抽象的
哮喘患者展示了气道中的促凝血状态的证据,伴有抗凝血蛋白C系统的损害。我们旨在研究重组人活化蛋白C(RHAPC)在过敏性哮喘患者中的作用。
我们在房屋粉尘(HDM)过敏性哮喘患者中进行了随机,双盲,安慰剂控制,概念概念研究。患者随机接受静脉内RHAPC(24μg·kg-1·H-1;N =12)或安慰剂(N =12)治疗11小时。输液开始4小时后,进行第一次支气管镜检查,用生理盐水刺激一侧肺段(对照组),用HDM提取物和脂多糖(HDM+LPS)组合刺激对侧肺段,从而模拟室内环境粉尘暴露。支气管内激发8小时后进行第二次支气管镜检查以获得支气管肺泡灌洗液(BALF)。
rhAPC不影响HDM+LPS诱导的肺促凝变化。相比之下,相对于安慰剂,rhAPC降低了BALF白细胞计数43%,这是由于对中性粒细胞内流的抑制作用(减少64%),而对嗜酸性粒细胞内流保持不变。rhAPC还减少了气道中的中性粒细胞脱颗粒产物。
在过敏性哮喘患者中,静脉注射rhAPC可通过不依赖凝血抑制的作用减少HDM+ lps诱导的中性粒细胞迁移和蛋白释放。
抽象的
重组活化蛋白C减轻过敏原诱导的中性粒细胞迁移到哮喘患者的支气管肺泡空间http:///wly/rsevw.
介绍
哮喘是一种阻塞性呼吸道疾病,伴有复发性呼吸困难的症状,喘息和胸部紧张[1].严重的过敏性哮喘的特征在于嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的混合气道浸润[2].在哮喘患者的一个重要亚群中,慢性变应性肺炎症可能导致不可逆的肺损伤、频繁的哮喘加重和皮质类固醇无反应[1].因此,存在高迫切性的是,开发新的抗炎治疗策略,从而改善过敏性肺炎。
促成过敏性肺炎症伴有肺癌促血糖和抗纤维蛋白溶解环境[3.].关于哮喘中过敏性肺炎症和凝血之间的相互作用,抗凝蛋白C系统受到了特别的关注,因为它既影响炎症又影响凝血[4.].活化蛋白C (Activated protein C, APC)是蛋白C系统的最终产物,主要是通过使凝血因子Va和viia失活而产生抗凝作用。近年来,APC已被证明在不同的炎症环境中发挥额外的细胞保护作用,而这些作用与其抗凝特性无关[4.那5.],包括基因表达谱的有益改变,降低细胞凋亡并增加内皮阻挡完整性。重组人APC(RHAPC)(DROTRECOGIN ALFA)在成人多器官失败脓毒症中的佐剂治疗中注册了10年,直至2011年撤回其效率在此设置中的不确定性。尽管如此,APC的抗凝血剂和抗炎潜力仍然是显着的,并且在各种炎症模型中具有强大的保护作用的非抗凝血APC突变体的开发已经为蛋白C途径作为治疗目标引发了新的兴趣[4.那5.].
