文摘
俱乐部细胞分泌protein-16 (CC16)是主要的分泌细胞气道俱乐部的产物,但其作用,慢性阻塞性肺病(COPD)的发病机制尚不清楚。我们测量CC16气道表达在人类和没有慢性阻塞性肺病和CC16函数在一个香烟(CS)全身的慢性阻塞性肺病小鼠模型。
气道CC16表达测量在COPD患者中,吸烟者和不吸烟者没有慢性阻塞性肺病和。我们暴露了野生型(WT)和CC16−−/老鼠CS或空气长达6个月,并测量气道CC16表达式,肺部炎症,肺泡间隔细胞凋亡,空域扩大,气道粘蛋白5 ac MUC5AC表达,小气道重塑和肺功能。
吸烟者和慢性阻塞性肺病患者减少气道CC16疣状,随慢性阻塞性肺病严重程度增加而降低。暴露小鼠CS减少气道CC16表达式。CC16−−/老鼠大CS-induced肺气肿,气道重构,肺部炎症,肺泡细胞凋亡,气道MUC5AC的表达,比WT小鼠的肺。这些变化是增加核factor-κB (NF-κB)激活CC16−−/肺。CS-induced急性肺被逆转CC16 adenoviral-mediated超表达的变化。
从CS-induced CC16保护肺损伤减少肺NF-κB激活。CS-induced气道CC16缺陷增加CS-induced肺部炎症和损伤,可能导致COPD的发病机制。
文摘
香烟烟雾暴露水平减少气道炎CC16从而导致慢性阻塞性肺病的起源http://ow.ly/GOMiZ
介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球发病率和死亡率的主要原因1]。慢性阻塞性肺病的结果吸入粒子的肺部炎症反应控制不好,主要是在香烟烟雾(CS),导致肺泡壁的破坏和小气道重构(2]。慢性阻塞性肺病的严重程度和进展是分级的用力呼气量在1 s (FEV1)[3]。
FEV的速度下降1在慢性阻塞性肺病与吸烟现状、基线FEV更高1、较低的身体质量指数的程度计算机tomography-determined肺气肿和慢性阻塞性肺病急性加重的历史4- - - - - -6]。在评价慢性阻塞性肺病纵向识别预测替代终点(ECLIPSE)研究中,唯一协会观察FEV率之间的关系1下降和各种生物标志物的血清水平的保护作用与高水平俱乐部细胞分泌protein-16 (CC16) [7]。这个逆血清CC16水平,FEV之间的关系1下降了一群轻度慢性阻塞性肺病患者(8]。
CC16也称为CC10,俱乐部细胞分泌蛋白质,secretoglobin,家族1 a,成员1 (SCGB1A1)和uteroglobin。secretoglobin家庭成员的disulphide-bridged二聚的俱乐部由气道分泌细胞和蛋白质中含量最丰富的蛋白质正常气道分泌物。CC16保持体内平衡的气道上皮9),并在肺抗炎活动暴露在臭氧、过敏原和病毒(10- - - - - -12]。等离子体CC16水平低在吸烟者和哮喘患者和闭塞的毛细支气管炎(13- - - - - -15]。等离子体CC16水平提高后戒烟(16)和增加支气管肺泡灌洗(BAL)流体(BALF) CC16水平与回归前吸烟者支气管发育异常的(17]。尽管最近的一项研究报告说CC16−−/老鼠开发类似肺气肿野生型小鼠(WT)暴露在CS (8),有知识差距的贡献CC16 COPD发病机理。
我们测试了以下假设:1)气道CC16表达式是减少吸烟者没有慢性阻塞性肺病和慢性阻塞性肺病患者,在COPD患者中,它与气流限制的程度负相关;2)气道CC16 WT老鼠暴露在CS水平逐渐降低;和3)暴露在CS, CC16-deficient (CC16−−/)小鼠肺部炎症,更大空域扩大,比WT小鼠气道病理。
方法
气道CC16表达在慢性阻塞性肺病患者和对照组
