文摘
病毒性疾病严重性细支气管炎在婴儿期很难预测,并与宿主先天免疫。这项研究旨在探讨先天细胞因子interleukin-15 (IL-15)作为疾病严重程度的标志。
未来只有观察性研究是在一个大学附属儿科教学医院进行的,比较儿童病毒性毛细支气管炎(0-18个月)住院,那些承认儿科重症监护室与严重疾病和健康的年龄组。IL-15-related参数组之间的比较。PCR和微rna (microRNA)测序进行自然杀伤(NK)细胞收集的研究参与者。
样本88名儿童病毒性细支气管炎和43控制了2009年和2012年之间进行分析。外周血单核细胞(PBMC) IL-15 mRNA表达明显高于那些温和的严重性毛细支气管炎与控制和那些有严重的疾病。血清IL-15水平与疾病严重程度相关。在外周血NK细胞的相对频率显著降低毛细支气管炎的参与者。NK细胞microrna的转录组在毛细支气管炎是不同的。的目标汽车microrna在毛细支气管炎表达有差异,包括JAK3,STAT5A和NFKB1在IL-15信号通路。
IL-15与疾病严重程度与病毒细支气管炎住院儿童。
文摘
Interleukin-15影响宿主先天反应,在细支气管炎病毒与疾病严重程度有关http://ow.ly/S5JfP
介绍
病毒婴儿毛细支气管炎是最常见的单一原因住院在发达国家和全球儿童下呼吸道感染的主要原因(1]。在2岁以下儿童常见和最常引起呼吸道合胞病毒(RSV) [2]。疾病的频谱范围从无症状感染到严重疾病与呼吸衰竭需要儿科重症监护室针对新生儿重症监护室医生(儿童重症监护室医生)承认对呼吸机支持(2,3]。有些孩子有易感风险因素,但大多数的那些针对新生儿重症监护室医生要求儿童重症监护室医生承认以前健康(4,5]。识别可能患严重疾病的孩子是困难的和进一步受到缺乏可靠的实验室预测疾病。
证据从功能和遗传关联研究表明病毒细支气管炎疾病严重性受到主人的先天免疫反应(6,7]。自然杀伤(NK)细胞是先天淋巴细胞抗感染,“第一反应者”(8]。这种快速反应的能力凸显出其重要性在急性呼吸道感染9- - - - - -11]。NK细胞也随后形状自适应免疫反应(12,13]和失败的反应可能会构成严重的疾病,所建议的尸检例致命的病毒研究毛细支气管炎(14]。
淋巴细胞内稳态是由一个家庭的白细胞介素(ILs)共享一个公共γ-chain受体(γc)和调解的影响增加的抗凋亡蛋白的表达,包括bcl - 2和Bcl-xl(15]。尤其是IL-15,调节NK细胞发展和激活状态(16,17,曾被与住院的风险对病毒毛细支气管炎(6,18]。初步工作检查小组天生的细胞因子在病毒性细支气管炎还演示了IL-15水平和疾病之间的关系(19]。
我们提出IL-15在病毒细支气管炎疾病严重程度的一个标志,遗传变异可能影响宿主IL-15通路和IL-15影响疾病严重程度对NK细胞通过其影响。
方法
研究参与者
我们进行了只有,前瞻性观察研究在连续呼吸道病毒季节(11月至3月)从2009年到2012年在孩子们的大学医院,都柏林(CUH),三级水平儿科教学医院,和相关的新生儿的圆形大厅里铺妇产科医院的门诊部,都柏林。原本健康的爱尔兰白人种族的孩子18岁以下的几个月连续住院的病毒性细支气管炎都被登记了。史的儿童慢性疾病或免疫缺陷和儿童免疫抑制剂被排除在外。无症状,年龄组,呈现常规放血或小day-case手术,被录取,受到类似的排除标准为例。写父母/监护人的知情同意得到研究参与者。的研究伦理委员会CUH和圆形大厅医院,都柏林批准了这项研究。
研究过程
毛细支气管炎患儿都是参加CUH。临床和人口统计信息收集的采访父母/监护人和检查医疗记录。孩子被分类为“严重”细支气管炎如果他们的条件被认为是针对新生儿重症监护室医生参加儿科医生和intensivist价值儿童重症监护室医生承认正压机械呼吸机支持和归类为“温和”的严重性,如果孩子被照顾标准住院病房。进一步验证这种分类、疾病严重程度也是衡量使用临床分数称为呼吸窘迫评估工具(RDAI) [20.]。RDAI计算在每一次的招生点相同的调查员(T.R.L.)。病毒感染是在研究参与者使用确认直接荧光抗体染色的鼻咽吸入和/或多路复用呼吸道病毒实时逆转录PCR的鼻咽拭子(21]。执行一次放血,入学后不久,通常在入学1或2天。临床结果测量包括住院时间,针对新生儿重症监护室医生需要补充氧气,儿童重症监护室医生住院和机械通风。
