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文摘
背景
挑战在结核病的研究是开发一个新的免疫测试,可以帮助区分,在主题响应QuantiFERON结核病黄金管(QFT-IT),那些能够控制Mtb复制(远程LTBI,最近过去的感染和结核病)从那些不能(活动性结核患者)。IFN-γ应对Heparin-binding-hemagglutinin结核分枝杆菌(HBHA)与LTBI有关,但净化的繁琐程序甲基化和免疫活性的结核分枝杆菌的蛋白质或形式牛分枝杆菌杆菌Calmette et吉林(BCG)在诊断测试阻止了它的实现。因此,本研究的目的是评估结核分枝杆菌的甲基化HBHA IFN-γ反应产生的m . smegmatis(rHBHAms)个体在不同阶段的结核病得分QFT-IT积极。
引用:泼G, Chiacchio T, Vanini V, Butera O, Cuzzi G, Bua, et al .(2011)甲基化HBHA生产m . smegmatisRD1-Responders之间积极和稳定的肺结核疾病之间的歧视。《公共科学图书馆•综合》6 (3):e18315。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018315
编辑器:Anil Tyagi印度德里大学
收到:2010年12月19日;接受:2011年2月24日;发表:2011年3月29日
版权:©2011泼et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:这项研究是支持由意大利卫生部“Ricerca Corrente”和“Ricerca Finalizzata”06.76.1和07.103。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
结核病仍然是一个主要的全球卫生问题,是发病率和死亡率的主要原因之一,由于感染(结核/出版物/ global_report / en / www.who.int)[1]。
保护和疾病的生物标记物的鉴定可能有利于更好地理解最终结核病发病机制和诊断的目的。一个有用的方法来识别这样的标记可以比较在感染免疫反应可能与保护十几主题,如对象和潜在的结核病感染者(LTBI),与相关病变患者(与活动性结核病科目)[2],[3]。
最近,引入T-cell-based干扰素(IFN) -γ释放化验(干扰素释放),用抗原属于结核分枝杆菌(Mtb)地区的差异(RD) 1(包括早期分泌抗原目标(计)6和文化滤液蛋白10 (CFP) -10),取得了重大一步改善LTBI诊断[4]。然而,这些测试并不区分活动性疾病,远程LTBI最近感染和过去的治愈结核病[5]- - - - - -[8]。
以往的经验显示,heparin-binding血凝素(HBHA) MTB LTBI复杂是一个主要的延迟相关抗原[9]- - - - - -[11]评估在PBMC通过测量IFN-γ经过4天的刺激。这是证明了低HBHA-induced IFN-γ生产活动性结核病患者[12],[13]依赖的抑制能力T -监管细胞边缘[9]。然而,没有发现T -监管具体抑制结核病,因此网站的高当地回应HBHA被检测到[14]。不同HBHA-specific LTBI科目与活动性结核病患者的免疫反应也观察到在研究体液反应对HBHA测量[10],[15]- - - - - -[17],确认HBHA是一个重要的结核分枝杆菌抗原在感染和可能是一个有用的生物标记来区分LTBI和活动性结核病。
重组HBHA生产大肠杆菌没有免疫原性和甲基化HBHA需要完整的免疫蛋白的属性呢[10],[11],[15],[18]。为了克服cumbersone程序参与本地的净化HBHA (nHBHA)[19],[20]一个重组m . smegmatis结核分枝杆菌从应变表达histidine-tagged重组HBHA蛋白(rHBHAms)开发并用于净化大量的蛋白质[21]。rHBHAms的甲基化模式是类似于观察nHBHA (rHBHAms 16甲基vs≈≈23 nHBHA甲基[22]通过质谱分析评估,泼未发表),这部分甲基化被证明足以拯救HBHA见体液反应的免疫学性质的研究[15]- - - - - -[17]。
