文摘
厌氧、好氧细菌在呼吸道样本估计的数量在三个囊性纤维化(CF)中心使用扩展文化的方法。1 - 69岁的受试者在临床上被诊断为痰(n = 200)提供稳定或支气管肺泡灌洗(n = 55)。18无氧和有氧属39培养从59%和95%的样本,分别;16 57属≥5%的患病率在中心。
分析微生物群落利用共生网络的痰样本显示分组口服,包括厌氧细菌,而典型的CF病原体形成截然不同的实体。假单胞菌与营养和F508del恶化是相关联的基因型,而厌氧菌与胰腺充分性患病率呈正相关,更好的营养和更好的肺功能。高总厌氧菌/总需氧菌菌落比率与胰腺充分性和更好的营养。主题分组通过因子分析相对优势厌氧菌的需氧菌有较温和的疾病假单胞菌主导集团具有类似比例的受试者F508del可以纯。
总之,厌氧细菌发生在早期的年龄。sputum-producing学科厌氧细菌与温和的疾病有关,建议有针对性的消除厌氧菌sputum-producing CF科目的可能不是必要的。
文摘
厌氧细菌培养在所有年龄,发生在社区,与温和的CF疾病的成年人http://ow.ly/7wQ430khMmE
介绍
抗生素治疗囊肿性纤维化(CF)呼吸道感染是针对特定的细菌,通常金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性的物种。然而,文化相关的和文化无关,分子方法重新定义了CF呼吸道感染如幼童腹壁薄弱与多元化降低气道细菌社区(1]。厌氧条件下被描述在CF降低航空公司(2,3]。重要的是,预留和兼性厌氧细菌,通常与口腔,从CF培养丰富的呼吸样本(4,5]。事实上,延长厌氧培养方法确定厌氧细菌大量> 60%的CF成年人的痰样本(6]。
厌氧细菌的作用在CF低气道疾病并不清楚。研究已经确定了厌氧细菌从直接肺样本,显示他们的存在并不只是反映了唾液污染采样期间(7]。在体外研究已经证明,厌氧生物释放毒性因素,包括蛋白酶和炎性短链脂肪酸(8,9),这表明厌氧生物可能是致病的CF肺。相比之下,在活的有机体内分子研究表明,厌氧生物多样性与温和的疾病(10,11]。分子方法突出细菌的广度和新的制备方法和宏基因组应对传统的下一代测序技术的不足,即。序列的扩增不能存活的细菌(12- - - - - -14]。细菌丰度可以通过测量定量PCR;然而,16 s rRNA每个基因组拷贝数不同属定量不同属multispecies感染仍然是不精确的15,16]。文化允许枚举的不同的细菌感染,属在幼童腹壁薄弱了生存能力和降低航空公司的增长,使后续在体外研究[17,18]。培养厌氧细菌并不是通常认为是致病性也相关的临床护理,即。知识丰富的这些细菌会有用的治疗呢?
这里,我们评估了协会的严格厌氧菌与疾病严重程度在所有年龄段的CF三个CF中心具有不同遗传和地理背景和药物。虽然“CF病原体”能在厌氧条件下生长,这可能反映了微环境,不适应不同属/感染。我们使用扩展文化方法试图在CF肺病厌氧菌的作用进行调查。我们专注于严格的厌氧细菌与属分子研究的报道,并确定这些厌氧菌的负载和生存能力在降低航空公司与典型的CF病原体。三个关键问题进行调查。1)厌氧菌的患病率与需氧菌与CF主题变化的函数年龄和网站/气候吗?2)患病率之间有关联或数量的厌氧菌和基因型,疾病严重程度和药物吗?3)社区结构建立了厌氧菌和他们不同年龄、疾病严重程度和需氧菌或关联吗?
