文摘
新的方法来控制肺结核(TB)的传播是需要的,包括工具来预测开发活动性结核病从潜伏结核感染(LTBI)。最近的研究描述潜在的风险有关,为了通知预后检测结核疾病进展的发展。这些努力包括公正的方法采用“组学”技术,以及更直接,假说驱动的方法评估少量甚至个人选择标记作为候选人的结核病相关的风险。公正的大规模筛选的血液RNAseq活动性结核病风险的概要文件确认签名与LTBI个人,≥1年之前的诊断。最近的婴儿接种疫苗研究发现增强t细胞活化标志物的表达作为一个关联的风险之前,发展中结核病;相反,高水平的Ag85A抗体和高频率的干扰素(IFN) -γ特定t细胞与减少相关疾病的风险。其他描述CD27−IFN-γ+CD4+t细胞作为结核病的可能预测标记。结核病延迟抗原t细胞反应,包括heparin-binding血凝素和DosR-regulon-encoded抗原与保护。
还需要进一步的研究来确定相关的风险可以被用来防止通过有针对性的预防性治疗活动性结核病,或允许定向招生进入新的结核病疫苗和治疗药物的疗效试验。
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有前途的生物标志物可能允许精确的预测从感染发展成疾病活动性结核病http://ow.ly/OzCL304ezfk
介绍
传染性肺结核(TB)是最重要的全球死亡率和发病率的原因。据世界卫生组织(世卫组织),每年有1040万新结核病例(1]。肺结核是一种传染病,传播几乎完全由咳嗽气溶胶携带的病原体结核分枝杆菌复杂。发病机理的特点是无症状的亚临床感染,广泛地定义为潜伏性结核感染(LTBI),这可能会持续几周或几十年。从运营的角度来看,LTBI可能最好被定义为一个持久的免疫反应结核分枝杆菌抗原检测由结核菌素皮肤试验(TST)或干扰素(IFN) -γ释放试验(IGRA)没有结核病临床表现的证据。基于这个定义,个人LTBI结核病的发病风险增加。然而,未知但大部分的LTBI不会开发结核病,因为他们的免疫系统持续控制分枝杆菌复制或因为他们不再活细菌感染。重新激活和随后的疾病和死亡率的风险显著增加结核分枝杆菌来华的免疫抑制患者,由于艾滋病毒合并感染(2)或治疗与肿瘤坏死因子(TNF) -α抑制剂(3- - - - - -6),或其他免疫调节器用于炎症性疾病和移植7]或破坏免疫力由于非传染性疾病,如2型糖尿病(8,9]。方法降低结核病发病率和死亡率结核分枝杆菌传播,依赖于正确的诊断,有效的治疗和预防感染和疾病。直到最近,LTBI被认为代表一个统一的国家(10]。然而,它变得明显,LTBI必须被视为一个广泛的感染状态不同程度的病原体复制,宿主抵抗和炎症(10- - - - - -13]。同样,结核病报告同样是多样化的和异构。这种异质性包括肺部病理发展的类型(肺结核)或肺(肺外结核),外扩散的病变,免疫激活和炎症的特点,结核分枝杆菌复制和细菌负荷。越来越多的证据支持的假设宿主的遗传背景影响结核疾病表现和成功的细菌感染大量易感人群(14- - - - - -17]。结核病研究领域的一个重要障碍是,细菌不能直接探测到在活的有机体内在潜伏期间,无症状结核分枝杆菌感染。测试期间可以量化细菌数量或复制水平LTBI将推动我们的能力来定义阶段的感染,并允许更详细的研究在无症状的发病机理和免疫结核分枝杆菌感染。
的结果结核分枝杆菌感染因此不是一个简单的两国分布由LTBI或活动性结核病,而是代表一个不同的州连续光谱的病原体和宿主“活动”,它需要不同的诊断和治疗策略(图1和2)。
从临床和研究的角度来看,这将是重要的正确识别结核分枝杆菌来华的人最有可能发展成活动性疾病为了目标精确与预防性治疗(18,19]。预防结核病引起的潜伏性感染是关键实现消除目标(18,20.,21),但大规模预防性治疗;在结核病流行国家基于IGRA / TST筛选需要治疗50 - 80%的人口,其中大部分是不必要的,因为85 - 95%的潜伏性感染人一生中永远不会发展疾病(22- - - - - -24]。IGRA / TST测试的阳性预测值因此太低,和更好的预后测试是必需的。