人类研究机构审查委员会批准,所有受试者签署书面知情同意表格。Formalin-fixed肺部分得到从六个严重或非常严重的慢性阻塞性肺病患者的一部分Overholt BlueCross肺气肿手术试验(ob)肺气肿(18),六个轻度到中度COPD患者,6个健康的非吸烟者(从未吸烟者)和七个健康活跃的吸烟者慢性阻塞性肺病(> 20久)没有谁经历了肺良性结节手术(见表s1在线人口和临床数据的补充材料)。所有的受试者肺癌。肺癌部分是双应用CC16和气道上皮细胞的标记(pancytokeratin;看到在线补充材料)。
动物
哈佛医学院机构动物保健和使用委员会批准了所有程序。C57BL / 6株CC16−−/老鼠(19)和C57BL / 6 WT控制小鼠(杰克逊实验室,巴尔港,我,美国)进行了研究。
CS曝光
成人WT和CC16−−/老鼠(10周)暴露在空气或混合主流和侧流烟CS 3 r4f肯塔基州研究香烟2 h·天−16天·周−1在爱尔兰人TE 10 z钱伯斯(美国爱尔兰人企业,林地,CA) 1 - 6个月。
气道CC16疣状,CYP2F2和MUC5AC
CC16 Formalin-fixed从小鼠肺部分应用,CYP2F2和MUC5AC(见在线补充材料)。
空域扩大和气道重塑
呼吸力学进行小鼠使用机械通风(FX Flexivent;Scireq公司、QC、加拿大蒙特利尔)。吉尔领空大小测量了染色formalin-fixed和肺膨胀的部分。小气道重构测量肺部分沾着马森的三色的染色和应用i型胶原、纤粘连蛋白(见在线补充材料)。
肺部炎症
白细胞落下帷幕的样本子集数在老鼠。炎性介质和基质金属蛋白酶(MMPs)测定肺样本用elisa和免疫印迹(见在线补充材料)。
肺泡隔细胞凋亡和肺部氧化应激水平
肺泡隔细胞死亡的小鼠肺部分的评估是通过末端转移酶dUTP尼克结束标签(TUNEL)染色和免疫染色caspase-3活跃。氧化应激水平测定硫代巴比土酸活性物质(TBARS)肺样本(见在线补充材料)。
香烟烟雾extract-induced小鼠气管上皮细胞的凋亡
WT和CC16−−/小鼠气管上皮细胞单层(MTEC)被暴露于香烟烟雾提取物(CSE) 30% 37°C和细胞内活性caspase-3水平量化使用fluorogenic衬底特定活跃caspase-3(见在线补充材料)。
过度的mCC16小鼠气道
重组运载体(向量生物学实验室,费城,宾夕法尼亚州,美国)表达的互补mCC16 (Ad-CC16)或绿色荧光蛋白(Ad-GFP)肺部WT和交付CC16−−/老鼠(5×107空斑形成单位·鼠标−1在基线和每2周之后使用oro-pharyngeal愿望的方法。一周后最初的病毒剂量,老鼠暴露在空气中或CS 1月,和BAL白细胞枚举或肺部移除分析。
核factor-κB激活和分泌磷脂酶A2在小鼠的肺
肺分泌磷脂酶2(sPLA2)水平测定使用工具包和核factor-κB (NF-κB)激活测量核提取肺使用电泳迁移率改变分析(EMSA)(见在线补充材料)。
统计分析
统计分析使用SigmaStat软件(SSPS Inc,圣何塞、钙、美国)。数据意味着±扫描电镜,除非另有指示。一个假定值≤0.05被认为是显著的。
结果
气道CC16表达式是减少人类吸烟和慢性阻塞性肺病患者,并与慢性阻塞性肺病严重程度间接相关
不吸烟者有惊人的气道CC16染色而染色强度弱在健康吸烟者航空公司(图1)。慢性阻塞性肺病气道CC16染色最低在航空公司(图1一个)和减少与增加慢性阻塞性肺病严重程度评估全球倡议对慢性阻塞性肺疾病(黄金)阶段(图1 b)。散点图分析显示适度变化主题内染色组(fig. s1在线补充材料)。年龄和性别比例组没有差异(表s1在线补充材料)。所有的前吸烟者慢性阻塞性肺病患者。黄金阶段iii iv COPD患者pack-year吸烟史比吸烟者没有慢性阻塞性肺病。使用吸入型皮质类固醇激素在黄金阶段iii iv高于黄金阶段i ii慢性阻塞性肺病患者。
CC16缺陷增加肺气肿发展和气道病理CS-exposed老鼠