方法
主题和样品收集
CF患者参加CF在贝尔法斯特中心在英国贝尔法斯特(成人和儿科CF诊所,卫生和社会保健信托),北卡罗莱纳大学教堂山(UNC),数控在美国(UNC医院小儿和成人诊所),以及爱尔兰的都柏林(博蒙特医院和圣母的儿童医院,Crumlin)前瞻性的进本研究于2010年7月至2013年11月。受试者进行了移植,正在CF跨膜电导调节电位器/调节器或介入治疗试验中被排除在外。伦理批准这项研究是获得在每个机构,和知情同意/同意了从所有成人,父母和儿科学科。
要么支气管肺泡灌洗(BAL)或痰(如果能咳出痰)和伴随的临床信息收集受试者临床稳定时,定义为没有收到抗生素除了长期维持治疗和≥6周post-completion静脉抗生素治疗。支气管镜检查在UNC如果一个孩子有一个执行程序需要麻醉在都柏林和常规监测。在两个地点,支气管镜检查是执行利用喉罩通气或气管内管。
临床数据
人口、人体测量学、肺功能、药物史和疾病并发症都进入到一个集中的数据库。基因型是讲F508del等位基因的数量。疾病严重程度被营养状况评估,胰腺状态和肺功能(在1 s (FEV用力呼气量1)% pred;看到补充材料)如果受试者能够可靠地执行肺量测定法按照美国胸科学会/欧洲呼吸学会标准(188bet官网地址19]。比较的身体质量指数(BMI)在儿科和成人的年龄范围,BMI分层为穷人,儿童可以接受的和营养良好的类别根据百分位数(ile≤5%, 6 - 50% ile和> 50% ile)和绝对成人体重指数(20.]。
细菌的分离和鉴定
标准化文化协议使用跨三个站点(如前所述)(6),提供的更多细节补充材料。简而言之,样本治疗15分钟前二硫苏糖醇系列稀释和镀选择性和非选择性媒体(补充表S1)。盘子aerobic-micro-aerophilic和厌氧条件下孵化2到7天。被检测出细菌量化(CFU·g−1或CFU·毫升−1总活菌计数在BAL)。每个不同的殖民形态类型被全长16 s rRNA基因测序鉴定。严格厌氧菌被定义为细菌不知道生存在大气中的氧气张力,而兼性厌氧、好氧细菌在厌氧条件下生长在所有分析包括为需氧菌。
统计分析
人口、疾病严重程度和细菌流行的标志(细菌的存在在任何CFU > 0)比较在临床基地使用卡方或确切概率法对分类变量和Mantel-Haenszel平均评分为序数变量卡方测试。细菌和疾病严重程度的标记之间的联系被Mantel-Haenszel评估平均评分卡方测试。分析被网站所描述的分层。
多元逻辑回归是用来测试因素预测特定细菌属的患病率。预测被确定通过与显著性水平逐步模型选择(进入或保持在模型中p = 0.10或p = 0.05,分别)。
分析,包括细菌数量/密度对数转换为非正态的分布使用日志10(CFU·克−1+ 1)将样品没有检测到细菌。细菌多样性措施包括丰富性(数量的统计分类群),均匀度和多样性(Shannon-Wiener指数)。分析细菌社区(网络分析和因子分析)进行了痰细菌数量为最常见的属。同现(网络分析)之间的分类群的计算(如前所述)(21]。因子分析作为一种无监督方法组属进行了使用方差极大旋转来实现分组独立因素。这些因素被用来分配每个主题定义一组由他们主导因素基于相似的细菌数量(见细节补充材料)。
结果
主题和样品
255名受试者。痰液样本(n = 200)得到三个站点,而落下帷幕(n = 55)样品只在UNC (n = 24)和都柏林(n = 31)。< 6岁儿童的样本都落下帷幕(n = 39)。痰(n = 34)或BAL (n = 12)收集来自受试者年龄6 - < 18年;受试者年龄≥18年来,166痰和四个BAL样本收集。
网站所示主题特点表1。特定场地不同的研究对象包括老年人和更少的科目在贝尔法斯特F508del突变阳性而UNC或都柏林。少在贝尔法斯特的受试者营养不良,虽然是一个年长的人群,FEV1值在贝尔法斯特在北卡罗来纳大学和都柏林类似,与温和的疾病在贝尔法斯特一致。慢性药物使用较低的落下帷幕与痰液(补充表S2a和b)。
随着年龄的增长患病率和丰富的属