因此,本研究的目的是评估工具,有助于区分不同阶段的结核病在那些积极的干扰素释放,我。e QuantiFERON结核病黄金管(QFT-IT),由于远程LTBI,最近感染、结核病,或活动性结核病。在这些主题我们特点T-cell-specific免疫反应生产的重组和甲基化HBHAm . smegmatis长期和短期全血(rHBHAms)刺激和血细胞计数。
结果
特征的人口
我们研究与远程LTBI 24个人,19日最近的结核病感染,18与过去的结核病和26活动性结核病。平均年龄、性别、来源、地位和QFT-IT BCG接种在不同组(表1)。不同群体之间的显著差异被发现的起源(p < 0.0001)和BCG接种状态(p < 0.0001)。“起源”我们的意思是注册个人出生的地方。入学的时候他们都住在意大利生活了至少一年(中位数:6年,差22页—年)。
IFN-γ应对rHBHAms存在剂量依赖的相关性
确定最合适的浓度rHBHAms使用在体外,评价了,10例LTBI IFN-γ-specific响应在体外短期刺激全血与rHBHAms评估。所示图1,IFN-γ响应之间的显著差异被发现当比较rHBHAms 1µg /毫升的浓度浓度25µg /毫升(p = 0.002), 10µg /毫升(p = 0.008)或5µg /毫升(p = 0.004)。没有观察到显著差异的其他成对比较。因此,从以下rHBHAms用于这些的浓度在体外化验是5µg /毫升。
全血从10科目与LTBI刺激有或没有rHBHAms在不同浓度(25到1µg /毫升)。IFN-γ后反应是评估一个短期刺激后(1天在体外刺激)。IFN-γ反应获得的显著差异被发现25到5µg /毫升的浓度,获得1µg /毫升。
短期IFN-γ应对不同的抗原:定量分析
应对QFT-IT。
所有的入学对象对有丝分裂原的反应(数据未显示),选择标准(见QFT-IT材料和方法)和归类为远程LTBI最近感染、结核病和活动性结核病。没有发现显著差异在不同群体QFT-IT,除了那些最近感染之间(中间值:10.0国际单位/毫升;差:1.7 - -10.0)和活动性结核病患者(平均:2.25国际单位/毫升;差:0.77 - -6.30)(p = 0.01) (图2一个)。
全血是刺激有或没有QFT-IT (一个),rHBHAms (B)和巨细胞病毒溶菌产物(C)。IFN-γ后反应是评估一个短期刺激后(1天在体外刺激)。减法后的数据显示的结果如果样本。的显著差异IFN-γ释放QFT-IT (一个)和巨细胞病毒溶菌产物(C)之间被发现患有活动性结核病和近期感染(p = 0.01, p = 0.002)。显著降低应对rHBHAms (B)被发现在活动性结核病患者与远程LTBI相比(p = 0.001)和过去的结核病(p = 0.02)。
应对rHBHAms。
应对rHBHAms IFN-γ产量显著低于活动性结核病患者(平均:0.2国际单位/毫升,差:0 - 16.3)相比与远程LTBI(中值:1.4国际单位/毫升,差:0 - 28.7)(p = 0.001)和主题与以往结核病(中值:1.1国际单位/毫升,差:0 - 17.0)(p = 0.02) (图2 b),而不是与最近感染相比明显不同(0.7国际单位/毫升(IQR: 0 - 29.5) (p = 0.052)。没有发现显著差异在不同群体没有活动性结核病(远程LTBI最近感染,过去结核病)。
巨细胞病毒(CMV)溶菌产物。
作为内部控制,我们评估了IFN-γ生产应对召回抗原巨细胞病毒。响应分析了巨细胞病毒在所有科目与远程LTBI和过去的结核病和大部分的受试者从其他组(16/19的最近感染组;活动性结核病组)的25/26。IFN-γ巨细胞病毒反应明显不同的只有那些最近感染之间(中间值:17.2国际单位/毫升;差0.3 - -30.4)和活动性结核病患者(平均:4.5国际单位/毫升;差0 - 22.9)(p = 0.002)。(图2 c)。
