抽象
下一代测序方法有望成为未来结核病药物敏感性测试和流行病学调查以及其他高优先级细菌性病原体的标准http://ow.ly/kXsV30lLP78
下一代测序(NGS),使用大规模并行处理,以天诘病原体基因组技术正在革新临床微生物学实践[1]。全基因组测序(WGS)为基因分型、疾病暴发调查和确定涉及抗菌素耐药性的已知序列变异提供了前所未有的解决方案,对选定的基因组区域(靶向NGS)进行深度测序可以进一步阐明这一点。世界卫生组织(世卫组织)已建议采用基于wgs的方法对列入“优先清单”的致病菌进行监测[2]。目前,已经开展了对水培水培样品进行原理验证和验证研究大肠杆菌,肺炎克雷伯氏菌,金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,铜绿假单胞菌,沙门氏菌spp。鲍曼不动spp。淋球菌和艰难梭菌包括在这个名单中,除了在全球范围内建立的优先级组结核分枝spp。(包括结核分枝杆菌)3.]。
测序技术
多年来,临床微生物实验室一直依赖传统的表型和基因型方法进行物种识别、抗生素耐药性检测和研究导致医院或社区获得性感染的细菌的传播。这些都是有用的方法,但它们的周转时间长,需要特定的基础设施,而且在区分高度遗传相关的菌株方面具有较低的歧视性[4]。此外,技术限制意味着只能同时研究几个基因组位点[4]。桑格测序,在20世纪70年代开发的,使能所述第一基因和基因组的序列,但是当施加到延伸的基因组区域[在其应用仍然有限,由于复杂性和高的成本测序5]。测序输出与焦磷酸测序的出现在2000年代中期急剧增加,然后的NGS方法时,成本大幅下降[6]。通过测序反应的结束时,NGS平台产生独特的DNA片段,被称为“读出”,它可以是短的(在长度50-400个碱基对)或长(1-100千碱基)的序列。运行单个NGS可以生产数十亿序列读数[5]。所有技术的工作流程都是类似的:提取高分子量DNA;图书馆的准备工作(即。通过DNA片段化(酶或机械的),条形编码和PCR扩增的DNA片段)的集合;聚类(单个DNA片段的克隆扩增);和自动化的单或双末端(即。定序器读取测序的DNA片段的两端)[5]。在该领域的主要参与者,Illumina的公司(圣地亚哥,CA,USA)的合成使用测序(桥式PCR)化学和提供各种“台式”(MiniSeq和MiSeq)或高吞吐量(NextSeq 500,HiSeq 2500和Novaseq)解决方案允许以更低的成本更高的输出用于产生高品质的短读取。赛默飞世尔科技公司(沃尔瑟姆,MA,USA)“台式”(PGM和S5)和高通量(离子质子)平台基于合成测序半导体(乳剂PCR)化学,产生较低的吞吐量,但更长的读取和在较短的时间,相较于Illumina公司,从而得到很好的均聚物[适用于有针对性的解决方案,但具有较高的误码率5]。所谓第三代测序平台(RSII和Sequel(太平洋生物科学California Inc.的,门洛帕克,CA,USA)和马仔(牛津纳米孔技术有限公司,牛津,UK))的单分子实时乘虚而入化学产生长读取。这些借给自己新创装配,不需要参考基因组,以及较长重复区域的测序,短读无法跨越。然而,与产生较短读数的仪器相比,吞吐量和质量较低[4,5]。主要功能和可用于在微生物学领域使用不同的NGS技术的成本的详细描述报道最近的评论[3.- - - - - -5,7,8]。宽范围由NGS公司销售手段,用户可以根据使用目的(常规,流行病学和耐药性监测,研究),成本的考虑(人员,资金投入,基础设施,软件采用最有效的技术在微生物实验室/硬件),工作负载(设施,多平台的疾病,病例数)和本地可用性。
结核病排序的作用
抗药性结核病(TB)被认为是相关的耐药性全球发病率和死亡率的主要原因[9]。耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)形式正在阻碍结核病控制和临床管理,MDR-和XDR-结核的治疗成功率分别为54%和30%(相比之下,易感形式的成功率为83%)[9]。表型的测试是,尽管它的挑战,这是感受最敏锐地在资源有限的情况下药敏试验(DST)的标准。这些挑战包括生长速度缓慢结核分枝杆菌,所需的高等级生物安全基础设施方面,重复性差和周围所提出的临界浓度一定的不确定性对某些药物[10]。作为结核分枝杆菌电阻从基因组中的编码药物标靶的变化,如单核苷酸多态性(SNP),插入和缺失的基因出现或参与药物的代谢途径,或从外排泵上调,用于检测基因组的变化方法代表一个突破,为快速的耐药性结核病例简单的标准化管理[10]。世卫组织推荐了一些用于诊断耐多药结核病和广泛耐药结核病的基因型检测,包括可在外围结核病实验室实施的基于墨盒的核酸扩增试验和在线探针检测[11]。然而,这些工具只针对少数基因的“热点”区域来检测对有限数量药物的耐药性,并不总是报告预测表型耐药性所依据的确切的核苷酸变化。
需要所有功能于一身的解决方案,以指导临床个体化决策的最复杂性的情况下,至少在一个参考实验室水平。NGS是领先的候选技术在这方面[11]。整合载体的缺失和低突变率是造成这一问题的主要原因结核分枝杆菌基因组非常适合测序。在一个技术挑战是重复和难以序列区的高GC含量存在。这些更准确地需要足够的全基因组测序深度序列,其具有成本影响[10]。