TST和干扰素释放试验是基于分枝杆菌抗原免疫敏化作用。结核菌素的情况下这是量化的横向直径皮肤硬结皮内注射带来的纯蛋白衍生物,原油的抗原的混合物,其中许多是共享的结核分枝杆菌,牛分枝杆菌,卡介苗(BCG)和一些环境分枝杆菌的物种。Blood-based干扰素释放,包括QuantiFERON结核病黄金管(QFT-GIT;试剂盒、希尔登,德国)和T-SPOT。TB(Oxford Immunotec, Abingdon, UK), measure在体外IFN-γ生产使用ELISA抗原刺激后全血,或外周血单核细胞(PBMCs)使用酶联immunospot有关酶联免疫斑点)(试验,分别为(25]。在这些化验,特异性结核分枝杆菌来自和缩氨酸生成的刺激吗结核分枝杆菌抗原ESAT-6, CFP-10 TB7.7 QFT-GIT)局限于一个地区的结核分枝杆菌基因组删除牛分枝杆菌BCG和不存在在大多数环境分枝杆菌(26- - - - - -29日]。
干扰素释放试验的一个实际的好处是,他们只需要一个实验室测试正面和负面的控制,且只有一个访问。此外,在体外测试可能区分正确与无力的负面反应(25]。一个更新版本的QFT-GIT已经启动(25,30.]:QuantiFERON结核病QFT-GIT +管包括一个额外的抗原,其中包含旨在专门诱导CD8肽+除了CD4 t细胞反应+t细胞反应(31日)与原QFT-GIT试验检测(32]。包含这些新CD8-specific肽的基本原理来自越来越多的证据表明,结核分枝杆菌特殊技能CD8+t细胞是更频繁地检测相比,受试者活动性结核患者LTBI (33- - - - - -36),他们与最近接触结核(37和他们下降当患者接受抗结核治疗38]。第一个数据对性能QuantiFERON结核+最近在欧洲多中心研究报告(39,40]。
应该提到的额外承诺测试LTBI检测。C-Tb是皮肤测试(41]措施过敏症ESAT-6和CFP-10蛋白重组后皮内管理。作者声称,它结合了TST和干扰素释放技术的长处和优势:低成本和易用性,像结核菌素和高特异性类似于干扰素释放。外的另一个测试中,基于Rv3615c编码RD1区显示潜在的作为一个新的基于t细胞immunodiagnostic [42]。
然而,应该注意的是,TST和干扰素释放份额限制。他们都患有低精度的职业病人和不能区分LTBI和活动性结核患者(25]。;后者是一个主要问题在结核病流行地区,导致可怜的预测价值发展的结核病人的LTBI [25,43,44]。这些限制提供一个令人信服的理由,为什么一个简单的衡量IFN-γ响应不允许正确评估风险延迟活动性疾病的进展。它遵循生物标志物的发现,可以区分活跃和静止细菌复制与LTBI人,或主机标记识别那些LTBI那些患活动性疾病的风险(11,45,46是非常重要的。此外,关键是新发现的标记和签名验证在不同的地理环境,因为人类有不同的遗传背景和环境的影响,以及不同的循环结核分枝杆菌血统可能发展为结核病的可变利率(47]。
新的预后预测的测试进展的特点从潜在的疾病活动性结核病最近得到太多的关注。2015年,世卫组织曾召集了一个专家小组讨论的目标产品概况(TPP)这样一个测试的带领下找到,根据现有的知识。对于这样一个测试工具在结核病负担高的环境中,理想情况下应该基于样本类型比痰液更容易。而较高的阳性预测值(PPV;> 95%)发展从感染到活动性结核病的(图3和4)将理想,如此高的价值可能在短期内无法实现,和一个更现实的目标必须被考虑。这里给出的性能特征和图3和4代表专家意见(TPP的草案是找到的网站上发表了一篇:www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/05/TPP-LTBIprogression.pdf),是全球利益相关者进行验证的调查。> 90%的敏感性和特异性(和最低限度为75%)被认为是一个适当的目标获得可接受的阳性和阴性预测值。