一起,这些数据表明,在那些得分积极QFT-IT, IFN-γ应对rHBHAms经常被发现在那些能够控制快艇感染,自然(远程LTBI和近期感染)或化疗后(过去TB)比那些正在进行快艇复制(活动性疾病)。值得注意的,下的监管回应rHBHAms活动性结核病患者的观察与过去相比治愈结核病。
在体外短期和长期IFN-γ反应rHBHAms QFT-IT: ROC分析和定性评价
因为没有主体之间的差异被发现没有活动性结核病的短期应对rHBHAms(远程LTBI最近感染,过去结核病),这些团体的数据汇集在一起,表示结果“不活动性结核病”科目。反应的显著差异被发现rHBHA受试者之间没有活动性结核病(p = 0.001) (图3)。因此,根据这一结果,我们进行了ROC分析评估的潜在使用这对歧视结核病的不同阶段分析。我们发现AUC显著结果分析(AUC, 0.72;95%可信区间(CI), 0.60 - -0.83, p = 0.001) (图4一)。为了得分,选择截止值最大化敏感性和特异性的总和。分界点低于0.25的使用国际单位/毫升显示50.0%敏感特异性(95%可信区间,29.93% -77.89%)和80.3%(95%可信区间,-89.40 68.16%)来识别那些活动性结核病。因此,基于这一截止值,我们取得了正面和负面的结果,进行两两相比。比例显著降低之间的积极的结果被发现患有活动性结核病(13/26;50%)相比,那些没有(12/61;80.3%)(p = 0.0008)。
的显著差异被发现IFN-γ应对rHBHA受试者之间没有活动性结核病(p = 0.001)评估短期或长期刺激。
ROC分析回应rHBHAms获得在短期刺激(全血一个),长期刺激(B)和QFT-IT (C)都使用了活动性结核病患者和比较器组受试者没有活动性结核病。
评估记忆反应,我们评估了长期IFN-γ生产rHBHAms大多数受试者参加与活动性结核病,52/61没有(20/26),两组之间差异显著(p = 0.0003) (图3)。因此,基于这些数据,ROC分析我们发现AUC显著结果分析(AUC, 0.78;95%可信区间(CI), 0.64 - -0.91, p = 0.0002) (图4 b)。得分的目的,我们选择了一个分界点最大化敏感性和特异性的总和。分界点低于0.75的使用国际单位/毫升显示75.0%敏感特异性(95%可信区间,50.90% -91.34%)和75.0%(95%可信区间,-85.97 61.05%)来识别那些活动性结核病。因此,基于这个分界点,我们分正面和负面的结果,进行两两相比。比例显著降低之间的积极的结果被发现患有活动性结核病(5/20;25%)相比,那些没有(39/52;75.0%)(p = 0.0003)。
在相同的主题,我们也调查了是否应对QFT-IT可能有助于区分结核的不同阶段。没有显著的结果曲线下的面积(AUC)分析得到(AUC, 0.62;95%可信区间(CI), 0.49 - -0.74, p = 0.07) (图4 c),因此不需要进行进一步的统计分析。
一起,这些数据表明,在那些得分积极QFT-IT, IFN-γ应对rHBHAms更频繁地发现结核分枝杆菌在那些能控制感染,结核分枝杆菌比那些有一个正在进行的复制所评估的短期和长期的全血化验。
记忆的反应在那些活动性结核病rHBHAms受损
进一步评估记忆反应我们评估长期IFN-γ生产rHBHAms子组的受试者得分负(低于0.25国际单位/毫升)抗原在短期测试(11没有活动性疾病活动性结核病和11)。所示图5,IFN -γ值之间差异显著的短期测试(中值:0.1国际单位/毫升;差0 - 0.2)和长期试验(中值:0.6国际单位/毫升;差0.5 - -5.7)(p = 0.0003)没有活动性结核病。相反,那些活动性结核病,没有发现重大IFN-γ差异当短期测试(中值:0.1国际单位/毫升;差0 - 0.1)相比,长期测试(中值:0.1国际单位/毫升;差0.1 - -0.4)(p = 0.4)。根据前面建立的截止值(图4),一个更高比例的内存反应被发现在受试者没有活动性疾病(5/11,45.4%)相比,那些有活动性结核病(0/11,0%)(p = 0.03) (图5)。在一起,这些数据表明那些活动性结核病,记忆的恢复rHBHAms反应是不可能的。