多个研究已经使用WGS研究结核病耐药预测、传播动态和种群结构结核分枝杆菌复杂的(10,12,13]。在某些情况下,基因组测序已被用于监测疾病传播和人群耐药性的出现,以及对一线和二线药物的耐药性预测[14- - - - - -17]。进一步的工作正在就所涉及的表型耐药靶标的发现和抗性基因突变的大型验证[完成18];在分类19];异抗和混合感染的特征研究关于毒性和发病机理[20.]。可行性研究,以评估引入WGS到常规微生物实验室的诊断算法已经在低负担设置中进行[21- - - - - -23]。在这种情况下,迅速查明耐药结核病和传播事件有助于实现结核病消灭[24,25]。这样的可行性研究已经大量使用Illumina的技术,展示了WGS从文化融入日常工作流程诊断如何实现准确及时的报道,早于表型DST获得了好几天,在没有更大的成本。
正在进行的需要培养提出了挑战全面实施NGS作为一种有效的替代传统的方法(如。爱视宝MTB / RIF;Cepheid Inc., Sunnyvale, CA, USA),特别是在资源有限的环境中。因此,正在努力直接从临床标本制定WGS方案。这些程序包括差异裂解步骤、结核富集和DNA自动纯化[26,27]。这些方法目前仍昂贵且通过启动的材料低的挑战是结核分枝杆菌以及其他遗传物质(人类和口腔菌群)的污染。利用系统发育和耐药性相关区域的选择性扩增的靶向方法可能是直接测序的一个合适选择(图1)27]。
在国家和超国家参考实验室的支持下,在7个高流行国家开展了一项基于人群的监测研究,表明基因测序针对有效的突变[18]提供了一种强大的工具,用于确定/监测对一线和二线药物的耐药性趋势,以替代在这种资源有限的环境下表现欠佳的表型试验[17]。类似地,WGS现在被提议作为实时检测传播链的标准,并通过基于snp(更高分辨率)或核心基因组多位点序列分型(略低分辨率)的方法,以与传统分子方法相比的最高分辨率指导公共卫生干预[16]。
测序实施
实施结核病临床实验室NGS是复杂的,涉及战略规划,采购,预算编制,样本转诊制度,规范操作流程,保证质量,数据管理(存储,分析,解释和报告),人力资源(人员和培训)的考虑。按比例放大的测序实验室需要足够的基础设施:用于样品制备区域(从临床分离物中提取DNA /标本考虑相关的生物安全);一个分子生物学环境(预处理和后PCR,和空间的NGS仪器);电源;良好的环境条件(如。控制的温度,湿度,振动);网络和互联网连接;和计算能力。设备和所需的试剂是特定于平台的:它因此,有必要确保当地经销商和及时的技术支持的可用性。几个解决方案可用于基因组DNA的提取和纯化,包括可商购的(对)磁场和基于列的系统中,化学方法(如。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)/ NaCl的协议),以及针对所提取的DNA样品的数量/质量(荧光计,分光光度计的评估设备)[8]。文库准备和测序反应是按照NGS制造商提供的说明进行的。由于ng生成的数据量很大,需要具有生物信息学背景的工作人员处理用于存储的输出数据并运行分析管道。仍然需要对生物信息学产出进行大规模验证,国际财团正在大力推动测序后分析过程的标准化,以便可靠地解释耐药结核病概况和流行病学联系。已制定了方便用户的解决方案,以避免对特定生物信息学技能的需要,这两者都是免费的[29]或市售的。随着测序数据需要保密,安全和持久下次使用备份服务器或基于云的解决方案,供用户选择。工作人员需要足够的和持续的培训和指导湿程序和后序处理。
下一步
为全面贯彻落实NGS纳入日常工作流程,方法需要输入验证和认证计划。性能,精度和可重复性,质量控制措施,质量阈值(如。在深度基因组覆盖的/宽),使用的标准和标准作业程序的开发,对周转时间和临床管理的影响都必须进行评估或评估[1,7]。引入这些技术的微生物实验室将进行外部熟练度测试计划,这些计划已经在结核病中实施用于分子测试。简单但全面的临床报告对于帮助临床医生在结核病病例管理中做出最佳决策至关重要。尽管NGS生成了大量的数据,但我们对其所有含义的认识仍不完全,同时,如何最好地报告这些数据的研究仍在进行中[30.]。报告应在测序质量和突变来推断基因分型和耐药性简档的识别,并且提供确切的核苷酸改变细节和阻力水平的标准化的预测至少给信息(理想地基于最小抑制浓度数据的文献综述)。
WGS和有针对性的方法NGS承诺成为DST和结核病流行病学调查,并为其他高度优先的细菌病原体[未来标准3.,31]。还需要做更多的工作,以解决临床标本WGS的可行性问题,使实验室程序和测序后分析标准化和自动化,并在低资源、高负担的环境中实现NGS平台。
脚注
利益冲突:上午Cabibbe有没有透露。
利益冲突:T.M.沃克没有透露。
利益冲突:S.尼曼在研究进行期间报告从德国感染研究中心和莱布尼茨科学校园Evolung,助学金。
利益冲突:D.M.奇里洛有没有透露。
- 收到2018年6月20日。
- 接受2018年9月2日。
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