如果我们假设2年累积结核发病率的2%和50%(异烟肼预防性治疗的有效性图3和4)为最优目标需要治疗的患者数量(例数十分)13 PPV为16%。同样,在同一个场景中,最小的目标例数十分将40 (图3PPV)的6% (图4)。如果我们评估相同的参数为当前一代又一代的干扰素释放(基于干扰素释放的性能特征预测进展的结核病作为世卫组织LTBI指南中概述48,49PPV),是2 - 3%,例数十分是85)。TPP的并行开发框架的验证测试正在制定(50]。当然,重要的是要认识到,这种新的预后的性能特征测试(即。PPV和NPV)将取决于底层的患病率结核分枝杆菌感染、结核病的发病率和风险。
最近的研究活动,旨在发展有关结核病的风险,这可能会通知预后测试的未来发展。这些努力包括公正的方法采用“组学”技术,以及更直接,假说驱动的方法评估要么少量甚至个人选择标记作为候选关联的风险(软木)的结核病(表1)。在下面几个部分中,我们描述的一些最有前途的方法。
血转录组相关的风险
结核病的和最先进的发展阶段是一个遗传转录组mRNA表达签名确认的挖掘RNA-sequencing数据在一个大型前瞻性群组的青少年LTBI从南非51]。RNA签名是一组46不寻常和107年发现的控制,和基于分类器计算结核病风险评分从63年的相对表达水平从16个基因mRNA转录本在全血(52]。16-gene的转录组和签名预测进展从感染到结核病的敏感性为66%,特异性为81%在12个月前发生结核病的诊断测试队列。测量16-gene mRNA表达的转录组软木从测量由RNA序列(HiSeq2000;美国圣地亚哥Illumina公司CA)高通量、微流体、实时PCR平台允许便宜和简单的测量基因表达。由盲目的pcr 16-gene转录组和签名验证预测在两组独立的南非和冈比亚的不寻常和控制从一个未来的家庭结核病接触研究,gc6 - 74(结核病生物标志物的财团)[52]。验证组的敏感性是54%,特异性83%。正在进行的分析正在进行探索生物过程,是在青少年发展研究的基础。然而,值得注意的是,16个基因组成和签名都是由I型和II干扰素,表明慢性外围的激活干扰素反应,此前有关活动性结核患者在诊断时(53- - - - - -56),也预示着疾病活动性结核病的发病。
应用程序相关的临床试验和预防策略
进一步发展的pcr 16-gene转录组和包括评估诊断性能对结核病患者和健康对照组的微阵列数据公布。在南非的一组免疫成年人包括130流行的结核病例和230例对照,结合从四个已发表的研究(53- - - - - -56),活动性结核病和健康对照组之间的软木歧视敏感性87%,特异性97%。因此,尽管预后16-gene转录组心脏并不是最初开发用于诊断目的,这些性能特征表明签名很有可能作为nonsputum-based触发调查确诊结核病诊断测试。因此,16-gene转录组和有潜力来识别高危个体诊断结核病的筛查和此外,如果活动性疾病已经被排除在外,识别高危个体发展为12 - 18个月内发生结核病的筛查。这些性能特点将适合nonsputum-based分类测试来确定明确的人,sputum-based调查;和识别这些人将最大限度地受益于有针对性的预防治疗,从而避免不必要的治疗的LTBI谁会保持健康。流行的软木+在年轻的南非免疫∼12%,并不是不同IGRA-negative和IGRA-positive (Penn-Nicholson A和Scriba TJ,开普敦,南非;个人通信)。鉴于这些标准,筛选与16-gene转录组和将允许数倍的减少的人数要求COR-targeted预防性治疗结核病高负担的设置,而IGRA-targeted预防战略(图2和3)。
理想COR-targeted预防性治疗方案会短,安全、冲销、能够与高覆盖率迅速推出系列质量活动。临床试验测试3个月短期的效果,每周,高剂量直接观察的异烟肼和rifapentine惠普(3)16-gene转录组COR-positive人没有活动性结核患者开始于2016年10月(clinicaltrials.gov / NCT02735590)。正在努力开展并行,以转移和测试一个即时的设备将允许大规模软木筛选由当地卫生保健提供者。翻译一个即时测试可能需要一个更简洁的签名和正在努力减少16-gene转录组和较少量的mRNA转录(Scriba TJ等开普敦,南非;个人沟通)。遗传转录组签名对结核病的诊断包括三个(57)或四个基因(58)最近被验证,提供证据的概念非常小的组基因有潜力有前途的诊断工具。如果成功,螺旋器试验将为全社区的潜力提供概念验证和筛选活动目标治疗和预防治疗结核病的风险最高的个人的,和影响全球流行通过早期诊断和中断传输(表1)。
