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检测活动性结核病(TB)仍然是一项重大的全球公共卫生挑战[1.]结核菌素皮肤试验不能区分潜伏性结核和活动性结核[2.].干扰素-γ释放试验也有类似的局限性[3.].痰抗酸杆菌染色假阴性率高(高达50%)[4.].核酸扩增试验(NAAT),如GeneXpert MTB/RIF(造父变星,加利福尼亚州桑尼维尔市,美国),是准确的,但需要良好的基础设施和获得高质量痰样本的必要性,而这在超过三分之一的HIV感染者中往往是无法获得的[5.,6.].
鉴于这些未得到满足的需求,我们探索了一种新的、快速、简单和廉价的治疗点测试在结核病诊断中的应用[7.]。该方法基于检测从受感染细胞中释放并在呼气中释放的挥发性有机化合物(VOCs)[8.,9]使用气相色谱与质谱联用技术,研究人员此前曾报告在呼出的呼吸中识别出与结核病相关的挥发性有机化合物,但检测准确率较低(80–85%)[10].在这项研究中,我们探讨了活动性结核病检测的可能性通过使用基于有机改性纳米材料传感器的新技术分析呼出气体。这种交叉反应传感器对挥发性有机化合物光谱的集体变化高度敏感[8.].
因此,我们设计了一项病例对照研究,在知情同意后,于2011年11月至2012年3月在南非开普敦的三个地点对210名成年参与者进行了呼吸和痰取样。研究人群包括两个主要亚组。第一个亚组包括结核分枝杆菌培养得到证实(n=64)。对照亚组由两个主要亚类组成:1)健康志愿者(n=67);2)一组结核阴性受试者(n=67)。后者包括那些怀疑结核病但涂片镜检、培养和基因专家MTB/RIF呈阴性的患者。这两组人的年龄和性别相匹配,但在吸烟习惯、艾滋病毒感染率和结核病治疗方面有所不同。
呼出的肺泡呼吸是以受控的方式收集的,如其他地方所报道的[11].简单地说,通过反复吸入可清除吸入空气中的环境污染物通过然后,收集750 mL潮气末呼出空气,并将其截留在两层ORBO 420 Tenax TA吸附管中进行气体取样(中国上海Sigma-Aldrich)。密封管在4°C下冷藏,直至分析之日。
热脱附用于释放捕获在管中的VOCs,并将其输送到包含12个纳米材料传感器(S1–S12)的不锈钢试验箱中,这些传感器基于:1)分子修饰的金纳米颗粒;或2)分子修饰的单壁碳纳米管。有关这些传感器的制造和修饰的更多详细信息,请参见[12,13]。改性颗粒膜和VOCs之间的相互作用导致电阻随时间而可逆变化,记录电阻,然后根据固定标准的每日校准测量进行归一化。
接收器工作特性(ROC)曲线适用于所有传感器。计算训练集和验证集的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。使用SAS JMP版本10.0(英国马洛SAS研究所有限公司)进行统计测试。
在合格的198份样本中,138份(44份结核病阳性、47份结核病阴性和47份健康)为已知身份样本,用作训练集。其余60份身份未知的独立样本(每个亚组20份)用于盲验证。
我们使用ROC得出的Youden指数作为切点(最佳敏感性+特异性)− 1)将检测的传感器作为二元分类器进行评估。12个传感器中有3个显示出>80%的分类准确率。然而,最好的分类器来自S1,一种基于十二烷基硫醇包覆的金纳米颗粒的化学电阻器。S1对138个训练样本中的121个进行了正确分类,准确率为88%;灵敏度为85%,sp为100%效率89%(图1a)。中华民国的曲线下面积(AUC)为94.8%(图1b)。在验证集中,敏感性为90%,特异性为93%,准确性为92%。此外,当应用截止值排除结核病时(培训阶段的阈值得分为95%敏感性)在训练集中,特异性、PPV和NPV分别为83%、78%和96%。在盲法验证集中,相关值分别为88%、76%和94%。在结核病治疗阈值中(训练阶段的特异性为96%)在训练集中,敏感性、PPV和NPV分别为68%、93%和87%。在盲法测试中,相关值分别为78%、76%和94%(图1a).
研究了潜在混杂因素的影响。S1显示了吸烟者之间的随机分类能力对非吸烟者,HIV阳性对HIV阴性受试者及其治疗对未经治疗的结核病(ROC AUC分别为56%、54%和55%)(图1c)这证明结果不受混杂因素的影响。
在本研究中,我们使用NAAT作为补充诊断试验,以验证痰检呈阴性的受试者的真实阴性结果[6.],并且已知其具有相对较低的灵敏度,但灵敏度非常高(∼100%)特异性[4.].
与痰检相比,呼吸分析的一个明显优势是样本获取简单;这与儿童和HIV患者获取痰的困难形成对比[5.,6.]与现有的结核病诊断测试相比,缺乏艾滋病毒的混淆是另一个明显的优势,现有的结核病诊断测试在HIV-TB合并感染者中表现出高达43%的错误分类[14]这些结果可以用以下事实来解释:基于纳米材料的传感器具有广泛的交叉反应性,因此每个传感器都对大量感兴趣的挥发性有机化合物作出响应(例如2,4-二甲基庚烷、乙酰醛基乙烷和2-丁酮[10])因此,反应是感兴趣的呼吸挥发性有机化合物的整个混合物的结果,而不是可能与艾滋病毒有关的单一挥发性有机化合物[8.,15].
我们的研究有几个局限性。病例对照设计可能高估了敏感性和特异性;因此,我们的结果必须谨慎解释。我们也没有排除潜伏性结核病病例。目前的结果仅适用于非洲的高HIV-TB环境;因此,需要在不同环境下进行进一步研究。由于安全性规定与之相关的是,健康受试者与疑似结核病受试者分别在不同的地点进行采样,这可能会引起人们对可能影响结果的地理偏见的担忧。我们将在一个地点采集的健康样本与在其他地点采集的结核病阴性样本进行了比较。结果显示,tw之间没有任何差异o对照亚组(AUC ROC 58%),从而消除了对潜在地理影响的担忧。该研究的另一个局限性是,许多结核病患者在呼吸采样前接受了治疗(中位数为5天),这可能影响了我们的结果。然而,出于伦理原因,这是不可避免的,对亚组的分析没有显示结核病治疗的任何效果。
总之,由于结核病诊断通常不准确或过于昂贵且复杂,无法作为护理点检测工具使用,我们研究了一种非侵入性、相对简单且廉价(每个传感器1美元)的方法来填补这一空白。初步的概念验证结果表明,基于纳米材料的传感器可能是诊断结核病的一个有用的规则输入或排除工具(准确率为92%)。需要更大规模的队列研究来验证结果。
致谢
作者承认Orgenics有限公司(以色列亚夫纳)的Falk Fish博士。Orgenics有限公司表示有兴趣将这项技术商业化,并为这项研究提供了资金。该公司在研究设计、数据分析或手稿起草中没有扮演任何角色。
脚注
利益冲突:披露内容可与本文的在线版本一起在www.www.qdcxjkg.com
- 收到2014年1月29日。
- 认可的2014年2月14日。
- ©ERS 2014