抽象的
我们在韩国人群中综合癌症相关基因和肺癌综合列表中的潜在功能变体之间的关联。
在610名非小细胞肺癌患者和610名健康对照组中,使用Affymetrix定制基因芯片评估了1151个致癌基因的1969个潜在功能性单核苷酸多态性(SNPs)。在490例独立病例和486例对照中进行了重复研究。在发现集和复制测试中,有68个snp与肺癌显著相关。
在68个SNPs中,有3个SNPs(与rbpj1相互作用的共抑制因子(CIR1RS13009079T> C,核糖核苷酸还原酶M1(RRM1.) rs1465952T>C和溶质载体家族38,成员4 (SLC38A4) rs2429467C>T)在复制研究中始终显示与肺癌显著相关。在综合分析中,调整优势比CIR1RS13009079T> C,RRM1.RS1465952T> C和SLC38A4RS2429467C> T分别为0.69,0.71和0.73(P = 4×10−5在主导模型下分别为0.01和0.001。相对mRNA表达水平CIR1在正常肺组织中与Rs13009079t> C基因型显着相关(P趋势= 0.03)。
这些结果表明三个SNP,特别是CIR1rs13009079T>C,可能在肺癌发病机制中发挥作用。
抽象的
单核苷酸多态性CIR1,RRM1.和SLC38A4可能在肺癌发病机制中发挥作用http://ow.ly/zwj43033L9j
介绍
肺癌,主要是非小细胞肺癌(NSCLC),是全球癌症死亡的主要原因,5年生存率为16% [1].环境暴露,主要是吸烟烟雾,是肺癌的主要危险因素。众所周知,>90%的男性和75-85%的女性肺癌患者目前或以前有吸烟史,提示吸烟是导致大多数肺癌的原因[2].然而,在烟草吸烟者中只有~10-15%最终发生肺癌,表明遗传易感性等宿主因素可能在肺癌发病机制中发挥作用[3.,4].最近,基因组 - 宽协会研究(GWAs)已经确定了几个染色体区域,含有与肺癌风险相关的基因[5- - - - - -7],包括5p15.33、6p21.33和15q25.1。然而,GWAS的价值还受到一些主要问题的限制,如低可重复性、低可预测性和无法解释的遗传力[8,9].此外,GWAS结果的生物机制仍然不明确,因为GWA中鉴定的大部分变化可能不是因果关系[8].事实上,近90%的变体鉴定为GWAS中的表型相关的单核苷酸多态性(SNP)已经位于非基础或内读区域内,对其解释构成了障碍[10,11].
正常细胞向肿瘤状态的进化是一个典型的多步骤过程,累积多种遗传和表观遗传改变,共同导致癌症的特征:维持增殖信号,逃避生长抑制因子,抵抗细胞死亡,实现复制永生,诱导血管生成,激活侵袭和转移,以及其他两个新出现的特征,IE。能量代谢的重新编程和逃避免疫破坏[12].初期癌细胞需要连续获取这些特征,使它们能够成为致瘤和完全恶性,这可以解释致癌物的多步骤过程。尽管GWA已经确定了几种用于肺癌的遗传敏感性源位点,其未预期在肺癌发生中发挥作用,我们的期望是已知的基因的变体参与多个癌症发育和进展的群体可能有助于肺癌易感性。
在我们之前的研究中[13],我们报道了殖民刺激因子1受体(CSF1r.)RS10079250A> G,肿瘤蛋白P63(TP63) rs7631358G>A和与rbpj1相互作用的辅抑制因子(CIR1) rs13009079T>C可能在从不吸烟女性的肺癌易感性中发挥作用,这是一份癌症相关基因潜在功能多态性的综合列表。在目前的研究中,我们进行了一项病例对照研究,使用癌症相关基因中相同的SNPs综合收集,以确定与肺癌相关的基因多态性,该人群包括男性和女性,吸烟者和不吸烟者。
材料和方法
研究人口
一个发现组,总共包括在2008年1月至2010年6月在Kyungpook国家大学医院(Kyegu,Daegu,Daegu,Daegu,Daegu,Daegu,Daegu,2010年6月的610名。访问KNUH一般健康检查中心的志愿者并与年龄和性别案件相匹配。本研究由KNUH(KNUHBIO_09-1018)的机构审查委员会(IRB)批准,并从所有参与者获得书面知情同意书。韩国国家生物巴恩(NBK)提供了案件和管制的基因组DNA样本,由韩国卫生,福利和家庭事务部支持。在任何类型的抗癌疗法之前,在IRB批准的方案下获得了来自NBK的所有材料,包括全身化疗。使用Quickgene-810系统(富士夫,日本,日本)从外周血淋巴细胞中提取基因组DNA。所有案例和控制主体都是韩国人。在一组独立的病例和对照科目中进行复制研究。共有490年7月至2012年7月诊断为KNUH诊断的NSCLC患者。在复制研究的486个对照中,由135名受试者的基因组DNA样本由NBK和331提供,韩国生物安工程(4851-307,KBP-2011-24)和韩国基因组和流行病学研究(4845-302)由韩国疾病控制和预防的中心支持。
