文摘
小说研究呼吸道微生物提供关键见解呼吸道疾病发病机理可能改善临床管理,我们应该努力标准化研究设计,实验室程序和统计方法http://ow.ly/qNF330mWrEK
在过去的十年中,研究人员已经开始解开呼吸道微生物群内的变异的原因和后果,更深刻的理解在肺部疾病的发病机制的作用来改善临床管理。发展文化无关的识别细菌物种提供了更快、更具有成本效益的方法来描述niche-specific微生物生态系统。从历史上看,肠道是利基人类微生物组研究的焦点,但最近的研究揭示了一个意想不到的细菌多样性的上半部分和下半部分都航空公司,连接社区组成许多呼吸道疾病,包括囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性感染(1]。监测时间变化社区呼吸道微生物群的组成可以揭示了主机和环境因素对生态系统的影响行为,以及感染易感性或严重的后果,和治疗效果。这里我们概述当前的最佳实践和即将到来的呼吸道微生物研究进展和潜在的临床应用。
研究设计
在呼吸道微生物的研究设计,到目前为止,我们已经了解到,至关重要的元素生成有效,有用的结果包括明确研究问题、功率计算,招生的足够数量的对象和控制,健壮的抽样和详尽的患者信息收集。虽然这适用于任何精心设计的以人群为基础或临床研究,我们还需要仔细考虑可能的混杂的影响广泛的环境和主机特点在微生物组成1,2]。第一先锋链改变微生物群落结构和组成的横断面研究疾病状态(3,4),但纵向采样需要完全理解的原因和长期的临床结果呼吸道细菌的差异。例如,最近的特征明显健康的出生人数显示鼻咽微生物群的动态发展与生活方式的因素5,6],显示标记微生物群落组成的变化与急性呼吸道感染(7,8]。强化后续CF (9,10)和慢性阻塞性肺病(11)患者出现症状之前证明呼吸道微生物组成的变化,表明生态失调耦合特异表达宿主的免疫反应可能是疾病进展的基础(12]。支持呼吸道微生物的潜在作用在幼儿早期疾病发病机理是显而易见的,用更少的共生的微生物群落和更多潜在的病原体与连续喘息和哮喘(8]。迄今为止,每一个研究呼吸道微生物群与任何肺病显示明显的畸变的微生物群落组成健康状态,重新定义普遍接受病理生理学概念在呼吸道疾病发病机理12]。
样品收集
对解剖学和站点的抽样,呼吸道是没有一个统一的系统,但由相互关联的领域窝藏截然不同的微生物群落,高度依赖于局部微环境条件。因此,当设计一个新的微生物研究中,适当的抽样利基将很大程度上取决于研究问题,假设和目标人群。关键程序实用性也需要考虑;例如,抽样下呼吸道(轻轨)需要侵入性支气管镜的程序,限制样本大小,研究年龄组,重复抽样的频率。为了克服这种缺乏肺,许多研究使用方便的上呼吸道(轨道交通),这被认为是可能的源码社区肺部以及水库对大多数呼吸道病原体(12,13]。在健康成年人,微生物定殖的轻铁被认为起源于micro-aspiration口咽的“植物”,因此,可以使用口咽的,尽管不完美,肺的代理。然而,在儿童鼻咽和口咽是微生物的可能来源、播种到轻轨可能造成解剖差异,鼻呼吸,鼻腔分泌物和更高的生产的儿童(14,15),进一步限制结果外推。在慢性肺部疾病,如CF和慢性阻塞性肺病,城市轨道交通和轻轨交通社区似乎成为隔离与增加疾病持续时间。这可能是由于慢性炎症,肺间隙机制和重复抗菌治疗的失败导致局部的选择和演化的独立社区,后者呈现全面抽样从多个站点强制获得有意义的结果16,17]。
样品处理
需要考虑的一个重要方面在呼吸道微生物研究的设计和执行和控制污染的风险。呼吸道细菌港口低密度社区,一路上微生物密度下降从轨道交通轻轨交通(14,18]。因此,DNA在样本收集和处理过程中引入环境成为一个可能的威胁,可以完全否决真正的微生物信号(18]。特别是,抽样轻轨交通风险高的微生物延滞的城市轨道交通,所以精确的取样应由训练有素的和一致的人员减少污染的风险。在运输期间,样品应该保持在适当的存储介质冷却,然后加工和储存在−尽快80°C,以防止细菌产物选择性。此外,从实验室环境污染和试剂用于样本处理可以显著影响结果从low-biomass微生物群落19]。实施适当的“负面”对所有取样控制,存储和实验室程序允许后比较和识别潜在的混杂的环境信号(更多细节见20.])。方法和批次的变化也会影响结果,强调清洁工作的重要性在DNA提取和使用完全优化方法为特定的样本类型。除了污染,提取方法也会影响数据的质量和护理应采取使用方法不偏见的细菌从样本中提取(18]。包括“正面”控制的形式模拟社区,将允许足够的控制和比较序列运行时,实验室和研究所(13]。