平均在成人WT和远端领空大小相似CC16−−/老鼠被安置在一个室内空气环境,直到10周的年龄,然后暴露在空气中额外的1个月(图3和b)。因此,CC16不会调节小鼠肺发展。当只10周大的老鼠暴露在空气中额外的6个月,CC16−−/老鼠的趋势增加空域大小与WT老鼠。然而,当暴露在CS为6个月,CC16−−/老鼠发达领空大小与air-exposed相比增加25%CC16−−/老鼠,而CS-exposed WT老鼠发达国家只有13%的增加空域大小与air-exposed WT老鼠(图3 a和b)。压力-容积(p - v)流循环是相似的CC16−−/WT老鼠暴露在空气中,1个月(数据未显示)和6个月(图3 c)。CS接触6个月后,有一个左移CS-exposed的pv流循环CC16−−/老鼠与CS-exposed WT老鼠(图3 d)。静态肺合规没有WT和差异CC16−−/老鼠暴露在空气中1或6个月(数据未显示),但6个月后的CS曝光,这是更大的CC16−−/比WT老鼠(0.105±0.00805与0.0966±0.00823毫升·而言不啻2O1;p = 0.036)符合CS-exposed肺气肿发展就越大CC16−−/与WT老鼠。
有一个趋势(p = 0.068)对细胞外基质(ECM)的沉积增加蛋白质在成人小航空公司CC16−−/老鼠与为1个月(WT老鼠暴露在空气中图4和b)。老鼠暴露在空气中6个月时,这个小气道重塑是适度更大(∼23%)CC16−−/比WT老鼠。然而,有一个更大的(∼53%)增加小气道重塑CC16−−/老鼠与WT老鼠暴露在CS为6个月(图4和b)。CS-exposedCC16−−/老鼠也有更大的i型胶原染色(fig. s4在线补充材料)和纤连蛋白(图4摄氏度)在小航空公司和更大的气道上皮MUC5AC疣状(图4 d)比CS-exposed WT老鼠。
CC16不足会增加肺部炎症,MMP-9水平,肺泡间隔CS-exposed老鼠的细胞凋亡
Air-exposedCC16−−/老鼠适度大BAL总白细胞、巨噬细胞和多形核中性粒细胞(中性粒细胞)数量比air-exposed WT老鼠(图5- - - - - -c)。CS-exposedCC16−−/小鼠高BAL总白细胞、巨噬细胞和中性粒细胞数量比CS-exposed WT老鼠跨度为评估(图5 a - c);然而,WT和CC16−−/老鼠没有落下帷幕淋巴细胞计数差异(数据没有显示)。相比之下,CS-exposed WT老鼠,CS-exposedCC16−−/小鼠肺CCL5水平更高,积极转变增长factor-β1 (TGF-β1)、白细胞介素- 10”的肺水平较低,但类似肺其他炎性介质水平(表s2在线补充材料)。CS诱发更大的增加肺MMP-9(但不是MMP-12)水平CC16−−/老鼠老鼠比WT (fig. s5在线补充材料)。
CS-exposedCC16−−/小鼠支气管上皮细胞凋亡的数量增加(图6)和凋亡肺泡隔细胞(图6 b和c)作为评估通过TUNEL染色和/或活跃caspase-3染色。然而,CSE诱导类似的细胞凋亡率CC16−−/和WT MTEC文化在体外在网上补充材料(fig. s6)。在CS-exposed肺部氧化应激水平相似CC16−−/和TBARS WT小鼠肺水平测量(脂质过氧化的读出;没有显示)。
CC16缺陷增加激活NF-κB但不是解放军2水平CS-exposed肺
CC16抑制两种促炎症通路在其他模型系统:NF-κB激活(20.),解放军2活动绑定这个酶辅助因子(21]。当我们测量这些途径,air-exposedCC16−−/老鼠适度增加评估EMSA NF-κB激活肺。然而,CS-exposedCC16−−/小鼠肺NF-κB激活大于CS-exposed WT老鼠(图7和b)。尽管air-exposedCC16−−/小鼠肺水平较高的活跃的解放军2比air-exposed WT老鼠,解放军2在肺匀浆(水平相似图7 c)和BALF (fig. s7在线补充材料)从CS-exposed WTCC16−−/老鼠。