与健康受试者相比,哮喘患者在过敏原激发前后支气管肺泡灌洗液(BALF)中的APC水平降低[6.].此外,支气管哮喘患者的痰显示APC/凝血酶比值降低,提示蛋白C系统在应对气道凝血激活增加时上调不足[7.].来自小鼠研究的数据显示,在卵清蛋白致敏和激发模型中,APC治疗可明显减少过敏性肺炎症[8.].我们假设通过给药rhAPC恢复蛋白C通路可以抑制过敏性哮喘患者的变应原诱导的炎症。在目前的概念验证试验中,我们调查了rhAPC对哮喘患者支气管内变应原诱导的变应性肺炎症的影响。
方法
患者和设计
我们在24次房屋粉尘(HDM) - 合理的哮喘患者中进行了一项随机,双盲,安慰剂控制,概念概念研究,以研究过敏性肺炎(荷兰试册号2943)的APC治疗。Amsterdam(荷兰)学术医疗中心的医学伦理委员会,批准了所有患者的研究和书面知情同意。在过敏原挑战之前4小时,随机分配患者以与Rhapc24μg·kg连续静脉注射-1·H-1(Eli Lilly,印第安纳波利斯,美国)或安慰剂(图1).在第二间支气管镜检查之前,rhapc或安慰剂输注在第二间支气管镜检查之前停止了1小时,在BAL(下面见)以在BAL手术过程中降低出血风险。进行了细分挑战通过一种带有轻微调整的支气管镜[6.].简而言之,使用柔性纤维支气管镜进行支气管镜检查,将一个肺段灌注生理盐水(作为对照),对侧肺段灌注HDM提取物(50个生物单位,Dermatophagoides Pteronyssinus.起源;ALK-Abello, Almere,荷兰)和脂多糖(LPS;从大肠杆菌,美国标准参考内毒素,75ng,由Anthony Suffredini,国家卫生研究所,Bethesda, MD, USA提供),试图模拟临床相关和可能的气道挑战[9.那10].总共28例患者随机化。在四个患者(一个安慰剂,三个rhapc)中,第二间支气管镜检查不是通过脉膜的决定基于在一名患者中的偏头痛和不耐受性的三个患者中引入支气管镜(这些患者患者症状中的不耐受性)来完成的第二支气管镜检查。所有结果涉及24名来自获得BALF的患者(12 rhapc和12名安慰剂治疗患者),IE。,可以确定何种效果。8小时挑战后,对分析进行双侧BAL [6.].在线补充材料中描述了有关患者筛选,BAL处理程序,测量和测定的进一步细节。
随机化和掩蔽
通过使用药剂师监督的封闭信封系统进行随机化。患者和学习团队因治疗分配而蒙蔽。盲目地进行了测量。完成研究后,药剂师提供了分配密钥。
统计分析
在适当的情况下使用T-Test或Mann-Whitney U-Test来进行两个变量之间的比较。通过双向分析对差异和弗里德曼的试验进行了序列数据,在适当的情况下进行重复测量。P值为<0.05被认为是统计学上显着的。
结果
基线特征
表格1显示两个治疗组的基线特征。群体与年龄,性别和哮喘相关症状的类型类似。所有患者患有间歇性至轻度的哮喘严重程度(根据哮喘标准的全球倡议)和建立HDM过敏,如同同样高D. Pteronyssinus.-特异性IgE水平。1 s内强迫呼气量有增高趋势(FEV)1与安慰剂相比,rhAPC组中预测值的值%(P = 0.05)。否则,患者特征是相似的。
临床应对
HDM+LPS灌注未引起哮喘临床症状。无出血并发症。1例接受rhAPC治疗的患者出现偏头痛;因此停止输液,头痛自行消失。
rhAPC对HDM+LPS诱导的过敏性哮喘肺凝血无影响
为了监测RHAPC在循环中的抗凝血效果,我们测量了活化的部分血栓形成时间(APTT)。在疗法开始之前,APTT在组之间相似(图2).与预期一样,注入rhAPC的患者在t=0时APTT延长(IE。,直接在过敏原挑战前;p < 0.05相对t=8 h (p<0.01)。与生理盐水侧相比,HDM+LPS诱导凝血酶抗凝血酶复合物(TATc)和d -二聚体BALF浓度升高(图3A和B.;P <0.001和P <0.05分别)和安慰剂处理的患者(分别为P <0.01和P <0.01)。值得注意的是,在HDM + LPS挑战肺段中测量的TATC和D-二聚体水平在抗蠕虫和安慰剂治疗患者之间没有区别。在血浆中,TATC和D-DIMER都显示出在研究日期间的逐渐增加(图3c和d),在rhAPC组(p<0.05和p<0.01)和盐水灌注组(p<0.05和p<0.001)均有显著性差异。