IL-15-related分析
外周血单核细胞(PBMCs)的密度梯度离心法提取每个参与者的EDTA实际上样本收集和定量实时PCR (qPCR) IL-15 mRNA水平进行如前所述[22]。血清得到从全血凝结的室温和IL-15水平由ELISA测定。
流式细胞术
淋巴细胞表型出现在执行CyAn-ADP流式细胞分析仪仪器和分析使用Dako峰会软件(美国贝克曼库尔特,帕萨迪纳市,CA)。淋巴细胞亚群和表面的相对频率的表达IL-2/15Rβ检查。细胞内IL-15生产和Bcl-x IL-15-related凋亡bcl - 2蛋白的表达l在不同的淋巴细胞种群子集也是衡量。绝对数字是从PBMC计数进行外推在每个示例使用纽鲍尔血球计。
NK细胞微RNA(核糖核酸)转录组和目标基因mRNA分析
确定病毒毛细支气管炎患儿的NK细胞表型是microrna基因表达模式的改变、NK细胞分离与RSV-positive PBMCs六个婴儿毛细支气管炎和6个年龄组,和小非编码RNA的转录概要文件使用基因测序相比固体4下一代测序(上天)平台(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA) (23]。生物信息学microrna的测序数据的分析确定microrna在毛细支气管炎患儿差异表达。统计分析是使用开源软件DESeq2.0 Bioconductor (http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)。它使用一般线性回归模型与负二项分布来识别差异表达基因。生的假定值调整为多个比较使用Benjamini-Hochberg方法。这些microrna基因已知的目标被确定通过交叉引用miRWalk [24]。这些基因,已知与控制炎症反应有关,选择和他们相比,NK细胞表达学习小组之间使用TaqMan(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA) qPCR化验。
数据分析
描述性分析,意味着±扫描电镜中位数(四分位范围(差)和频率分布是用来总结参与者的基线特征。的数据,除非另有说明,非参数;学习小组(控制、中度、重度)相比,使用Wilcoxon或克鲁斯卡尔-沃利斯排名和测试,测试后对比的中度和重度组使用邓恩的多重比较检验。使用斯皮尔曼等级相关系数的相关性进行评估。逐步逻辑回归模型应用于确定临床特征相关的独立IL-15 mRNA表达和血清IL-15水平。p < 0.05被认为是具有统计学意义。执行统计分析使用JMP®(SAS、卡里、数控、美国)软件包。
更多细节的方法是可用的在线补充材料。
结果
临床和人口特征
在这项研究中,88名儿童与毛细支气管炎和43控制被录取。招生发生在三个呼吸道病毒的季节了图1。在2009/10和2010/11的呼吸道病毒的季节,66病毒毛细支气管炎患儿和30控制被成功录取。他们的基线特征总结表1。61个孩子RSV-positive毛细支气管炎(92%)包括四个孩子合并感染。E1病毒学研究结果总结在网上补充表。22岁的66名儿童有严重的疾病。比较儿童中度和重度疾病提出了表2。从第二部分收集的样本研究参与者(13控制,22个孩子RSV-positive细支气管炎)参加2011/12用于NK细胞microrna的测序和NK细胞信使rna PCR。四个22个孩子已经合并感染(三个鼻病毒,两个冠状病毒)。归纳了它们基线特征补充表E2和E3。
PBMCs IL-15 mRNA表达和血清IL-15水平
qPCR表现出显著增加IL-15 PBMCs的毛细支气管炎患儿mRNA水平(p < 0.0001)。中等严重程度细支气管炎的参与者表达显著高于控制(p<0.0001)或患有严重疾病的儿童(p=0.01)(图2和补充表E4)。IL-15蛋白质含量作为衡量血清指标的使用ELISA (图2和补充表E4)显示在从控制到中等水平显著增加(p=0.0009)和从中度到重度的毛细支气管炎(p=0.005)。