Adenoviral-mediated CC16在小鼠气道过度降低急性CS暴露引起的肺部疾病
交付Ad-CC16的航空公司CC16−−/CC16小鼠诱导气道免疫染色(fig. s8在线补充材料)。交付Ad-CC16两CC16−−/和WT肺减毒CS-induced增加BAL巨噬细胞(但不是中性粒细胞)计数两种基因型相比,在Ad-GFP-treated小鼠巨噬细胞计数(图8如图所示)。Ad-CC16-treatedCC16−−/和WT小鼠低CS-induced气道MUC5AC疣状,肺泡间隔细胞凋亡和肺NF-κB激活(图8罪犯),但类似肺sPLA水平2活动(数据未显示)比Ad-GFP-treated老鼠属于同一基因型的。
讨论
我们报告一些新奇的发现。首先,在慢性阻塞性肺病患者气道CC16表达低于吸烟者和非吸烟者,与气流阻塞和间接相关。第二,CS接触逐步减少气道CC16表达WT老鼠。第三,CS-exposedCC16−−/老鼠开发更大的肺部炎症,肺泡间隔细胞凋亡,气道粘液化生,肺气肿和小气道重塑,与肺NF-κB激活大于WT老鼠。肺疾病引起的急性CS暴露被adenoviral-mediated减毒的CC16表达小鼠气道。因此,CC16有着重要的角色在保护小鼠肺部的开发和发展CS-induced COPD-like病态(至少部分)通过减少小鼠的NF-κB激活肺在内在COPD的发病机制22]。
人类研究
只有之前的一项研究报告严重的慢性阻塞性肺病患者的气道CC16表达降低与吸烟者(23]。我们现在缺链接气道CC16在人类受试者和吸烟的严重性气流限制在慢性阻塞性肺病。减少COPD肺气道CC16表达式可能持续作为我们非常严重的慢性阻塞性肺病患者戒烟之前组织。然而,之前的研究报道,血清CC16当吸烟者在戒烟没有慢性阻塞性肺病(水平有所回升16]。这些发现的差异可能是由于不同的研究群体,研究的样本或戒烟以来的时间。
小鼠的研究
CS接触逐步减少小鼠气道CC16表达可能是由于合成CC16减少了俱乐部细胞气道俱乐部或损失(24]。俱乐部细胞的细胞色素P450含量最高肺癌和肺解毒的主要网站的外源性物质(25]。吸入后小鼠俱乐部细胞对损伤敏感萘(计算机科学的一个组成部分26])或CS本身24]。CC16位点的多态性弱与慢性阻塞性肺病在ECLIPSE组与低血浆CC16水平相关,但这些发现并不复制在其他小COPD组有不同的入选标准(27]。此外,CC16轨迹在慢性阻塞性肺病hyper-methylated支气管上皮细胞表明表观遗传因素影响CC16表达式(28]。虽然在WT老鼠CS减少气道CC16表达式,发现一些CC16 CS接触三个月后,可能是足以保护WT肺发展中更严重的肺部炎症反应和气道和空域疾病CS-exposed中观察到CC16−−/老鼠。
CC16保护CS-induced肺部炎症的小鼠肺肺气肿开发、小气道重塑和气道粘液化生。的保护作用可能CC16 CS-exposed小鼠肺中由于CC16减少肺巨噬细胞和中性粒细胞计数和保护肺泡间隔从CS-induced凋亡细胞。CC16由俱乐部细胞分泌上皮衬里流体可能对其他肺上皮细胞旁分泌crytoprotective影响俱乐部WT和游离CC16−−/肺上皮细胞有类似的CSE-induced细胞凋亡率在体外。
