抽象的
虽然喘息于学龄前儿童,但潜在的病理生理学尚未被解除。呼出的呼吸中的挥发性有机化合物(VOC)可以作为早期喘息的非侵入性标记。我们旨在评估学龄前儿童的VOC收集的可行性,并研究VOC型材是否可以在没有经常发生的喘息的儿童之间区分。
我们包括儿童(平均值)年龄3.3(1.9-4.5)YRS)(n = 202),没有(n = 50)复发喘息。通过气相色谱 - 飞行时间质谱法分析呼出的VOC。VOC简介由ANOVA同时分量分析(ASCA)和稀疏逻辑回归(SLR)生成。
在98%的儿童中,呼出的呼吸收集是可能的。总共检测到913个不同的VOC。使用ASCA预处理的年龄,性别和季节校正后的信噪比改善。具有28 VOC的单反模型正确分类为83%的儿童(84%的灵敏度,80%的特异性)。经过六倍的交叉验证后,73%被正确分类(敏感性79%,特异性50%)。
呼出呼吸中的VOC的评估在幼儿中是可行的。VOC简介能够区分儿童,不具有合理的准确性的经常性喘息。这种原则证明为幼儿园喘息的VOCS进行了额外研究。
在学龄前儿童中,喘息是一个经常需要咨询医生的原因。学龄前儿童喘息的群体是多样的,包括哮喘儿童和短暂的病毒引起的症状儿童。由于这种异质性,不同的喘息表型已被定义[1].这些表型主要基于症状和触发器的过程。它们不代表生物合理的分类,因为幼儿狼喘息的潜在病理生理学尚未被解散。
蛋白质组学,基因组学和代谢组织等高通量技术已经成为促进批发多种疾病的途径的重要性[2].近年来,利息已经通过使用呼出的呼吸作为评估生物标志物轮廓的介质来应用“OMICS”技术在非侵入模式下应用于非侵入性模式。呼出的呼吸由数百种挥发性有机化合物(VOC)组成,这些化合物由各种炎症和代谢途径形成[3.].在炎症过程中,反应性氧物质(罗斯)由炎性细胞形成。罗斯与脂质膜结构反应,导致多不饱和脂肪酸的降解。因此,形成了几种稳定的崩溃产品(VOC)[3.,4].VOCs进入血液后,由于溶解度低,被排出到呼吸中。在成人和年龄较大的儿童中,使用呼出挥发性有机化合物的代谢组学研究已知是一种安全、无创的方法,用于评估正在进行的炎症和氧化应激过程[3.,5].分析呼出的VOCs已成功应用于诊断炎症性肺病,如囊性纤维化[6],哮喘[5]及慢性阻塞性肺疾病(COPD) [7,8].
越来越多的证据表明,喘息儿童会加剧呼吸道炎症和氧化应激[9- - - - - -11.].因此,我们假设没有喘息的喘息的孩子和儿童在呼出的呼吸中有不同的VOC曲线。但是,到目前为止,还没有进行学龄前儿童的研究。在这个原则上的研究中,我们旨在评估呼出的VOC的收集在学龄前儿童是否可行,以及VOC的轮廓是否可以区分学龄前儿童免于健康的对照。
方法
研究人群
我们包括来自荷兰林堡省的Adem(哮喘检测和监测)的儿童研究(注册www.clinicaltrials.gov使用标识符号码NCT00422747)。在这项研究中,患有复发性喘息症状的儿童(n = 202)和没有喘息症状的对象(n = 50),在2-4岁的年龄下包括,并在6年龄之前进行前瞻性研究。使用isaac(儿童哮喘和过敏的国际研究)调查问卷评估复发性喘息,并被定义为生命期间至少有两发喘息[12.].已经详细描述了研究协议[13.].该药物获得了荷兰国家医学伦理委员会(荷兰海牙)的伦理批准(标识号CCMO:NL17407.000.07/2007-001817-40)。所有家长均给予书面知情同意。
研究设计
对于目前的研究,我们分析了包含的数据。在初次访问期间,评估了呼出的呼吸和临床患者特征的测量。吸入皮质类固醇(IC)在访问前≥4周停止。在肠胃感染的肠胃感染症状的情况下推迟了4周的测量,例如流鼻涕,打喷嚏,喉咙痛,咳嗽,不适或发烧。在测量的1小时内不允许固体食品和运动。使用Phadiatop婴儿试验(Phadia,乌普萨拉,瑞典)测定Atact的存在。
呼气呼气分析
样本收集与分析
孩子们在看卡通片的时候,通过与非呼吸阀系统相连的面罩进行潮汐呼吸。在阀门的呼气口,1-L聚碳酸酯袋(Tedlar®袋;SKC Ltd, Blandford Forum, UK)连接收集呼出的气体。当袋子被填满时,它被清空通过不锈钢,两层吸附管,充满了Carbograph 1 TD/Carbopack™X (Markes International, Llantrisant, UK)用于快速吸附和稳定挥发性化合物。试管密封,并在室温下保存,直到分析。通过热解吸(统一解吸单元;举办国际)。然后,将样品注入气相色谱(GC)毛细管(Trace GC;ThermoFischer科学公司,Austin, TX, USA)。在GC毛细管中,VOCs被分离,随后使用飞行时间(TOF)质谱(MS) (Tempus Plus; ThermoFischer Scientific). Detailed information about the conditions and settings of the GC–TOF-MS measurements has been provided previously [14.].