尽管rhAPC倾向于降低血浆TATc (p=0.06)和d -二聚体水平(p=0.08),但与安慰剂组差异不显著。考虑到已有报道APC通过增强纤溶酶原激活物抑制剂I型(PAI-1)的释放来抑制纤溶作用[5.[我们在BALF和等离子体中测量PAI-1(图S1)。HDM + LPS挑战与RHAPC的较高BALF PAI-1级别相关联(P <0.05相对盐水)和安慰剂治疗的患者(p = 0.05)。Palf Pai-1浓度在治疗组之间没有差异。在血浆中,PAI-1在两种患者组的研究日逐渐增加(P <0.05)。虽然RHAPC倾向于增强血浆PAI-1的这种兴起,但与安慰剂治疗患者的差异不显着(P = 0.06)。这些数据在一起表明HDM + LPS在过敏性哮喘患者的呼吸道中引发了促进植物环境,并且Rhapc输注不会显着改变这种反应。
rhapc在过敏性哮喘中降低HDM + LPS诱导的中性粒细胞流入
严重过敏性哮喘的特征是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的气道混合细胞浸润[2].与生理盐水相比,HDM+LPS灌注增加BALF中总白细胞计数(安慰剂组和rhAPC组均p<0.001),原因是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的涌入(图4A-C).rhapc减少平均白细胞计数HDM + LPS挑战肺区段,相对于安慰剂43%(P <0.05)。这种抑制作用rhapc选择性地涉及中性粒细胞:而治疗组之间没有差异,rhapc注入患者与安慰剂治疗的患者相比,平均中性粒细胞计数均显示出64%的降低(P <0.05)。值得注意的是,与安慰剂相比,Rhapc还减少了盐水攻击侧的总白细胞计数(P <0.05);这种效果是由中性粒细胞计数的降低引起的;虽然,由于各种变化,这种差异没有达到统计学意义。外周血白细胞(数据未显示)和中性粒细胞计数(图4D.)在研究日内增加,而嗜酸性粒细胞数减少((数据未显示,所有P <0.001)。这些全身反应不受RHAPC的影响。这些结果表明rhapc在局部HDM +上选择性地抑制中性粒细胞募集到气道中的中性粒细胞募集到局部HDM +上LPS挑战。
rhapc不会影响由HDM + LPS诱导的中性粒细胞趋化剂的局部释放
几种趋化因子和细胞因子可以吸引肺中性粒细胞,包括白细胞素(IL)-8,IL-1β,肿瘤坏死因子α,巨噬细胞炎症蛋白1α(CCL3)和1β(CCL4)。所有这些调解员的水平(表2.)HDM + LPS攻击性肺区段较高,而不是盐水灌注的区段(安慰剂组中的IL-8非显着)。然而,rhapc和安慰剂治疗的患者之间没有差异。补体产品也可以吸引中性粒细胞到炎症的部位。在HDM + LPS攻击相对于盐水给药时,BALF中C3A,C3BC和C4BC水平增加。rhapc没有改变这种HDM + LPS引起的补充激活。C5A在所有患者的BALF中仍然不可检测。CD11b是β2-11-14-β-整联蛋白,含有对肺的中性粒细胞迁移。因此,我们确定了CD11b在血液和BALF中性粒细胞上表达(图S2)。与血液中性粒细胞相比,肺使粒细胞显示出增加的CD11B表达,而盐水和HDM + LPS灌注肺区段之间的差异。rhapc没有影响中性粒细胞cd11b表达。 Prostaglandin E2 can inhibit neutrophil migration. HDM+LPS induced an increase in BALF prostaglandin E2 concentrations relative to saline control in both groups, without effect of RhAPC (表2.).这些数据表明,rhapc不会影响局部粒细胞引诱剂的局部浓度。类似地,rhAPC没有影响肠昔肠或可溶性血管细胞粘附蛋白-1的HDM + LPS诱导的释放,介质涉及嗜酸性粒细胞募集的介质(图S3)。
rhapc在哮喘患者的气道中衰减HDM + LPS诱发的中性粒细胞脱粒