测序平台
的测序平台,扩增子序列是目前最常用的方法,确定微生物群落组成和目标细菌16 s rRNA核糖体RNA基因,包含高度保守的变异度高的地区。这种有针对性的方法揭示了丰富的社区组成和动态信息。然而,所提供的分类解析16 s rRNA测序是有限的由于目标区域长度短,复杂精确的物种——strain-level识别。相比之下,宏基因组测序捕获整个微生物基因组的内容,包括细菌、病毒和真核生物,和允许微生物描述在最深的分类水平以及功能潜力分析。然而,将这种技术应用于low-biomass呼吸道样本是具有挑战性的,因为基因组组装需要大量的测序读每个样本,这使得检测观察物种的困难,会增加污染的风险21]。
数据处理
一旦生成数据,所需的生物信息学和统计学方法分析所产生的大量原始DNA读取测序可以令人生畏。最初,原始读取过滤去除测序错误并组装成完整的序列,然后基于相似性的序列分组和分类名称分配给透露他们的身份。一些生物信息学管道免费进行数据预处理,包括Qiime [22]和mothur [23]。每个生成的微生物概要显示个别物种的丰度相对于整个细菌群体在一个样本,并且包含许多零丰度,要求非参数统计方法开发专门为处理微生物数据(24]。描述微生物的发展随着时间的推移,需要多个测量同一个人,更为复杂的数据分析,但几种方法已经提出了反复纠正措施(25,26]。增加应用程序的机器学习技术进行预测建模的临床结果微生物资料结合宿主和环境特点是一种很有前途的发展27]。然而,颞微生物动力学的研究,尤其是虽然占的混杂因素,仍在起步阶段24]。
临床应用
100年的时代000人基因工程和NHS基因组医学的发射服务,测序技术不仅更容易,而且也越来越不可或缺的临床环境。在诊所,识别文化仍然主导病原体检测,虽然定量方法如qPCR越来越可用,测序技术的应用都很缺乏。成本效益和效率的样本和数据处理目前正在改进,使临床测序方法的实现。一次性测序应用程序正在开发中,更快的DNA提取方法和图书馆准备(28]。技术和科学进步的管道,以改善检测目标区域内的微妙的毒株特异性变化(24]。申请测序的保健、便携式、低成本、实时DNA测序仪牛津纳米孔的奴才(英国牛津纳米孔技术,牛津)真正潜在的能力迅速细菌16 s基因序列,甚至到毒株特异性决议(29日]。实时测序技术的出现将极大地影响通过准确的物种鉴定和量化诊断方法在临床相关的时间框架。
研究重点
走向临床应用、比较和荟萃分析必须组合来自不同群体的结果来定义可行的微生物丰度的阈值。当前方法论的异质性限制跨机构、可比性和通过强调重要的方面的研究设计,包括样本收集和处理一致,适当的污染控制和纵向采样(总结图1和箱1),我们希望鼓励达成共识固体,健壮的呼吸道微生物群研究方法。我们越来越了解呼吸道疾病发病机理将有助于重塑临床诊断,预防和治疗策略。重要的挑战依然存在微生物群中的进步研究融入日常医疗实践,和未来的努力应该优先考虑标准化协议和分析,适应技术的应用领域包括远程设置,和各国合作和学科(框2)。然而,目前进展呼吸道微生物群研究无疑提供了一个有前途的平台在未来文化无关技术的临床应用。
箱1呼吸道微生物研究要点
纵向研究设计
适当的功率计算
一致的抽样
适当的利基(代理)
减少污染阶段
污染控制阶段
健壮的质量检查
一致的生物处理
适当的分析技术(复杂的数据)
箱2研究未来的研究重点
国际交流平台
统一的采样和传输协议
标准化控制在实验室
协议处理复杂的数据
适应技术为远程设置
研究学科之间的合作
(诊所、微生物学、分子生物学、
生态,生物信息学)
投资(跨学科)培训
脚注
利益冲突:R.L.沃森没有披露。
利益冲突:E.M. de Koff没有披露。
利益冲突:d·博尔加特报告个人费用从弗里斯兰省Campina,赠款从纽迪希亚,从落实和赠款,在提交工作。
- 收到了2018年9月6日。
- 接受2018年的11月5日。
- 版权©2019人队