数据预处理
原始GC-TOF-MS输出文件的预处理包括自动峰值检测,基线校正和保留时间的归一化[14.].此后,将所有更正文件中的相同化合物组合成大型数据库文件。基于保留时间和质谱的相似性连接不同样品中的互补化合物。质谱数据的相似性基于计算匹配因子[14.].最后对峰面积进行归一化,比较不同化合物的峰面积和伴随强度。我们之前测试了我们的分析程序(包括取样、储存和仪器分析)在成人和学龄儿童中的重现性[6,14.].我们展示了仪器,长期和短期内的个人再现性高[6,14.].
统计分析
数据使用R(版本2.10.1;维也纳大学,维也纳,奥地利)和GLMnet工具箱(版本1.4)[15.].临床变量以平均值±表示扫描电镜或指(范围)。分类变量用n(%)表示。分别采用独立t检验、Mann-Whitney u检验和连续参数、非参数和分类变量卡方检验评估有无复发性哮鸣患儿临床特征的差异。以p<0.05为显著水平。我们的数据集的特点是,与研究中的受试者数量相比,测量了大量的变量(VOCs, n=913;孩子,n = 252)。这就产生了多重共线性和奇异性问题,传统统计方法(无论是多变量还是多变量)都无法充分解决这些问题。因此,我们应用现代技术来处理数据的高维:方差分析同时成分分析(ASCA)和稀疏逻辑回归(SLR)。采用ASCA作为预处理工具。ASCA的工作原理是将VOC的总变化分解,并将其分配给与喘息无关的已知来源,即。因素性,身高,体重,年龄,测量季节及其互动。随后由ASCA获得的VOC残差作为单反模型中的分类器进入,以研究其在预测复发性喘息的有效性。目的是选择经常性和非反冲蠕动之间具有高度辨别性的VOC的子集。SLR通过抑制嘈杂相关的VOC来选择最预测的VOC,即。通过从模型中修剪它们,因此保护高误率(图S1)。通过这种方式,选择了最丰富的VOC。SRL是一种分类方法,可提供高精度的稀疏解决方案。有关SLR的更多细节由H描述astie等.[16.].SLR分析只纳入人群中患病率≥7%的VOCs [14.,17.].施加重量以校正类别的不平衡(202个蠕动和50个非全拍铃声)。此外,应用了六倍的交叉验证。通过使用美国国家标准和技术库(如前所述)确定了复发喘息的最具预测VOC。[14.].