18无氧和有氧属培养(39补充表S3),代表着167种(补充表S4)。普遍存在的一个或多个严格厌氧属在任何CFU > 0样品中为59%,在痰(67%)高于BAL样品(31%)(p < 0.001)。需氧细菌出席任何CFU > 0 197年的200(99%)的痰和51的55 (93%)BAL样本。均值±扫描电镜可行的总数量进行有氧高于厌氧细菌痰(2.27×108±3.80×107与2.86×107±2.07×107CFU·g−1;p < 0.001)和平衡(3.97×107±3.71×107与2.27×104±1.61×104CFU·毫升−1;p < 0.001)。
厌氧比有氧可行的计数BAL和痰跨年龄组(没有显示出差异补充图S1a)。细菌丰富低BAL(3.03±0.31)与痰(5.18±0.16)(p < 0.001),但类似的在每个样本类型年龄超过60度近似临床进展(图1一个)。香农多样性表现出类似的趋势(补充图印地)。16属≥5%患病率在BAL和痰液样本所示按年龄60度补充表S5。最普遍的无氧和有氧属所有年龄普氏菌(51%)和链球菌分别为(82%)。更普遍的细菌更丰富的除外洋葱患病率为5%,但时最丰富的礼物,普氏菌患病率高,但低丰度。患病率的变化最频繁的厌氧菌、需氧菌与年龄显示减少患病率从童年到mid-adulthood,后续增加厌氧属链球菌。逆趋势出现假单胞菌(图1 b)。
分析样品的网站显示不同的细菌丰富跨站点,但类似的痰样本的多样性(补充图S2a)。没有丰富的差异和多样性BAL样本都柏林与北卡罗来纳大学(补充图开通)。的患病率假单胞菌在UNC最高,洋葱,嗜血杆菌,放线菌,罗思氏菌属和Gemella在贝尔法斯特更普遍。奈瑟氏菌属在贝尔法斯特的发病率很低。都柏林的患病率最低普氏菌和韦永氏球菌属。进一步的细节通过网站和样本类型显示补充表S3和补充图S3。
细菌流行之间的关系,丰富和疾病严重程度
在受试者产生痰(n = 200)、厌氧菌与表型温和的疾病有关,如。更好的肺功能和BMI,胰腺充分性,缺乏胰岛素和长期使用抗生素,而不是基因型(图2一个)。嗜血杆菌流感嗜血杆菌需氧菌,观察到CF疾病早期,遵循了类似的模式(图2 b)。葡萄球菌表现出一个中间模式与负关联,即。那么普遍,使用长期抗生素(图2 c)。的模式假单胞菌然而,从厌氧生物截然不同。假单胞菌患病率呈正相关,更糟糕的BMI, F508del等位基因的数量和慢性抗生素(图2 d)。
协变量逻辑回归调整与p < 0.05通过逐步确定造型透露厌氧菌的患病率较低发育不良学科(表2)。对需氧菌,患病率较低嗜血杆菌和葡萄球菌与使用阿奇霉素。假单胞菌患病率与F508del等位基因有关,阿奇霉素和吸入使用抗生素。落下帷幕,临床或站点变量不相关细菌的患病率。
没有观察到协会绝对厌氧或有氧可行的计数和临床变量或学习网站痰或落下帷幕。然而,计算厌氧菌、需氧菌菌落比率显示,受试者的负载比较高的厌氧菌有温和的疾病(胰腺充分性和BMI)高于aerobe-dominated主题(补充图S4)。
群落结构在痰和协会主题特色
细菌社区反映了16属探索流行率≥5% (n = 200)的痰样本中使用微生物共生网络分析。细菌典型的口咽,如链球菌,罗思氏菌属和Gemella,与对方。相比之下,葡萄球菌,假单胞菌和洋葱每个形成不同的实体(图3)。
接下来,因子分析是用来减少微生物群的复杂性/样本最好定义为一组变量样本社区组成。细菌群体成分通常是符合共生网络。五个组件/因素解释49%的变异(图4)。因子1和2是由oral-associated细菌,包括链球菌,Gemella和罗思氏菌属。因素包括3嗜血杆菌和奈瑟氏菌属。因素4主要是专性厌氧菌。假单胞菌5定义的因素,也是负相关葡萄球菌和洋葱。
定义这些微生物群落的临床意义,病人痰液样本由他们主导因子(表3)。因此,每个样本被分配到组1 - 5。没有胰腺状态的差异,使用阿奇霉素、黏液溶解的和厌氧或好氧细菌负荷/团体之间的密度。组4和5的比例最高F508del纯合子的主题,但明显对厌氧菌和不同假单胞菌。厌氧密度/多样性较高的组(4组)倾向于FEV更高1和营养状况不良的发生率较低假单胞菌主导集团5。值得注意的是,3组包含最少的主题与营养状况差、最FEV很高1,与其他群体相比,但主题< 20岁的比例最高。
讨论