预测结核病临床症状的发病前几个月在感染艾滋病毒的人使用宿主生物第一次证明了在一个独特的纵向队列的阿姆斯特丹队列研究(59- - - - - -61年]。艾滋病毒感染,静脉注射毒品使用者定期血液集合在市政卫生服务和允许的这些样本档案选择PBMCs之前6个月到1年的临床诊断结核病。使用既逆转录酶基因表达分析多路复用ligation-dependent探测器放大(62年]预测签名透露,歧视那些开发结核病在未来从那些仍然免费疾病样本收集后至少2年(60,61年]。表达白介素(IL) -13没有亚耳河(亚太经合组织,自身免疫调节器)结核病发展预测明年内高危人群。有趣的是,在分析个人从IL-13 /亚耳河集团发展到结核病在接下来的几个月,也有丰富的I型IFN-related基因的表达,表明早期疾病标志物的检测。虽然这需要重复在较大,纵向和独立的人群,最好也免疫组织,这是一个原则的重要证据,说明预测结核病生物标志物(的力量表1)。
免疫activation-based软木测试
t细胞activation-based歌珥的结核病也被调查的主题。最近的一项研究中,在总量作为分母IIb阶段婴儿参与了最近这功效试验MVA85A的63年),而许多免疫结果的潜在关联风险审判MVA85A的基线后,管理促进疫苗与安慰剂。53个婴儿发达活动性结核患者和205名对照保持健康进行评估。一个有趣的结果是,婴儿开发结核病在随访中CD4的水平明显高于有激活+t细胞,表达人类白细胞抗原D-related研究基线比保持健康的婴儿64年,65年]。重要的是,这个结果是独立的队列进行验证结核分枝杆菌青少年来华的前面所讨论的,CD4升高+t细胞激活还发现与结核病风险的(64年]。提升t细胞激活可能因此反映相同的免疫发病机理是观察调节干扰素反应结核病不寻常的青少年研究(表1)。
综上所述,婴儿,青少年和gc6 - 74家庭接触研究暗示所有人患活动性结核病的风险有炎症和/或免疫激活的证据。这种免疫激活的来源不明确,需要进一步研究。在青少年和家庭联系,结核分枝杆菌复制可能增加炎症的主要动力,但这不能引起的婴儿,他们都IGRA-negative在样本收集。婴儿的研究显著结果是t细胞对巨细胞病毒的反应明显高于在婴儿确诊结核病(64年]。这就提出了一个假设潜在的病毒可能推动免疫激活(66年,67年),这可能是与结核病的风险。遗传倾向的免疫激活和其他环境因素也可能参与进来。
结核病被确定的其他两个候选人软木4-6-month-old IIb阶段婴儿的队列MVA85A试验(63年]。更高水平的Ag85A-binding免疫球蛋白(Ig) G抗体中观察到比寻常的控制。因此Ag85A-specific免疫球蛋白是与减少患结核病的风险(64年]。此外,高频率的BCG-specific IFN-γt细胞分泌,有关酶联免疫斑点试验在试验来衡量基准,也能降低患结核病的风险。后者的结果是令人惊讶的前免疫相关研究总量作为分母婴儿,这旨在确定频率或细胞因子co-expression模式BCG-specific CD4和CD8细胞与后续有关结核病的风险(68年]。这项研究中,CD4级+和CD8+t细胞的表达IFN-γ、TNF-α- 2和IL-17 10周的年龄,没有发现之间的联系频率或cytokine-expression BCG-specific CD4的模式+和CD8+t细胞和随后的结核病风险的(68年]。