在CS-exposed NF-κB激活增加CC16−−/与WT肺(图7)和减少CS-exposed WTCC16−−/肺的过度表达CC16航空公司,这表明CC16协调其活动(至少部分)CS-exposed肺通过减少NF-κB激活促进炎症在COPD肺22]。Ad-GFP-treated WT和CC16−−/老鼠没有差别的程度CS增加肺NF-κB激活可能是由于病毒诱导NF-κB激活,但virus-mediated超表达CC16减毒NF-κB激活肺的CS-exposed WTCC16−−/老鼠。通过N-formyl-Met-Leu-Phe CC16信号受体粒细胞(29日),lipocalin-1受体肺上皮细胞癌(30.和肾脏cubilin31日toll样受体4水平[],减少巨噬细胞32]。CC16还能抑制sPLA2活动在其他模型通过绑定其辅助因子(21)和提升解放军2BALF水平与慢性阻塞性肺病患者的炎性表型(33]。而CC16−−/小鼠高基线肺解放军2活动水平,CS-exposed WTCC16−−/小鼠肺sPLA水平相似2。增加基线sPLA2水平可能导致在air-exposed BAL白细胞计数增加CC16−−/老鼠。然而,CC16可能调解一些CS-exposed肺部通过抑制sPLA抗炎作用2活动测量这个中介全肺或BALF样本可能稀释解放军2肺细胞的信号生成的亚种群。
CC16可以减少气道ECM沉积在肺CS-exposed通过减少肺水平的活跃TGF-1βCS-exposed作为中介的水平更高CC16−−/与WT肺。CC16也可以减少小气道重构,抑制肺部炎症和气道MUC5AC表达白细胞产品导致气道重塑和粘蛋白基因表达在啮齿动物(34- - - - - -36]。
我们的研究结果与最近报道的P约柜et al。(8)报道,肺部炎症、肺气肿和气道重构相似CS-exposed WTCC16−−/老鼠。不同的CC16−−/菌株肾的严重程度不同表型检测(37- - - - - -39)由于其遗传背景的差异和/或目标构造用于生成老鼠。然而,这两项研究评估相同的CC16−−/小鼠染色(19](个人沟通,罪;英属哥伦比亚大学,温哥华,不列颠哥伦比亚,加拿大)。有可能的是,这两项研究的结果的差异反映了不同的方法。例如,我们暴露小鼠全身混合主流和侧流CS 2 h·天−16天·周−1,而P约柜et al。(8)暴露小鼠主流CS 3香烟5天·周−1使用nose-only技术。然而,我们也过度CC16老鼠使用航空公司的运载体,减少CS-induced急性肺的变化与我们的假设一致,CC16 CS-exposed肺抗炎活动。
我们观察到小增加肺部炎症和小气道重构air-exposedCC16−−/老鼠与WT老鼠。小的增加肺白细胞计数检测后1个月的空气接触。因此,缺乏CC16没有CS足以导致轻度肺部炎症可能导致air-exposed适当大的小气道重塑CC16−−/与WT老鼠。因此,CC16抗炎活动甚至在质疑肺。
我们的研究的局限性包括我们相对较小的样本大小。然而,我们达到统计上显著差异组和散点图分析显示适度的类内变化在人类受试者的气道CC16染色。黄金阶段iii iv COPD患者大pack-year对照组的比吸烟者的吸烟史进行了比较。所有的吸烟者的COPD患者吸烟者但可能影响气道CC16染色。使用吸入糖皮质激素的COPD患者可能增加气道CC16表达CC16 steroid-responsive基因(40]。
结论
CS敞口减少气道CC16表达导致肺部炎症,增加肺泡隔细胞凋亡,粘液化生以及肺气肿发展和小气道重构既有助于慢性阻塞性肺病患者的气流阻塞。肺疾病引起的急性CS暴露被adenoviral-mediated逆转CC16 WT和表达CC16−−/航空公司。因此,从CS-induced CC16保护肺损伤。未来的研究将确定CC16可以用作小说治疗慢性阻塞性肺病。
脚注
编辑评论欧元和J2015;45:1519 - 1520 . DOI:10.1183/09031936.00010515]。
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利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2014年7月23日。
- 接受2014年12月6日。
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