厌氧、好氧细菌培养从呼吸道样本在所有年龄段评估细菌患病率和量化密度CF呼吸道分泌物。有氧和厌氧细菌的患病率和数量是低BAL而痰。有趣的是,厌氧菌、需氧菌比例落下帷幕,即。将数量,类似于痰。兼性厌氧菌和micro-aerophilic细菌培养在这两个示例类型(补充表S3),包括需氧菌,可能低估了真正的厌氧CF肺的负担。假单胞菌和葡萄球菌也厌氧生长,增长模式与持久性相关的慢性感染,但重点在这项研究中所确定的是在严格的厌氧生物分子的研究。厌氧菌的患病率链球菌拒绝从幼儿到成年早期,即。很多病人会经历疾病恶化。在老年群体中,厌氧菌更普遍,可能与不太严重的疾病(图1 b),厌氧菌、需氧菌比例越高反映的主题与更好的营养状况(补充图S4)。厌氧链球菌物种非常丰富的口腔分泌物,并在口腔中发现在生命的最初几个月22]。虽然口腔分泌物落下帷幕,污染源的痰和大量的厌氧属高使样本污染对我们的发现一个不太可能的解释。尽管BAL样本通过喉罩通气或气管内管,降低污染的风险,较低的厌氧菌患病率在落下帷幕落下帷幕主题与痰可能反映了年轻的年龄较低的细菌负荷和样品稀释。需氧菌落下帷幕的患病率和丰富也低于痰。通常,BAL被认为代表一个30 - 80倍稀释的上皮衬里液(23,24]。
CF降低航空公司的口腔细菌的来源可能反映了micro-aspiration报道在健康受试者,在口腔细菌被发现在近端航空但连续黏膜纤毛的清除阻碍增长高密度(25,26]。我们建议从婴儿期开始,异常黏膜纤毛的清除CF增强保留吸气植物在厌氧航空环境中,使厌氧细菌增殖。这种情况符合最近的CF婴儿BAL微生物分析(27- - - - - -29日]。
厌氧细菌肺病的贡献并不清楚。这个大型研究,分析样本255 CF科目三个网站和一个年龄范围宽,特征的无氧和有氧微生物群落组成CF航空公司使用扩展文化的方法。之前的分子研究显示地理差异CF微生物(30.]。在我们的研究中,差异发生由研究网站但不是大陆,使气候相关系数小于基因型(如。F508del)和疾病严重程度有关。我们观察到,在痰液厌氧细菌更普遍的主题与温和的疾病。提高肺功能,增加BMI,胰腺充分性和胰岛素缺乏要求与厌氧菌的患病率更高单变量分析(图2)。厌氧菌和患病率较低嗜血杆菌在受试者阿奇霉素可能是由于阿奇霉素的抗菌活性。阿奇霉素展品良好的活动对生物non-CF疾病;然而,高电阻在CF,减轻其活动(31日,32]。值得注意的是,对胰腺充足保持重大调整时多种药物和临床参数(表2)。敏感性分析和模型中p = 0.1,另外包括FEV1为假单胞菌对厌氧菌、阿奇霉素和胰岛素,食盐水嗜血杆菌(补充表S6)。
我们培养的结果是一致的观察从分子微生物研究描述高多样性CF不太严重肺部疾病(5,33)和减少多样性在患者肺功能下降更快5,11]。我们定量文化允许这些关系扩展到无氧和有氧细菌密度、厌氧菌、需氧菌比例和多样性。更高的厌氧菌、需氧菌比例与胰腺充分性和更好的营养,与趋势高肺功能在这些厌氧菌、需氧菌比(补充图S4)。然而,绝对好氧或厌氧细菌浓度之间的联系/密度和FEV1没有检测到。我们假设,没有这样一个协会部分反映了CF的空间异质性肺疾病,细菌密度反映疾病的严重程度在焦bronchiectatic地区,而FEV1反映病变的肺的整体程度。FEV的假设1是不够敏感的检测区域,bronchiectatic疾病支持的一项研究报道厌氧密度之间有关联,CF患者和肺间隙指数,而不是FEV1(34]。此外,需要注意的是,年龄的CF-specific儿童肺功能参数开发(35)不能用于成人和基因突变对肺功能的影响并没有包括在内。因此,尽管我们使用方程(见全球肺行动参考补充材料在身体地位和中心)进行比较,分析FEV的细菌密度的关系1可能是更敏感、不同年龄组引用如果CF -。
分析性厌氧微生物的致病性在体外还可以获得洞察厌氧菌和CF疾病严重程度之间的关系。普氏菌是最丰富的,普遍厌氧属在这项研究中,并已报道一直在其他研究5,6,10,36- - - - - -38]。在体外菌株的研究实验室普氏菌证明它们产生短链脂肪酸和蛋白酶促炎(9]。然而,普氏菌抒发减少促炎反应呼吸细胞系和小鼠模型与经典有氧病原体(39]。因此,可以想象厌氧菌引起的相对较低的毒性与温和的CF表型。