单变量分析中确定包括潜在的混杂因素表1和2(母乳喂养,接触烟草烟雾(ETS)和早产)(补充表E5)执行,建议ETS和IL-15 mRNA表达之间的关联(p=0.02)。不过,这种关联并不保留在多元逐步逻辑回归模型中,确认的独立性之间的关系IL-15 mRNA表达和毛细支气管炎的发生(补充表E6;p=0.0003)及其严重程度(补充表E7;p=0.009)。
早产(<妊娠35周)被发现通过单变量分析与降低血清IL-15水平显著相关(补充表E5;p=0.03)。然而这个协会的统计学意义不是保存在多变量分析,证实了血清IL-15水平之间的关系的独立性、毛细支气管炎的发展(补充表E6;p=0.0002)和严重疾病(补充表E7;p=0.004)。
实足年龄出生时也检查作为一个潜在的糊涂。出生时没有实足年龄之间的相关性和IL-15 mRNA表达(ρ斯皮尔曼ρ= 0.185,p > 0.1)和血清IL-15水平ρ(斯皮尔曼ρ=−0.01,p > 0.94)都具有统计学意义。
淋巴细胞表型出现
总PBMCs和淋巴细胞的浓度之间的比较这三个学习小组(补充表E8)。有一个显著的减少NK细胞的相对频率(p = 0.008)毛细支气管炎患儿外周血中与对照组相比(补充图E1)。IL-2/15Rβ主要表达在NK细胞和t细胞经常明显多于(54%与2%;p < 0.0006)。
细胞内IL-15表达式
的细胞来源IL-15 PBMCs是探索使用细胞内细胞因子染色,最初关注单核细胞(CD3- - - - - -CD14+),后来通过检查树突状细胞(DC)的人口,LIN1浇注−HLA-DR+人口PBMC。骨髓的相对分布(CD11c+),血浆(CD123+)和双重否定(DN) (CD11c- - - - - -CD123- - - - - -)DCs E9补充表所示。值得注意的是,毛细支气管炎患儿有更高比例的DN DCs (p = 0.016)和的比例显著降低血浆DCs (p = 0.001)。比例的血浆DCs严重组又显著降低(p = 0.017)。DN DCs IL-15的主要来源(图3补充表E9)和IL-15表达式是一个大大大比例的DN DCs在那些与毛细支气管炎(p = 0.008)。在儿童病毒性毛细支气管炎(n = 6)和控制(n = 2),细胞内的表达IL-15在单核细胞几乎检测不到(平均0.7%的细胞,差0.5 - -1.4%)。
表达IL-15-related凋亡标记
细胞内的表达Bcl-xl在CD4显著更大吗+CD8 t细胞(p = 0.007)+t细胞(p = 0.03)和NK细胞(p = 0.003)的婴儿毛细支气管炎(补充表E10汽油和图4)。此外,细胞内Bcl-x强度l染色与IL-15的血清浓度,特别是在NK细胞(枪兵ρ= 0.75,p = 0.0051)。在毛细支气管炎患儿,在CD4细胞内bcl - 2的表达明显更高+t细胞(p = 0.03), CD8 bcl - 2细胞内增加的趋势+t细胞(p = 0.08),但不是在NK细胞。
RSV病毒载量对疾病严重程度和免疫的影响参数
使用PCR循环阈值(CT)值作为替代措施的RSV病毒载量,我们没有发现任何相关(枪兵ρ= 0.03,p = 0.86)和疾病严重程度(RDAI)。然而,有轻微的趋势降低NK细胞比例(枪兵ρ=−0.33,p = 0.11),高血清IL-15(枪兵ρ=−0.22,p = 0.18)和IL-15 mRNA表达(枪兵ρ=−0.21,p = 0.2)较低的CT值。
讨论
我们证明,我们所知,第一次住院儿童疾病严重程度之间的关联与病毒细支气管炎和1)PBMCs IL-15 mRNA表达,2)IL-15血清浓度。我们确定的来源在PBMCs IL-15分组人口扩张的DCs在病毒细支气管炎,以及报告关系IL-15水平和细胞内凋亡bcl - 2蛋白的表达和Bcl-xl在毛细支气管炎患儿淋巴细胞。我们发现了一种独特的NK细胞microrna的表达模式在毛细支气管炎和微分表达式选择假定的mRNA的目标,其中IL-15通路中的信号分子的基因。