记忆反应(长期刺激)rHBHAms在受试者评估得分-短期测试。IFN-γ价值之间的显著差异被发现在短期内刺激而获得的长期刺激无活动性结核病(p = 0.0003)。不同,没有发现显著差异之间的短期和长期刺激那些活动性结核病(p = 0.4)。减法后的数据显示的结果如果样本。虚线表示截止获得短期和长期测试。
IFN-γrHBHAms是由CD4的反应+记忆效应T淋巴细胞
我们进一步评估细胞的表型特征响应的rHBHAms HBHA-responders在短期内测试。所有研究对象分析回应积极的控制,PMA + IONO(数据没有显示)。见一个代表性的主题图6,IFN-γ应对rHBHAms CD4的观察+t细胞(图6 d)-控制(图6 b),而没有发现CD8的响应+t细胞(图6 c)-控制(图6)。描述这个免疫反应,天真和记忆表型进行了研究。大部分的CD4+t细胞IFN-γ应对rHBHAms提出效应记忆表型(84%)定义为CD45R0+CD62L (图6 E)。
细胞的表型特征响应的rHBHAms HBHA-responders进行评估。见一个代表性的主题,一个重要IFN-γ应对rHBHAms CD4的观察+t细胞(D)-控制(B),而没有发现CD8的响应+t细胞(C)-控制(一个)。描述这个免疫反应,天真和记忆表型进行了研究。大部分的CD4+t细胞IFN-γ应对rHBHAms提出效应记忆表型(84%)定义为CD45R0+CD62L (E)。
在一起,这些数据表明,响应由CD4 rHBHAm+t细胞effector-memory表型。
讨论
结核病研究的一个主要的挑战是开发一个新的免疫测试可以帮助区分,在QFT-IT对象响应中,那些能够控制Mtb复制(主题与远程LTBI最近感染结核病和过去的)从那些不能(活动性结核病患者疾病)。这种歧视将会非常有用,因为它将允许针对那些需要快速完整疗程治疗,从而避免在社区传播的感染。
在这项研究中,我们表明,尽管活动性结核病患者应对QFT-IT和另一个non-Mtb回忆抗原如巨细胞病毒、IFN-γ应对rHBHAms几乎缺席。此外,没有恢复记忆回应rHBHAms被发现在这些患者中,结果发现不同于使用其他Mtb-specific回忆抗原[23],[24]。知识我们首次表明,重组和甲基化HBHA Mtb生产m . smegmatis可以简单和廉价地生产,排除活动性结核病免疫原性和潜在的有用的t细胞在体外系统。因此,通过结合与rHBHAms QFT-IT得分结果,我们发现了一个潜在的两步免疫识别的方法在不同阶段的结核病。科目应对两种结核分枝杆菌抗原更容易能够控制复制(比如与远程LTBI,最近感染或过去TB),而那些只应对QFT-IT更有可能呈现活动性结核病。
在以往的研究中使用为期四天的PBMC的文化[10],这是表明,IFN-γ应对本机HBHA纯化牛分枝杆菌BCG LTBI有关,而这种反应几乎是失去了在活动性结核病,由于特定的抑制调控t细胞介导的[9]。因此分析提出了基于IFN-γ回应HBHA要么歧视LTBI主题从活动性结核病患者或增加的敏感性和特异性RD1-based干扰素释放[13]。然而,由于直接同源HBHA已确定在其他分枝杆菌物种,包括环境分枝杆菌[20]和波士顿咨询集团,因此积极IFN-γ反应HBHA在总量作为分母的主题。这发现了[12]的特异性HBHA-based化验是质疑。
在目前的研究中,我们实现了一个潜在的诊断算法依赖于证据确凿的结核分枝杆菌QFT-IT确定感染的能力[25]。因此在那些积极QFT-IT,我们使用HBHA作为一种工具来区分结核病的不同阶段。结果表明,长期的准确性测试,记忆的反应,主要措施[23]追求短期利益的报道相比,是更大的测试措施主要效应响应,通过流式细胞仪数据如下所示。基于这些结果,长期全血测定可能更准确识别那些活动性疾病(积极应对QFT-IT,消极应对rHBHAms)。此外,我们表明,接种卡介苗疫苗没有任何对HBHA IFN-γ反应的影响。事实上活动性结核病和过去的结核病患者,虽然呈现类似比例的总量作为分母个人(这表1),显示一个明显不同IFN-γ应对HBHA (图2 b)。