同现网络可视化潜在细菌相互作用显示,分组的口头派生的厌氧细菌,占领细分市场不同于已知病原体(如假单胞菌和葡萄球菌)自己高度不同(图3)。这两个洋葱和假单胞菌发布产品和其他有毒的细菌,这可能导致他们不同的细分市场以及他们的优势40]。CF注册表数据也证明降低患病率葡萄球菌在老年患者假单胞菌患病率增加,表明类似的社会竞争这两种细菌(41,42]。
因子分析(图4)显示细菌组类似于共生网络。这些因素使得检测对临床参数的基于样本定义的因子载荷最高(表3)。4组患病率和多样性最高的厌氧菌有温和的疾病比假单胞菌主导集团,但不是最温和的疾病,可能反映了集团4表现出最高比例的结合体F508del主题和中度/高假单胞菌。
当前研究的一个挑战是包括儿科和成人的年龄组,迫使对比BAL和痰。age-wide比较,普遍被用作代理除了厌氧好氧细菌负荷的比率。类似于之前的研究,这项研究是有限的观测设计,因此不能确定协会与因果关系对anaerobe-induced疾病严重程度。这种差异有影响在考虑针对厌氧菌抗生素治疗与CF对象。最近的一项研究在婴儿CF展示更多儿童气道炎症气道的微生物主要是厌氧菌与“无菌”航空公司(29日]。厌氧菌也可能条件下CF航空促进感染比较经典的病原体(43]。这些数据可能支持治疗厌氧菌在早期CF疾病。相反,细菌培养和分子研究老,sputum-producing主题表明不同肺微生物群与相对丰富的厌氧菌与温和的疾病有关。可以想象,提高厌氧成年人与温和的疾病反映的多样性降低抗生素的使用在这些问题44)和/或低固有毒性的厌氧菌(39]。因此,有针对性的“消灭”厌氧菌在老年患者,临床基线时,可能导致临床效益,更耐药生物。厌氧菌在出现恶化,因此可能会增加他们的角色可能会有短期疾病状态的变化(6,14]。厌氧菌不是常规培养的临床设置。这种方法可能是合理的老年受试者如果抗菌治疗没有被考虑。
总之,厌氧细菌被发现在所有年龄段的CF呼吸道分泌物。在年龄组调查在这项研究中,需氧菌主导在厌氧菌对细菌数量。厌氧属与温和的疾病的发病率,降低抗生素的使用,表明不同厌氧微生物群可能是一个更好的健康的标志与CF老年受试者。痰厌氧/好氧细菌属聚集到社区,与临床结果。横断面研究不允许厌氧菌的区分标记与致病因素在肺部疾病的严重程度。总的来说,我们的数据表明,有针对性的消除厌氧菌的有氧致病菌可能不是必要的,直到进一步的数据是可用的。
补充材料
确认
我们要感谢参与本研究的患者和家庭,和临床团队在每个站点上他帮助完成研究。我们承认所有员工参与招聘实验室文化的细菌和耐心。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:G.G. Einarsson拨款支持的工作IMI (iABC;吸入抗生素支气管扩张和囊性纤维化)。n Gotman报告从AECF赠款,在进行这项研究的。美国戴维斯托马斯报道美国国立卫生研究院(NIH),在进行这项研究的。由P.H.吉利根报道国家卫生研究院的资助,在进行这项研究的。节目主持人沃尔夫冈报告国家卫生研究院的资助,在进行这项研究的。J.S. Elborn报告从北爱尔兰研发赠款,在进行这项研究的。Parion科学鲍彻司令部是董事会主席,一个私人UNC消磨CF公司专注于开发治疗,并已收到货币补偿这个角色。M.M. Tunney报告赠款从健康和社会保健研究和开发部门,公共卫生机构,北爱尔兰,在进行研究;从Alaxia和赠款,在提交工作。
支持声明:在UNC工作得到了国家卫生研究院(NIH)拨款HL084934 HL100809, P30DK065988 P0HL108808。贝尔法斯特女王大学研究由卫生和社会保健研究和开发部门,公共卫生机构、北爱尔兰和英国医学研究理事会通过US-Ireland伙伴关系。M.M. Tunney支持健康和社会保健研究和发展,公共卫生机构,北部Ireland-funded英国国家健康研究所职业科学家奖。研究皇家外科学院在爱尔兰,爱尔兰科学基金会支持的爱尔兰和健康研究委员会在授予SFI / 08 /美国/ B1676和由美国国立卫生研究院拨款5 r01 HL092964-04。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2018年2月6日。
- 接受2018年5月24日。
- 版权©2018人队