结果
临床特点和可行性
共有258名儿童被邀请参加这项研究。我们成功地收集了98% (n=252)的儿童呼出的气体。突然的焦虑是其余6个孩子辍学的主要原因。在纳入的儿童中,202名儿童有复发性喘息症状(平均年龄3.2(1.9-4.5)岁),50名儿童无复发性喘息症状(年龄3.3(2.2-4.1)岁)。临床特征见表1.与非全拍铃声相比,湿疹更频繁地在经常性喘息(P <0.05)。大约40%的喘息的孩子使用短作用β2- Aganisiant作为救援药物,19%的喘息的儿童正在与ICS进行维持治疗。在测量和短作用β之前停止≥4周的IC2-激动剂≥8小时前测量。在7例患者中,由于严重的哮喘症状,负责的医生不允许停止ICS。
呼出气体
可以在所有样本中确定VOC简档。总共有913种不同的VOC,患病率≥7%。平均每小方呼出的VOC的数量平均为350。
协变量
最初的主成分分析表明,数据被划分成清晰的集群,而不考虑喘息。我们采用ASCA来确定哪些协变量可以预测这种聚类,但不能预测复发性哮鸣。相关协变量包括性别、年龄和季节,其中只有季节与喘息轻度相关(r=0.125, p=0.05)。以性别、年龄和季节解释的挥发性有机化合物间差异较大。99% VOCs的季节解释方差<23% (无花果。1)。这个百分位数(1%)为年龄为7%,性别为6%(图S2和S3)。通过这些变量(及其交互)解释的数据可变性从VOC数据中减去,以提高信噪比。
讨论
本研究首次探讨了呼出性VOCs对学龄前儿童呼吸道症状的鉴别价值。我们证明了在学龄前儿童呼出的气体中可以很容易和安全地收集和测定VOCs。此外,呼出性VOCs可以很好地区分复发性哮鸣儿童和无哮鸣儿童,具有可接受的交叉验证分类错误和敏感性,尽管特异性有限。
学龄前喘息是一种常见但复杂的症状。学龄前喘息的潜在原因是多种多样的,而且还没有得到充分的了解[1].越来越多的证据表明气道炎症在学龄前喘息起着很大作用。然而,自目前的技术评估气道炎症(如。活组织检查(活检)对儿童的常规使用太有侵入性。由于需要对气道炎症进行无创评估,人们对包括呼出VOCs在内的呼吸分析越来越感兴趣。在本研究中,我们证明了在学龄前儿童中测量呼出气体中的VOCs是可行的。我们的高成功率是三个主要因素的结果。首先,我们使用工具让孩子们在测量过程中感到轻松,在呼气收集方面取得了较高的成功率。其次,采用GC-TOF-MS技术进行VOC分析。这是一种高灵敏度的技术,能够检测广泛的VOCs。第三,我们使用原始质谱来匹配所有儿童的相似化合物。在大多数研究中,化合物首先在图书馆中被识别出来,然后在受试者之间进行比较。然而,这种方法容易出错,化合物鉴定不当会影响数据库的质量。 Our innovative procedure that matches compounds on the basis of the raw mass spectra and retention time creates a more reliable database [8].
我们证明了VOCs可以很好地区分喘息儿童和健康对照组。在扣除了由性别、年龄和季节解释的数据变异性后,我们得到了一个可接受的预测模型。尽管季节与wheze有轻微的相关性,因此可能会减去一些由wheze解释的相关方差,但通过执行ASCA预处理,我们的模型的预测值得到了改善。测量季节、性别和年龄是我们数据变化的主要来源,这一事实强调了在未来的研究中进一步探索这些以及可能的其他混杂因素的重要性。在我们的模型中,最重要的鉴别化合物主要是碳氢化合物。与无哮鸣症状的儿童相比,这些碳氢化合物在复发性哮鸣儿童呼出气体中的比例要低约40%。这与我们之前对COPD患者和哮喘儿童的研究结果相当[5,8].人体中VOCs的形成和去除的复杂生物平衡可能是这一发现的一个可能的解释。由于VOCs被认为是在炎症和氧化应激过程中形成的,所以呼出气体中VOCs的相对组成可能会因疾病而发生变化,这种变化可能是某些化合物的增加或减少[5].例如,可以想象有喘息症状的儿童会增强氧化应激。这可能导致脂质过氧化增强,某些VOCs,特别是长链碳氢化合物,进一步氧化成更小的成分,从而以较低浓度被呼出。