使用HBHA作为结核病生物标志物可能是至关重要的,例如在活动性结核病患者疾病,预测耐用(non-relapsing)与LTBI评估受试者的治疗成功或活化的风险[26]。这可能是最重要的风险更高的人口发展中活动性结核病,如hiv阳性个体、社区与结核患病率高[27],实验对象与类风湿性关节炎[5],或对那些活动性结核病的诊断和监测的病人或治疗可能很困难,如儿科患者[26]。专门针对这些问题进一步的研究将提供一个清晰的实用性QFT-IT / rHBHAms组合分析来识别不同结核病状况。
本研究的主要发现是,对HBHA t细胞的反应是定量和定性不同取决于感染的阶段。这是了不起的,因为我们可以测量一个定量差异QFT-IT响应集团最近感染的受试者和活动性结核病患者,而不是其他组调查。使用巨细胞病毒溶菌产物,也获得了类似的调查结果non-Mtb特定抗原,这表明区别不是Mtb-specific QFT-IT分析获得的数据。相反,IFN-γ诱导的分泌rHBHAms显著低于活动性结核病患者和获救后成功的抗结核治疗,结果如图所示的的主题与以往治愈结核病。这个开关的t细胞反应特别针对HBHA抗原表位被化验发现,测量两个效应和记忆反应(1 - 7天,天的测试)[23],这表明结核病的出现与一个重要HBHA-specific免疫反应的变化。它将感兴趣的理解是否HBHA表达式的调制期间被细菌感染可以引起这种变化在宿主反应和促进疾病进展,在动物模型研究显示[28]还是我们观察到的开关,是影响独立于HBHA在发病机制中的作用。
古典二分法与活动性结核病LTBI正在重新考虑一个连续和动态频谱的条件从感染疾病[2],[27]。这种频谱的结核病结果宿主免疫反应和病原体之间的交互,可以保持在一个动态和可变均衡了几十年。此外,在相同的结核病患者,不同病变从不育multi-bacillary疾病已经观察到,这表明整个光谱的结核病在同一个人可以共存[2],[27],[29]。在这个场景中,观察到宿主的免疫反应对单一抗原(HBHA)是依赖于特定的结核病的地位是至关重要的[3]。这项研究的结果强调的潜在效用rHBHAms作为结核病生物标志物在协会RD1-based干扰素释放。rHBHAms可以通过一个简化的协议,因此,如果这些数据证实在较大,盲法研究,实施在当前临床实验室设置可以变得可行和经济。总之,据我们所知,第一次我们表明,基于t细胞反应的重组和甲基化HBHA Mtb生产m . smegmatis在全血系统是免疫原性和潜在的有用的歧视活跃于稳定的疾病。还需要进一步的研究来提高分析的准确性和证明它的再现性。
材料和方法
研究人群
这项研究是伦理委员会批准的国家传染病研究所的l . Spallanzani (“Parere 18/2002”, INMI)和所有登记个人提供书面知情同意。入学后,人口统计学和流行病学信息是通过一个结构化的问卷收集的。
以下个人为:1)“远程LTBI”,个人得分积极TST和QFT-IT报道家庭或等效与痰检阳性肺结核患者密切接触的前3年招生;2)“最近感染”,个人家庭或相关报道与痰检阳性肺结核患者密切接触的前3个月,取得了积极的要测试和QFT-IT但还没有开始具体的预防;3)“活动性结核病”,个人从痰结核分枝杆菌诊断通过积极的文化或积极Mtb-specific RNA扩增(美国MTD测试、Gen-probe圣地亚哥)从活检标本和/或生物体液)在一个月内开始具体的治疗,取得了积极的QFT-IT;4)“过去的结核病”,记录患者培养阳性肺结核,他成功地完成了抗结核治疗(治疗完成时的culture-negative),考核从6个月到2年治疗后并取得积极QFT-IT时的研究。
检测呈阳性的个体人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体测试或在免疫抑制药物并不包括在这项研究。科目有潜在免疫介导性疾病也被排除在外。
甲基化HBHA的净化
甲基化重组HBHA被净化m . smegmatispMV3-38如前所述[21]。简单来讲,m . smegmatis表达histidine-tagged pMV3-38,全长HBHA的控制下hbh启动子,生长在Sauton媒体三天直到日志阶段了。细胞被离心收获,细胞溶解由声波降解法和细胞溶解产物受到镍层析(X-Press,英杰公司)。包含纯化蛋白的分数被分离在磷酸盐pH值7.0 (PBS)和集中使用Amicon Centricon离心过滤设备(美国微孔,贝弗利,MA)。批纯化蛋白1毫克/毫升的储存在−80°C到使用。