多态性选择和基因分型
我们使用公共数据库选择了本研究的SNP,如前所述[13,14].简而言之,我们选择了从萨布斯科的数据库中参与癌症相关途径的1784个候选基因(www.sabiosciences.com/Cancer.php;在线补充表S1)。使用DBSNP公共数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/snp.)筛选所有可能具有功能的SNPs,本研究共收集了日本HapMap-JPT (Japanese in Tokyo, Japan)资料中少量等位基因频率≥5%的4215个SNPs。其中,1151个基因中的1969个SNPs使用Affymetrix定制的基因芯片进行了基因分型,因为其他SNPs无法应用于该平台。发现集中捕获的snp和基因型snp列于在线补充表S1。为了验证,在重复研究(在线补充表S2)中使用Sequenom的MassARRAY iPLEX检测(Sequenom, San Diego, CA, USA)对发现集中基因型分布p<0.05的68个SNPs进行了检验。为了质量控制,对病例/对照状态进行“盲”基因分型分析。在验证组中,大约5%的样本被随机选择再次进行基因分型。结果一致性100%。
RNA制备和定量逆转录- pcr
CIR1,RRM1.和裂缝和裂缝和增强者分裂同源物 - 1(hes1)通过定量逆转录PCR检查mRNA表达水平。使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,Ca,USA)分离来自肿瘤和成对的非血管肺组织(n = 107)的总RNA。使用Sybr绿色检测的实时PCR使用LightCycler 480(Roche Applical Science,Basel,Switzerland)与Quantifast Sybr Green PCR主混合物(Qiagen,Hilden,德国)进行。使用以下基引物进行实时PCRCIR1,RRM1.和β-肌动蛋白基因:CIR1向前,5“-AGATCAGCCCTTTGGTATTCAG-3”;CIR1反向,5'-ccgaacttgcattgattcag-3';RRM1.前进,5'-AccGcccacaacttttag-3';RRM1.相反,5“-CCAGTAGCCCGAATACAACTC-3”;hes1前进,5'-aacgcagtgtcaccttcc-3';hes1反向,5'-tcaagttcctgtttagagtccg-3';β-肌动蛋白基因前进,5'-Atgctatcacctccccctgtgt-3';β-肌动蛋白基因反向,5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3'。每个样本都副本运行。相对CIR1,RRM1.和hes1以β-肌动蛋白表达量为标准,用2-ΔΔCt方法 [15].
统计分析
使用T检验和CHI方检验进行比较病例和控制,以及用于连续变量和分类变量。通过使用具有1度自由度的Chi-Squared测试的观察和预期的基因型频率进行比较来测试Hardy-Weinberg平衡。无条件的逻辑回归分析用于计算可能的混淆因子(性别作为名义变量的性别的混淆因子(性别为连续变量的年龄和包装多年的年龄和包装多年)的差异比率(或者)和95%的置信区间。P <0.05,差异被认为是统计学意义。所有分析都是使用SAS进行Windows版本9.2(SAS Institute,Cary,NC,USA)。
结果
患者特征和临床预测因子
在发现和验证集中给出了病例和对照受试者的临床特征表格1.两组案件和控制之间的年龄和性别没有显着差异。然而,与两组中的对照相比,案例包括在多变量逻辑回归分析中调整的两组中的吸烟者。发现套装包括33.4%鳞状细胞癌和47.9%的腺癌,验证分别设定了40.8%和43.9%。
多态性与肺癌风险之间的关系
在发现集合中评估的1969年SNP中,由于以下原因,668被排除在外:1)86失败的基因分型,2)283具有基因型呼叫率<95%,3)201,具有次要等位基因频率<5%或4)98在对照中偏离Hardy-Weinberg均衡(P <0.05)。因此,分析了863个基因中的1301个SNP,用于结合研究。所有SNP的48%位于启动子地区,24%的外显子(非型SNP),16%的外显子/内界,6%在5' - 未翻译的地区,6%,3年内有6%。
