认为是针对各种RNA病毒的有希望的抗病毒药物（包括SARS / MERS-COV^5.)感染培养细胞、小鼠和非人灵长类动物(NHP)模型。它目前正在临床开发中，用于治疗埃博拉病毒感染。^6.瑞德西韦是一种腺苷类似物，它与新生病毒RNA链结合，导致过早终止。^7.我们的添加时间试验显示瑞德西韦在病毒进入后的一个阶段起作用(图)。1 c, d)，这与它作为核苷酸类似物的抗病毒机制是一致的。Warren等人的研究表明，在NHP模型中，静脉注射10 mg/kg剂量的瑞德西韦可导致血液中伴随的活性形式(10 μM)持续水平，并对埃博拉病毒感染具有100%的保护作用。^7.我们的数据显示EC₉₀瑞德西韦在Vero E6细胞中对2019-nCoV的作用值为1.76 μM，表明其在NHP中可能达到工作浓度。我们的初步数据(补充信息，图。S2)显示，瑞德西韦也能有效抑制对新型冠状病毒敏感的人细胞系(人肝癌Huh-7细胞)的病毒感染。²

氯喹，广泛使用的抗疟疾和自身免疫病毒药物最近被报告为潜在的广谱抗病毒药物。^8.那9.已知氯喹通过增加病毒/细胞融合所需的内体pH来阻断病毒感染，以及干扰SARS-COV的细胞受体的糖基化。^10.我们的加法时间测定表明，在VERO E6细胞中的2019-NCOV感染的氯喹和在2019-NCOV感染后阶段（图。1 c, d)．氯喹除了具有抗病毒活性外，还具有免疫调节活性，这可能会在体内协同增强其抗病毒作用。氯喹口服后广泛分布于全身，包括肺。欧共体₉₀氯喹在Vero E6细胞中对2019-nCoV的作用值为6.90 μM，在类风湿关节炎患者的血浆中，500 mg给药证明了这一点。^11.氯喹是一种廉价和安全的药物，已经使用了70多年，因此，它可能在临床上适用于2019-nCoV。

研究结果表明，瑞德西韦和氯喹在体外有效控制新型冠状病毒感染。由于这些化合物已经用于具有安全记录的人类患者，并显示对各种疾病有效，我们建议它们应该在患有新型冠状病毒疾病的人类患者中进行评估。

我们感谢武汉病毒学研究所的王希，吴艳，尚伟娟，张环宇，李玉峰，胡恒瑞，蒋夏明，孙源为这项研究提供的必要帮助。感谢国家病毒资源中心邓飞教授、武汉市病毒学研究所生物安全三级实验室杜涛、吴佳、唐昊教授的重要支持。感谢武汉病毒学研究所、武汉国家生物安全实验室王艳义教授等同事的出色配合。我们感谢巴兹尔·阿里夫博士对手稿的科学编辑。我们感谢匿名审稿人提出的宝贵建议。这部分工作是支持由国家科技重大专项“重大新药创新与发展”(由李教授的歌)(2018 zx09711003),中国国家自然科学基金(31621061)和2019 - ncov紧急科研项目从湖北省教授。史正丽、肖庚夫)。

作者指出

1. 这些作者贡献了：Manli Wang，Ruiyuan Cao，Leike Zhang，xinglou yang。

从属关系

1. 中国科学院武汉病毒学研究所中国科学院生物安全超大科学中心病毒学国家重点实验室，武汉430071

   Manli Wang，Leike Zhang，xinglou yang，jia liu，mingyue xu，zhengli shi，zhihong hu＆gengfu xiao

2. 国家应急药物工程技术研究中心，北京药理学与毒理学研究所，北京100850

   曹瑞元，钟武

贡献

国兴、文正、中华健、孟伟、荣昌、林志正等人构思和设计了实验。徐勇、金磊、孟晓霞、孟伟、r.c.、李振等人参与多项实验;Z.H G.X林文泽。,z,分子量,阻容,L.Z.分析数据。m.w.、l.z.、r.c.和zh.撰写了手稿。国学、文正、正华对手稿作了最终批复。

相应的作者

对应到Zhihong胡或吴钟或Gengfu萧。

利益争夺

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

188滚球软件本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到Creative Commons许可,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料包括在本文的知识共享许可协议中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果材料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或者超过了允许的用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。要查看此许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

再版和权限