全血与rHBHAms酶联免疫吸附试验
天(短期)的反应。
0.5毫升的heparinised全血被播种在48-well板(康宁合演,康宁合并,纽约,纽约,美国)和处理phytohaemagglutinin (PHA) 5µg /毫升(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),5点rHBHAmsµg /毫升,除非不同表示,和人类巨细胞病毒抗原溶解产物从公元169年,在5µg /毫升(马里兰州哥伦比亚先进生物技术公司)。样本然后20 - 24小时孵化;上层清液然后收获和储存在−20°C到测试。
7天(长期)的反应。
我们使用前面描述的方法[23]。采血当天,短暂的整除heparinised血液稀释5倍使用RPMI 1640补充与青霉素、链霉素和2毫米谷酰胺(最后四产品从Euroclone有限公司、英国),镀成48-well板块(康宁合演)和刺激了如上所述。孵化后的第七天稀释浮在表面的是收获在37°C和储存在−20°C到测试。
执行分析的人被蒙蔽的临床地位正在测试样品。
表型和功能流式细胞仪分析
末梢全血细胞的表型和功能分析是由流式细胞术在一夜之间文化的存在与否完全培养基以下刺激:phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) 3 nM(美国赛瓦电泳GmbH,海德堡,德国)加上ionomycin (IONO) 1、5µM(美国赛瓦)作为积极的控制和rHBHAms 5µg /毫升。表达不同的标记染色以适当的组合评估的单克隆抗体(摩)直接共轭荧光染料:allophycocyanin (APC) -H7-conjugated anti-CD4;peridinin chlorophyll-protein (PerCP) -Cy5.5-conjugated anti-CD8;藻红蛋白(PE) -Cy7-conjugated anti-CD45RO allophycocyanin (APC)共轭anti-CD62L ((BD)生物科学,正欲从圣何塞美国)。检测细胞内细胞因子的表达,50µg /毫升Brefeldin(美国赛瓦),如前所述。简单地说,生产IFN-γ被染色以适当的组合评估摩押的直接共轭荧光染料(异硫氰酸荧光素(FITC)共轭反IFN-γ2 (BD)]。这些细胞被刺激在体外1天与anti-CD3 anti-CD28抗体2µg /毫升(BD)。数据采集和分析进行了流式细胞仪CantoII流式细胞分析仪(BD)使用FACSDiva软件(6.1.2版;双相障碍)。所有染色程序的isotype-matched负控制并行处理。
统计分析
研究的主要结果是评价IFN-γ生产抗原刺激,表示为连续(国际单位/毫升)或二分(正/负)措施。IFN-γ产量计算的值和差;Mann-Whitney U测试是用来比较成对比较的中位数;克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较不同组之间的中位数。得分的截止值定义的目的是-操作者特性分析(ROC);使用的x平方分布是二分的措施。SPSS 14 v为Windows(意大利SPSS Srl、博洛尼亚、意大利)和棱镜4软件(Graphpad软件4.0、圣地亚哥、钙、美国)被用于分析。在p值≤0.05差异被认为是重要的。在本研究中我们使用术语灵敏度的检测条件有活动性结核病”当我们测量的实际患有活动性疾病比例是正确的鉴别。我们使用术语“特异性”的检测条件没有活动性结核病”当我们测量的比例不正确鉴别活动性结核病。
作者的贡献
构思和设计实验:GD DG。下午进行了实验:AB TC OB。分析了数据:GD深圳女朋友TC VV GC DG。造成试剂/材料/分析工具:GD AB深圳下午DG。该报写道:GD DG。导致病人的登记:GC SG NM新兵DG。
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