在发现集合中评估的1301个SNP的中,68个SNP与肺癌显着相关(P <0.05),如在线补充表S2所示,并在独立的490例和486个控制中测试了复制研究。在验证集中,三个SNPS(CIR1rs13009079T>RRM1.) rs1465952T>C和溶质载体家族38,成员4 (SLC38A4)RS2429467C> T)在调整年龄,性和吸烟时,始终如一地与肺癌的肺癌展示相同的关联(表2.).在对发现和复制队的组合分析中,CIR1RS13009079T> C,RRM1.RS1465952T> C和SLC38A4RS2429467C> T与肺癌的风险显着降低(调节或0.69,95%CI 0.58-0.83,P = 4×10−5;调整或0.71,95%CI 0.55-0.92,P = 0.01,调整为0.73,95%CI 0.62-0.87,P = 0.001,P = 0.001,在主导模型中)。在114名腺癌患者中,其表皮生长因子(表皮生长因子受体)可用突变试验结果(通过直接测序测试24.6%阳性),表皮生长因子受体突变状态与三个SNP中的任何一种的基因型没有显着相关(未显示的数据)。我们在发现和验证集之间没有观察到任何重要的异质性。
SNPs对mRNA表达的影响
为了识别SNP的功能效果,我们评估了基因型之间的关系CIR1RS13009079T> C和RRM1.rs1465952T>C和mRNA在肿瘤和配对的非恶性肺组织中的表达。的CIR1肿瘤组织中表达水平显着低于非正射组织(P = 0.02;图1A).相比之下,RRM1.肿瘤组织的表达水平显着高于非中性组织(P = 4×10-10;图1B.).的相对表达水平CIR1在正常肺组织中与Rs13009079t> C基因型显着相关(P趋势= 0.03;图1C.).然而RRM1.rs1465952T>C基因型间表达水平无显著差异(数据未显示)。我们进一步研究了CIR1mRNA表达与mRNA表达水平相反hes1,这是Notch信号通路的最研究目标之一,并且在细胞周期,增殖,分化和生存和神经元,内分泌,T淋巴细胞祖细胞祖细胞以及各种癌症中起重要作用的重要作用[16].相比CIR1表达,水平hes1肿瘤的表达显着高于正常的肺组织(P = 0.0004;在线补充图S1)。但是,如在线补充图S1所示,CIR1mRNA表达没有显示出显着的反向相关性hes1mRNA表达(Pearson相关系数= 0.14,p = 0.14)。除此之外hes1mRNA表达水平依据没有显着差异CIR1RS13009079T> C基因型(数据未显示)。
讨论
我们评估了863个候选基因中的1301个SNP,可能涉及致癌作用,以鉴定使用Affymetrix定制的GeneChip在发现集中的Affymetrix定制的Genechip相关的遗传变异,并将结果复制在验证集中。三个snps(CIR1RS13009079T> C,RRM1.RS1465952T> C和SLC38A4RS2429467C> T)始终与两项研究套装的肺癌相关联。此外,本研究提供了证据,证明RS13009079T> C是影响mRNA表达的功能性SNPCIR1基因使用临床样品。这些研究结果表明,三个SNP,特别是CIR1rs13009079T>C,可能在肺癌发病机制中发挥作用。
在三个SNP中(CIR1RS13009079T> C,RRM1.RS1465952T> C和SLC38A4rs2429467C>T)与肺癌显著相关,CIR1RS13009079T> C显示最重要的关联。有趣的是,我们以前确定过CIR1rs13009079t>肺癌中的肺癌,非吸烟女性肺癌[13].目前的研究在包括男性和女性、吸烟者和不吸烟者的一组实验对象中复制了这种关联。临床标本的mRNA表达进一步支持了其功能特性CIR1RS13009079t> c。CiR1是一种进化保守的蛋白质,其是C启动子结合因子1的组分(CBF1,用于免疫球蛋白Kappa J区(RBPJ))介导的转录核心压缩机复合物[17].CIR1与复合物的其他成分结合到组蛋白去乙酰化酶(HDAC)上,参与将HDAC招募到dna结合的CBF1上,作为CBF1和HDAC复合物之间的连接物[17,18].含有HDAC的核心压力络合物,然后导致靶基因的转录抑制。CBF1是陷波信令中的中心效应器[19,20.],在许多癌症中具有吸诵。包括肺癌[21,22].越来越多的证据表明,在没有Notch信号的情况下,CBF1会抑制Notch靶基因的表达,但刺激Notch受体会导致CBF1功能从抑制因子转变为激活因子[18,19,23].因此,CiR1参与Notch靶基因的转录调节作为CBF1介导的核心化合物的组分。