其他几个也解决t细胞激活状态的研究表明t细胞活化表型标记和/或分化可以区分不同的结核病感染的临床表现。在抗原驱动分化淋巴细胞通过几个阶段(早期、晚期和终末分化效应细胞),和每个阶段的特点是一组细胞表面标记。由于分化过程取决于抗原刺激,t细胞的分化可以作为指标的标志结核分枝杆菌复制或抗原负载。t细胞的表达CD27已经观察到显示承诺作为软木。CD27是肿瘤坏死因子受体超家族的一员,这是既定的幼稚t细胞所表达的和早期效应淋巴细胞,但在后期表达下调的效应细胞分化阶段。因此,后期效应淋巴细胞表现出低到没有CD27表达式(69年- - - - - -70年]。几项研究已经表明,显著更高的比例结核分枝杆菌特殊技能IFN-γ-producing CD4+t细胞不表达CD27 (CD27−IFN-γ+CD4+)与疾病活动性结核病人,与健康对照组相比。此外,它已被证明,CD27的频率−IFN-γ+CD4+细胞强烈与肺破坏的程度(71年)和结核病治疗的成功(73年,76年]。年代chuetzet al。(77年)报道,艾滋病病毒感染者没有结核病CD27的比例更高−IFN-γ+CD4+细胞比艾滋病毒阴性的人没有结核病和建议的积累结核分枝杆菌特殊技能CD27−CD4+细胞可能反映的程度结核分枝杆菌复制,从而可能识别亚临床结核分枝杆菌感染。对特定CD4 CD27表达式的损失+t细胞被证明疾病活动性结核病的发展进行一个感染艾滋病毒的病人最近HIV-seroconverted,进一步支持这一假设[77年)(表1)。检测的准确性基于调制CD27可能增加了结合几个测试基于CD27或细胞因子表达(78年];然而,还需要进一步的研究来证实和干扰素释放相比更好的精度。
IFN-γ诱导protein-10 (IP-10)是一种趋化因子分泌多种细胞类型,包括单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞,以应对IFN-γ。它作为一个化学引诱物对于单核细胞/巨噬细胞,t细胞、自然杀伤细胞、树突细胞和促进t细胞粘附[79年,80年]。IP-10浓度,测量后结核分枝杆菌抗原暴露或如果血液中,提高结核病患者要么有或没有艾滋病毒合并感染在血(81年- - - - - -84年)或尿液(85年,86年]。高水平的血浆IP-10与事件有关结核病在免疫(87年和感染艾滋病毒的科目88年)(表1)。
HBHA和其他结核分枝杆菌延迟抗原
Heparin-binding血凝素(HBHA)抗原表达的表面各种分枝杆菌物种和促进绑定到宿主上皮细胞(89年]。增加这个功能结核分枝杆菌分枝杆菌的致病性和促进肺外传播。检测t细胞反应特定于HBHA与LTBI有关,建议HBHA-specific反应的保护作用[90年- - - - - -93年]。这是由HBHA-specific CD8的存在+LTBI t细胞,提出了这些细胞的作用在维持潜伏状态(94年,95年]。然而,如前所述,LTBI被认为是一个异类实体包括自然治愈,稳定和持久的无症状感染,正如前面所讨论的,早期对活动性疾病进展(10]。Corbiereet al。(96年]表明,测量IFN-γ反应两个不同的分枝杆菌抗原,ESAT-6 HBHA,可能允许分层LTBI受试者分成几组。在这个模型中,那些分数-抗原代表成功的消除结核分枝杆菌感染,那些分数积极抗原都是真正的延迟能够控制阶段结核分枝杆菌复制和那些积极ESAT-6积极复制结核分枝杆菌(如在疾病活动性结核病)。后者是通知的示范,ESAT-6产生在分枝杆菌增长(高水平97年]。基于该模型,作者报告的损失在体外IFN-γ应对HBHA之前开发的结核病在透析病人96年]。
其他结核分枝杆菌延迟抗原也被报道(98年]。改编的结核分枝杆菌非状态或缓慢复制在LTBI持久性,表达下调的代谢活动和相伴已经提出改变基因表达模式99年,One hundred.]。在这种状态下,结核分枝杆菌已被证明诱导的表达48-gene-encoding DosR调节子(101年]。t细胞反应结核分枝杆菌DosR-encoded延迟抗原尤其在结核菌素占主导地位+LTBI个体,而成功地治疗或活动性结核病患者。这些延迟抗原t细胞增殖和IFN-γ生产由一直出现在许多不同的基因和LTBI地理种群(102年- - - - - -104年]。应对这些抗原之一,从远程LTBI Rv2628,歧视最近在一个横断面研究[104年]。此外,反应之间的比率结核分枝杆菌DosR-encoded抗原和ESAT6类比结果发现HBHA和ESAT6与结核病的低风险105年]。这些结果表明,评估这种反应可能有助于识别LTBI受试者更容易患活动性结核病在2年内可能受益于预防治疗(QFT-IT-positive和Rv2628-negative) (表1)。此外,它已被证明,具体应对Rv2628发现结核病的网站(106年),强调概念的结核病感染谱的不同阶段(10]。