增强呼吸道内的中性粒细胞蛋白酶的释放已在严重哮喘中涉及气道炎症[11].弹性蛋白酶包含在中性粒细胞的硫醇颗粒中,与髓过氧化物酶(MPO)一起。HDM + LPS挑战诱导升高的BALF水平的弹性蛋酶(图5A)及MPO (图5B.)相对于盐水给药(安慰剂:弹性蛋白酶和MPO的安慰剂:P <0.01和P <0.001,SpO和MPO,P <0.05)。重要的是,用HDM + LPS攻击的肺区段,rhAPC输注与显着降低的浓度较低的弹性蛋白酶(P <0.01)和MPO(P <0.05)有关。为了测试rhapc的这种抗炎作用是否特异于硫酸颗粒,我们测量了乳铁蛋白的Balf水平,这是特定粒细胞特异性颗粒的组成部分。HDM + LPS滴注诱导安慰剂治疗患者Balf Lactoferrin浓度增加(图5C.,p <0.01相对盐水),但不含鼠窜治疗的患者。根据安慰剂处理(P <0.05)相比,Rhapc输注在HDM + LPS攻击肺区段中显着降低了乳蛋白水平(P <0.05)。这些数据显示,在过敏原攻击症状哮喘患者的哮喘治疗哮喘患者的呼吸道中,中性粒细胞脱粒产物的水平较低。
rhapc不会影响HDM + LPS挑战的T-Helper Cytokine释放
据报道,APC以抑制卵霉蛋白诱导的过敏性肺炎的小鼠模型中T杆杆杆菌2细胞因子的表达[8.].HDM + LPS滴注引起的IL-5,IL-6和IL-10(图S4)相对于盐水给药;rhapc没有影响到来。在所有患者中,IL-4和IL-17水平保持不可检测。在所有样品中,在过敏性肺炎症中有牵连的T-Helper 2活化的胸腺基质淋巴细胞素,在所有样品中检测到低水平,但在HDM + LPS和盐水攻击的段之间或rhapc和安慰剂治疗患者之间没有检测到差异。图S5)。
在HDM+LPS刺激下,rhAPC不能改变血管渗漏
APC可以对内皮细胞发挥细胞和障碍保护作用[5.].我们确定了白蛋白和α的商2-巨球蛋白在BALF和血清中的水平(Q铝青铜和问A2M,分别)和排泄相对系数(QA2M/ Q铝青铜)作为血气道障碍的渗透性的措施[12].HDM + LPS滴注与Q的显着增加有关。铝青铜(图S6A; P <0.01相对盐水)和qA2M(图S6b;p < 0.001相对盐水)和相对排泄系数(图S6C; P <0.001相对盐水)。rhapc没有改变这些HDM + LPS效应(图S6A-C)。根据,HDM + LPS引发了总蛋白质水平(图S6D)的升高,并且在BALF(图S6E)中的血管内皮钙粘蛋白阳性微泡的数量不受RHAPC输注的影响。
讨论
近年来,局部激活气道中的凝血系统被牵连作为有助于过敏性炎症和哮喘的病理生理机制[3.].在这里,我们报告了概念验证试验,该试验试图确定Rhapc,蛋白质是具有不同抗凝血剂和细胞保护性的蛋白质,对哮喘患者的过敏原肺炎造成的抗凝血性和细胞保护性能。我们的研究的主要发现是Rhapc在挑战过敏原挑战的支气管肺泡空间中减少中性粒细胞招募和脱粒产物。考虑中性粒细胞在严重难治性哮喘中的作用[13[这些发现可能对该患者类别具有特殊相关性,其中常规的哮喘疗法不太有效。
我们使用HDM + LPS进行了分段挑战通过支气管镜,以前由我们和其他群体采用的技术模型过敏肺炎[6.].选择HDM作为挑战,因为它是哮喘患者具有高敏化率的常见过敏原源[14].我们添加了低剂量LPS作为天然的相关佐剂[9.].LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分和与哮喘症状的频率相关的环境污染物[10].以前,我们已经表明,在小鼠HDM + LPS中引发混合的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞流入航空公司[15,随后在轻度哮喘患者中证实了这一观察结果[16].为HDM和LPS选择的剂量在患者的房屋中检测到的水平范围内。HDM与LPS的共同暴露不仅是一个可能的临床事件,而且可能具有对哮喘发病机制的相关性,因为HDM过敏原DER-P2在结构上和功能上类似于内源性LPS结合蛋白MD-2。通过形成携带脂质携带的麻袋,HDM过敏原作为LPS的载体进入肺舱[17].由于气道中性粒细胞患者与严重的哮喘,难治性哮喘和皮质类固醇联系起来,研究表征的哮喘表型,以研究为特征的哮喘表型。13].