基于核心压缩机在转录调节中的作用,它们改变的表达或功能可能有助于异常信号传导,导致靶基因的失调转录,其与许多癌症有关[24].尽管关于CIR1在癌症发病机制中的作用知之甚少,但CIR1功能的改变可能导致异常的信号通路,包括Notch信号,从而导致癌症的发展。在本研究中,CIR1与正常肺组织相比,肿瘤组织中的mRNA表达显著降低,这与来自癌症基因组图谱数据库(Cancergenome.nih.gov.;数据未显示),提示CIR1在非小细胞肺癌中具有潜在的肿瘤抑制功能。一致的是,与肺癌风险降低相关的变异C等位基因显示出更高的水平CIR1mRNA表达与临床样品中的含量相比。相比CIR1表达,水平hes1肿瘤中的表达显着高于正常的肺组织。但是,之间的反向相关性CIR1和hes1没有观察到表达,可能是因为cir1不直接抑制hes1mRNA的表达,但作为CBF1复合体的组成部分依赖于Notch信号。此外,其他途径,如Hedgehog和Wnt信号通路也进行调控hes1表达。应该指出的是,各种信令途径和HES1之间的复杂交叉谈话,这是依赖于上下文和细胞的,调节hes1表达 [16].CIR1在肺癌发病机制中的作用有待进一步研究。
RRM1.在DNA修复中发挥重要作用以及其合成以及作为肿瘤抑制基因的作用,是恶性肿瘤表型的重要决定因素[25- - - - - -28].因此,RRM1的改变表达可能影响DNA修复能力和肿瘤抑制功能,从而影响癌症的风险。具有高RRM1表达的NSCLC患者与术后的生存率明显更长,与患有低表达的人相比[28- - - - - -30.].相比之下,RRM1的高表达与NSCLC含有含吉西他滨化疗治疗的患者的减少和差的存活相关[30.- - - - - -33],符合DNA修复基因的“双刃剑”特性。遗传多态性RRM1.还与肺癌患者的临床结果有关[34,35].在这项研究中,RRM1.rs1465952T>C与肺癌风险显著降低相关。据报道RRM1.rs1465952T>C位于推测的p53应答元件中,C等位基因与p53的结合比T等位基因更强[36,37,表明C等位基因可能导致更高的p53-DNA结合和反式激活能力,以应对DNA损伤,这与我们发现的降低肺癌风险的发现相关。SLC38A4转运阳离子和中性氨基酸,主要在肝脏中发现。目前还没有明确的证据表明SLC38A4在致癌过程中有任何作用。基于PolyPhen算法[38],SLC38A4RS2429467C> T(arg29gly)可能是良性的变化。需要进一步的研究来了解生物学功能SLC38A4在癌症中,并确认SNP与肺癌风险之间的关联。
在这项研究中,关联之间CIR1RS13009079T> C,RRM1.RS1465952T> C和SLC38A4RS2429467C> T和肺癌在独立的一组患者中令人信服地复制,这将为遗传关联研究的结果提供信心[39,40].但是,应考虑我们研究的几个限制。首先,由于目前研究的所有科目来自一个国家,我们的结果需要在不同的祖先中的不同群体中核实。其次,虽然在这种情况下对照研究中发现的三个SNP可能有助于肺癌发生遗传易感性,但它们不能被认为是肺癌的真实遗传决定因素,因为对已经被诊断为NSCLC的患者进行了分析。然而,对肺癌的遗传决定因素进行研究是不切实际的,这涉及涉及数千个健康的受试者,然后比较在后期肺癌的那些人之间的结果以及保持健康的人。第三,在我们研究中发现的三个SNP可能并未在其他研究中显示出具有肺癌的重要组织。根据研究的这种关联的复制通常由于样本尺寸不足而具有不足的统计功率和/或观察到的关联的幅度,不同的遗传结构(IE。群体或偏见的研究设计中的联动不平衡)[40].有必要精心设计和适当的动力研究,包括不同祖先的不同植物的群体,以验证我们的研究结果。最后,一些关联处于边际水平的统计学意义,以避免由多种比较产生的假阳性关联,可能是因为两个队列的适度样本量没有最佳的统计功率[39].但是,mRNA表达数据支持之间的关联CIR1RS13009079T> C和肺癌,虽然本研究没有提供CIR1在肺癌发展中的作用的直接证据。
综上所述,本研究表明,这3个snp,尤其是CIR1RS13009079T> C,与肺癌显着相关,表明它们在肺癌发病机制中的作用。未来的研究是关于这些基因在肺癌开发和进展中的生物学作用,了解SNP和肺癌之间关联机制的生物学作用。
脚注
本文提供了补充材料www.qdcxjkg.com.
支持声明:本研究得到了国家研发计划癌症控制,卫生和福利部(0720550-2)的支持。
利益冲突:无声明。
- 收到了2015年12月4日。
- 接受2016年7月1日。
- 版权所有©2016