升高外周单核细胞比例作为识别和联系人的结核病患者患活动性结核病的风险最高
年代国家和他的同事们(107年- - - - - -109年显示在1920年代,在外周血单核细胞和淋巴细胞数量之间的比率,或单核细胞/淋巴细胞(M / L)比,与进步的结果分枝杆菌感染的兔子。重新发现这个实验研究,一系列前瞻性群组评价最近表现在成年人中,孕妇和婴儿在撒哈拉以南非洲地区(110年- - - - - -112年]。在每个研究M / L比值升高与结核病的出现症状之前的风险。的生物基础这一发现可能与激活的骨髓形成引起的骨髓IFN-γ的表达升高,抗细菌参与的反应,从而导致血液中增加骨髓细胞结构(113年,114年]。因为淋巴细胞增殖不是激活以类似的方式,和周围淋巴细胞,包括T - b细胞,被雇来的结核分枝杆菌复制,这可能会导致降低外周血淋巴细胞。因此M / L比值越高可能是这两个过程的产物。有趣的是,除了这一假说,它表明,在健康的捐赠者高M / L比值与抗细菌活性和转录组的概要文件的特点是一个浓缩IFN-associated成绩单的单核细胞。这些数据表明,M / L比值可以作为标记与亚临床疾病有关的单核细胞功能(115年)(表1)。
不同的宿主免疫反应BCG接种疫苗可以模糊识别的心脏
结核病软木的另一项研究在最近完成了10周大的总量作为分母婴儿从南非,这在两年的随访中发展到结核病(不寻常)或保持健康(控制)116年]。全球基因表达和细胞反应的综合比较卡介苗之间不寻常和控制没有导致识别这些婴儿的心脏。然而,基因表达谱显示两种不同的集群的婴儿,每一个都包含不寻常和控制。一个集群有浓缩的差异表达基因在生物通路包括干扰素反应和t细胞激活,而其他集群有浓缩的骨髓细胞和葡萄糖代谢通路。重要的是,在集群1婴儿,那些发展为结核病单核细胞升高BCG-specific CD4 t细胞比率和频率+t细胞表达IFN-γ等辅助1型细胞因子。令人吃惊的是,这位前找到符合M / L比值对结核病风险的(115年,116年),而后者是一致的观察免疫激活和频率IFN-γ-expressing Ag85B-specific t细胞识别为软木的4-6-month-old婴儿群IIb阶段MVA85A的审判。
结论
尽管只有少数的研究已经确定了生物标志物的发展为肺结核,一幅画是新兴的常见的生物过程,包括免疫激活干扰素反应和外周血髓系和淋巴细胞的变化已被临床验证和与结核病的风险。有前途的生物标记和生物标志物特征被发现,可能允许精确的预测从感染发展成疾病活动性结核病。这些生物标记被进一步的几个测试开发,评估和可能的使用在临床设置。然而,尽管这个伟大的进步,生物标志物特征尚未确定,完全满足性能目标的预后测试进展从潜伏性感染结核病全球卫生界提出的由世界卫生组织和其他利益相关者。进一步加强研究工作需要持续的生物标志物的发现、评估和测试开发。此外,它是至关重要的,不同的标记和签名验证在不同的地理环境(因此不同宿主遗传背景和传播病原体血统),以确保精度在不同的高负担设置足够可以使“屏幕和治疗”策略。实用的生物标志物也高度依赖翻译测试near-patient平台允许测试设置中风险最高的患者进展给护理(如。艾滋病毒诊所;在结核病流行人群)。没有进一步进展的开发测试,更好地预测活动性结核病的发展,我们将无法根除结核病的主要和实现的end-TB策略。
确认
我们非常感激塞缪尔·g·舒马赫(发现,瑞士日内瓦)导致数据的准备。
脚注
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- 收到了2016年5月20日。
- 接受2016年9月8日。
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