研究表明,小鼠和人类中性粒细胞在过敏反应和过敏性炎症的病理生物学中都是重要的通过依赖于IgG和fc γ riia的途径[18].rhapc抑制HDM + LPS诱导的中性粒细胞流入气道而不影响嗜酸性粒细胞募集。根据,在健康人类的节段性LPS挑战中,rhapc减少了中性粒细胞流入[19,并抑制il -8诱导的[20.结合介导的中性粒细胞迁移[21].慢性升高的弹性蛋白酶和MPO可以导致肺部损伤,因此可以有助于中性粒细胞和哮喘严重程度之间的关联[13].哮喘患者表现出痰中的弹性蛋白酶活性增加,与临床结果差相关[22].中性粒细胞丝氨酸酶(最明显的是弹性酶)可以增强嗜酸性粒细胞效应功能,如超氧化物的产生和细胞因子/趋化因子的分泌[23].因此,弹性蛋白酶抑制剂减少了豚鼠变应原诱导的杯状细胞脱颗粒[24[预防嗜酸性炎症,T杆杆菌2个细胞因子生产和脚蛋白细胞元在小鼠中的呼吸致敏和攻击模型中的血红素细胞元25].有趣的是,APC降低了弹性蛋白酶引起的小鼠肺损伤[26,提示该药物通过多种机制影响中性粒细胞反应。rhAPC还降低了乳铁蛋白的浓度,乳铁蛋白是中性粒细胞特异性颗粒的组成部分,其激活嗜酸性粒细胞的能力在哮喘的背景下具有特殊的意义[27].
肺内HDM + LPS暴露在BALF中引起的TATC,D-二聚体和PAI-1的升高,表明过敏性肺炎症与肺促凝血剂和抗纤维蛋白溶解环境有关。有趣的是,Rhapc并未禁止HDM + LPS诱导的肺凝固。相比之下,在先前的研究中,rhapc治疗在健康志愿者的气道暴露后施加抗凝血效果[28].这种差异可能是由于凝血活化程度的差异,如本研究中BALF平均TATC水平〜50倍的事实所示。BALF TATC水平的这种差异不是由于LPS挑战剂量较高,这是在早期的健康人类研究中施用的LPS剂量的25%[28].显然,HDM+LPS在哮喘患者气道中预先存在的促凝环境中引发的强促凝反应不能被常规静脉注射剂量的rhAPC所抑制。总之,这些数据表明,在这种化合物抑制中性粒细胞内流和脱颗粒方面,rhAPC的抗凝特性几乎没有作用。这一发现对可能的临床意义和缺乏抗凝作用的APC突变体的当前发展具有重要意义。在临床前脓毒症模型中,这些突变体表现出完整的细胞保护特性,并与野生型APC一样有效。此外,最近的一项研究表明,非抗凝剂APC可以抑制由假单胞菌铜绿假单胞菌[29].非抗凝血剂APC突变体具有相当大的优势,即它们与增加的出血风险无关,这对过去的临床实践中对RHAPC进行了重大问题。重要的是,这些选择性APC突变体中的一种已达到临床测试阶段。考虑到当前试验的结果,探讨过敏哮喘的加剧患者的这些APC突变体的疗效是有意义的。
在卵霉素敏化诱导的肺炎的小鼠模型中,通过降低嗜酸性粒细胞的减少的嗜溶细胞和较低水平的T-Helper IL-4,IL-5和IL-13反映的APC致敏感的过敏性炎症的肺炎症强烈衰减过敏性炎症在Balf [8.].在我们目前的研究中,静脉输注rhAPC未繁殖这些效果,至少部分可以通过物种,过敏原挑衅和APC施用途径的差异来解释。虽然Rhapc的肺内递送似乎很有吸引力,但这种方法与本产品不可行。实际上,我们最近报告了意外的夸张促进的促进和促炎症状对LPS挑战的健康人物通过航空公司[30.].此外,APC对内皮细胞具有很强的抗炎和屏障保护作用[5.,通过静脉滴注可以更好地治疗。然而,我们无法检测到rhAPC的屏障保护作用,这反映在HDM+ lps刺激肺段的血流-气道通透性增加的未改变参数。
总之,在这里,我们表明,静脉越野输液通过不依赖于局部抑制凝固的效果,静脉内抗碱液输注衰减HDM + LPS诱导的中性粒细胞迁移和蛋白酶释放。这种概念证明研究可能对在严重难治性哮喘中开发新的抗炎治疗策略的影响,其中中性粒细胞在慢性炎症和急性加剧中起重要作用。
致谢
我们要感谢来自医院药房(阿姆斯特丹大学学术医学中心,阿姆斯特丹,荷兰)的E.M. Kemper和E.S. Brans对研究方案的帮助。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.qdcxjkg.com.
临床试验:本研究登记www.trialregister.nl标识符号2943
支持声明:J. Daan de Boer和Christof J. Majoor分别支持荷兰哮喘基金会(分别为3.2.08.009和3.2.11.021)。
利益冲突:没有宣布。
- 收到了2015年3月21日。
- 公认2015年6月28日。
- 版权©2015人队