我们研究的优势之一是,我们研究了呼出的VOCs的整个范围,而不是预先选定的炎症标志物。这使我们能够探索所有可能的化合物。当分析呼出的挥发性有机化合物的整个范围时,可以识别出数百种成分,这就给解释和理解数据的统计分析留下了挑战性的任务。我们用单反相机分析了我们的数据。传统的逻辑回归可以很容易地应用于小规模和精心设计的问题,但对于大变量共线数据通常会失败。SLR可以被认为是一种抑制噪声相关VOCs (GC-MS峰;图S1)。这导致了更稀疏的模型,提供了对高假阳性率的保护。尽管有这种先进的统计技术,结果仍然很容易解释。先前应用于VOC数据的其他建模技术包括判别分析(可使用或不使用主成分分析作为预处理工具)[5- - - - - -7,18.],支持向量机分析[8,19.]模糊逻辑模型[20.].目前,对于分析VOCs的最佳统计技术还没有共识。在未来的研究中,应该对不同方法的性能进行比较。
我们的研究的额外强度是我们已经使用GC-TOF-MS来检测VOC。这种敏感技术能够定量和定性地检测单个化合物,因此提供有关不同呼出的VOC的详细和完整信息。检测VOCs的另一种潜在技术是电子鼻子[7,21.].虽然这种技术很快,易于使用,而不是非常昂贵,但它无法识别呼出气息中的单个化合物。
我们的研究有一些局限性。首先,我们根据父母报告的喘息情况对儿童进行分类,以模拟临床实践。我们没有向医生确认是否有哮鸣。因此,有可能有些孩子被错误地分类了,从而削弱了我们模型的鉴别价值。可以预期,使用医生确认的喘息进行更严格的分类将导致更少的误分类,进而形成更好的学前喘息鉴别模型。此外,我们所研究的喘息儿童群体仍然是异质的。虽然有些儿童因反复发作的病毒性呼吸道感染而喘息,但在其他儿童中,哮喘是其症状的根本原因。在我们的4年随访后,鉴别这些喘息表型将是可能的。
尽管VOCs有可能用于儿童肺部疾病,但在将VOCs分析应用于临床实践之前,还需要解决多个限制因素。第一,今后的努力应着眼于数据收集和分析的标准化。为标准化程序制定国际建议,如为呼出的一氧化氮和呼出气体冷凝物中的标记制定的建议,将有助于加强实验室间的可比性[22.,23.].其次,验证很重要。虽然大多数研究包括交叉验证,但下一步要采取的是使用外部验证集。第三,对VOCs的生理意义和生物化学来源需要进一步深入研究。如前所述,由于气道炎症,脂质过氧化会形成VOCs。由于VOCs是通过血液传播的,可以想象它们也在其他过程中形成,并具有更系统的来源。因此,在今后的临床研究中,应结合动物的和在体外研究评估歧视性VOC模型的更深刻的生物解释。最后,采样技术的改进将增强VOC在未来肺病的诊断和监测中的潜在使用。一旦采取这些步骤并且在大规模临床研究中验证了鉴别的VOC型材,诸如专用GC设备或其他传感器技术等技术将加速分析并成为诊断工具的成本效益。
综上所述,呼出气体中的VOCs可以很好地区分有无复发性哮鸣的学龄前儿童。虽然我们的模型显示了可接受的分类误差和敏感性,但它的特异性有限。然而,在这项原理证明研究中,我们证明了VOC分析作为一种技术的潜力,可以提供有价值的关于哮喘儿童疾病状况的信息。希望这将为学前喘息领域中VOCs的进一步研究铺平道路。VOCs未来的潜在应用包括客观定义学前喘息表型(基于潜在的病理生理学),评估早期哮喘诊断和治疗。
确认
作者希望感谢他们的研究护士K.格鲁特和医学生A. Nijhuis, B. Thönissen, E. Kalicharan和E. Cohen,感谢他们在测量期间的杰出协助;E. Moonen在实验室程序方面的熟练协助(荷兰马斯特里赫特大学医学中心);向荷兰哮喘基金会、马斯特里赫特大学医疗中心和阿斯特玛·贝斯特里丁基金会提供财政支持;感谢父母和孩子的参与。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项研究得到了荷兰哮喘基金会、Stichting Astma Bestrijding和马斯特里赫特大学医学中心的支持。
临床试验
ADEM研究注册于www.clinicaltrials.gov使用标识符号码NCT00422747.
兴趣表
没有宣布。
- 收到了2011年7月18日。
- 接受2012年3月28日。
- ©2013人队