病毒毛细支气管炎患儿在我们组展示upregulation IL-15 mRNA表达IL-15 PBMCs和增加血清水平。这是符合一个适当的先天免疫反应的病毒感染,因为它促进了NK细胞的活化和招聘到肺部。然而,尽管有一个增加IL-15的血清浓度与疾病严重程度增加,相比之下重症毛细支气管炎患儿的研究没有证明upregulation PBMC IL-15 mRNA的表达。可能会有许多解释缺乏血清IL-15水平之间的相关性和PBMC IL-15 mRNA表达严重细支气管炎。首先,所有细胞,血清IL-15反映生产水平而IL-15 mRNA表达,在我们的实验中,衡量反映提取PBMC中只有mRNA的表达。的差异也反映了一个自我平衡的措施。IL-15表达式在mRNA水平,严格监管的NK细胞的激活可能有害影响和已被证明导致肺纤维化小鼠模型(25]。此外,IL-15产生的抗原递呈细胞(apc),如DCs和单核吞噬细胞在PBMC舱与IL-15Rαtrans-presented共同目标细胞,使靶细胞的较低层次的生理反应IL-15 [26]。因此,PBMC IL-15 mRNA表达比多发地细胞可能更谨慎监管。
另外,未能上调IL-15 mRNA表达可能代表的证据“immunoparesis”那些重症毛细支气管炎患儿,类似于证明了我们研究小组在脓毒症和肺炎其他病人组(27]。Immunoparesis在这种情况下可能是基因介导,至少部分解释遗传易感性重症毛细支气管炎见过一些儿童(28]。支持这一假设来自遗传协会发表的研究开展和我们的同事在乌得勒支,荷兰(6]。在同类研究中最大的一个,Janssenet al。(6]显示整个协会的先天免疫基因与遗传易感性RSV感染的候选基因研究480名住院儿童和> 1000控制。其他相关的位点,它们显示的名义与等位基因IL15基因变异rs2254514(1.02或1.22,95% CI -1.46;为RSV p = 0.026)和住院治疗。有趣的是,rs2254514是另一个代理IL15SNP rs6837991(连锁不平衡;r2= 0.87),RegulomeDB (http://www.regulomedb.org/)得分1 f (即。它可能会影响IL15基因表达)。协会因此,虽然很弱,由于权力的原始研究的局限性,有推理的证据基因与RSV易感性的关系IL15表达式[29日]。最后,缺乏PBMC IL-15 upregulation严重细支气管炎可能反映了病毒致病性的影响。RSV,例如,已被证实感染人类monocyte-derived DCs在体外随后激活,损害他们的能力和t细胞增殖30.]。类似的现象可以解释本研究的发现。
IL-15尤为重要,对NK细胞内稳态和激活(31日]。我们提出严重的毛细支气管炎患儿在APC-IL-15-NK细胞轴缺陷预防的发展主管先天反应呼吸道病毒感染。这可能占NK细胞在肺组织的缺乏在解剖研究的孩子死于严重的病毒性毛细支气管炎(32]。淋巴细胞表型出现通过流式细胞仪显示的相对比例显著下降的儿童外周血NK细胞出现在毛细支气管炎。而值得注意,类似的发现报道之前(33]。此外,Larranaga等。(34]报道NK细胞亚群的变化,尤其是不受监管的CD94+激活NK细胞,与疾病严重度相关RSV细支气管炎。NK细胞的变化和分布可能代表封存子集激活NK细胞的感染,而不是细胞凋亡。支持这一猜想,我们发现增加IL-15-related凋亡标记Bcl-x的表达式l在淋巴细胞(包括NK细胞)在毛细支气管炎患儿。相比之下,bcl - 2表达不是调节NK细胞的毛细支气管炎患儿。这一发现的意义需要进一步探索一个更大的群体。
我们发现了一个族群的DCs PBMCs IL-15的来源的婴儿和儿童中发现这个群体是扩大与毛细支气管炎。这个反对细胞消耗降低重症毛细支气管炎IL-15 mRNA的解释。DCs是已知IL-15的细胞来源,但直流子集的变化分布和IL-15生产在毛细支气管炎患儿没有先前报道(35]。
结果qPCR、ELISA和流式细胞仪实验让我们屏幕微分microrna的表达与RSV NK细胞的婴儿毛细支气管炎,microrna正在日益被视为核心NK细胞功能(36]。我们观察到,NK细胞与RSV的婴儿表现出明显的microrna的表达模式。即使我们有限的样本在每个组(n = 6),统计上显著差异检测使用目前的分析方法(37]。
生物信息学分析发现公认的目标对这些管制microrna基因。微分表达式选择目标基因的确认在中度和重度的毛细支气管炎患儿的NK细胞。这些差异表达基因目标包括基因调节细胞的激活和扩张;值得注意的是STAT5A,JAK3和NFKB1,对蛋白质编码IL-15 /γc信号通路,加强IL-15与疾病严重程度的假设RSV毛细支气管炎(38]。
的microrna的表达模式特征的NK表型毛细支气管炎患儿不同于那些在先前的报道在体外研究由γNK细胞被激活c细胞因子和IL-15 [- 223,39]。然而,在体外实验的NK细胞的激活可能不反映临床疾病过程的复杂性。在这方面,我们的研究增加了可用的NK细胞文学,小说提供了一个洞察因子调节NK细胞活化与病毒感染婴儿。
我们的研究也有一些局限性。只有学习,我们招募大量的能力有限,限制了我们的学习的力量。我们试图减轻这种风险,与同事合作在荷兰,他获得一个更大的患者群,报告之间的联系IL-15单核苷酸多态性(snp)和疾病严重程度。这种方法有局限性,因为病人群组是截然不同的和被独立的调查。然而,我们认为荷兰队列的大尺寸增加了相当大的力量IL-15的结论从较小的研究基因的表达。一些潜在的混杂因素,特别是在出生时胎龄,母乳喂养率和ETS,区分那些中度和重度组。然而,疾病之间的联系和IL-15时保持这些混杂因素是占在多变量分析。小卷的血液来自患者招募,这意味着并不是所有的测试可以对每个病人进行样本。相关的技术挑战从小卷的血液中提取足够的microrna包含相对较少的NK细胞引入偏见到测序数据的元素,就像那些最严重的疾病最少的NK细胞,阻碍他们的分析。这杜绝一个探索之间的关系NK细胞米尔,疾病进展和解决。 The results of miRNA transcriptomal screening involving multiple comparisons and performed in relatively small numbers of patients are inferential in nature. To validate these inferential transcriptomal findings, we confirmed differential expression of miRNA target genes in NK cells. As with all biomarker studies, external validation of these findings in cohorts from different patient populations using different assays and platforms is needed.
SNP分析,尽管有这些限制,数据获得qPCR, ELISA、流式细胞术和门店之间的所有建议协会IL-15儿童和疾病严重程度与病毒细支气管炎住院。这可能会促使研究小说RSV疫苗和治疗策略。这还需要进一步的研究来检查其他γ的相对影响c细胞因子在疾病严重度RSV细支气管炎,以及其他的具体贡献先天细胞临床表型。
确认
作者要感谢父母的商誉的研究参与者,CUH和圆形大厅工作人员的医院,和许多儿童基金会的筹款活动健康,没有他们这项研究不可能完成。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究由儿童基金会资助的健康,孩子的大学医院,都柏林(PAC0934)和健康研究委员会(高通滤波器/ 2011/017)。为这篇文章一直存放在资助信息FundRef。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2015年4月23日。
- 接受2015年7月29日。
- 版权©2016人队