摘要
结节病的病因尚不清楚。在转化生长因子(TGF)-β2单核苷酸多态性(SNPs)和-β3据报道肺纤维化患者结节病的发生有关。
单核苷酸多态性在TGF-β2 (rs1891467)和TGF-β3 (rs3917200)研究了296例结节病(急性/自我汇款,n = 70(包括62年洛夫格伦综合征)患者;慢性,n = 168;急性/慢性,n = 58)。32例出现肺纤维化的放射学征象。比较了结节病组和377名健康对照组的基因型频率。
我们发现一个重要的协会与G-allele rs1891467 TGF-β2和急性/自我汇款的结节病相比,慢性课程(p = 0.001)。这一结果在洛夫格伦综合征患者中更为明显(p<0.001)。此外,我们可以证明一个临界意义之间TGF-β3 (rs3917200)和肺纤维化(p = 0.050)。
rs1891467基因的g等位基因携带者可能不会发展成慢性病程。此外,有证据表明rs3917200参与了结节病肺纤维化的发展。这项研究是第一个在结节病病人建议基因意味着TGF-β2结节病的保护性因素。
结节病是一种炎症性肉芽肿多系统疾病,其在> 90%的病例主要影响肺和淋巴结。其他器官,包括皮肤,心脏和肝脏也可以折磨。该疾病的特征为非干酪性坏死肉芽肿和夸大的细胞免疫应答引起的巨噬细胞的增加的炎症活性1]。胸部摄影被用来描述肺结节病的不同阶段。大多数结节病患者的临床病程短而有利,但约20%出现肺纤维化等并发症,需要长期使用皮质类固醇[2,3]。
虽然在了解结节病的发病机制方面已经做了相当大的努力,但病因学仍然不清楚。有证据表明它是一种未知的外源性抗原刺激和内源性遗传易感性的产物[3]。最近发表的基于注册表的双胞胎研究表明,80倍增加发展中国家在受影响的同卵兄弟姐妹共同双胞胎结节病与普通人群相比,风险[4]。异卵双胞胎的风险增加了7倍。这表明遗传影响在结节病的病因学中是重要的。此外,有证据表明,不同的基因有可能改变疾病的进程。Kruit等。[五)能够显示,单核苷酸多态性(snp)转化生长因子β(TGF-β)基因亚型与肺纤维化患者的肺结节病的发展。TGF-β亚型调节适应性免疫系统的组件,如t细胞和先天免疫应答的,如自然杀伤细胞(6,7]。有证据表明,单核苷酸多态性在TGF-β2和-β3相关肺纤维化患者的结节病的发展,我们试图分析这些结果在一个大高加索的296年德国结节病的患者平均随访时间为6.9年。我们假定的snp TGF-β亚型可能参与转换的一种慢性疾病。
材料和方法
患者人群
本研究符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》(1989),并经德国波恩大学医学院伦理委员会批准(编号080/05)。每名患者和所有健康对照者在登记前均获得书面知情同意。
患有严重疾病的患者,包括慢性阻塞性肺病、过敏性哮喘或免疫性疾病的患者被排除在研究之外。所有患者年龄至少18岁。
结节病组
296例确诊为结节病的白人患者(年龄53.0±12.9岁;本研究纳入168名女性(56.8%)和128名男性(43.2%)。他们从德国波恩的莱茵斯切-弗里德里希-威廉姆斯大学内科门诊部和德国美因茨和科隆的结节病同侪支持小组中招募。
在任何器官和胸片(前后侧位)异常中,活检均证实结节病为非干酪样上皮样细胞肉芽肿。根据美国胸科协会(ATS)/欧洲呼吸协会(ERS)/世界肉芽肿病和其他肉芽肿疾病协会(WASOG)的指导方针和sc标准,胸科医生和专攻弥漫性肺部疾病的放射学专家一致评估胸片,以确定疾病严重程度。188bet官网地址I期为双侧肺门淋巴结病变,II期为附加实质浸润,III期仅为肺浸润。0期为正常胸片(包括肺外表现)、IV期肺纤维化[3,8]。
诊断用历史数据,体检,肺功能检查,胸部计算机断层扫描(81名患者),和支气管肺泡灌洗液分析进一步完成。
对于统计分析,治疗慢性过程被定义为在2年或一个时间跨度是1),其具有更多的症状或2)具有有最小的寿命两分集的,如先前所描述的9-11]。急性结节病定义为临床急性结节病仅1例,完全治愈,随访未复发。因此,所有只有一次洛夫格伦综合征发作的患者和所有有其他急性结节病的患者都被纳入这一组,而有两次或两次以上洛夫格伦综合征发作、慢性持续性发作或复发的患者则被归为“慢性组”。所有结节病患者的平均随访时间为6.9年(“急性组”为4.2年)。根据ATS/ERS/WASOG指南对洛夫格伦综合征进行了定义[3]。70例患者出现急性病程,其中62例为洛夫格伦综合征。“急性组”的其余8名患者没有表现出典型的洛夫格伦综合征,主要累及皮肤和眼睛。肺纤维化的诊断依据为胸部x线平片标准,如前所述(稳定的IV期或进展到此期)[五,8]。因此,非纤维化组包括所有0期、I期和II期患者,以及2例III期患者,在最近的胸片检查中没有纤维化迹象。结节病组的基线特征见表1。
对照组
谁是年龄和377高加索人,健康志愿者无关性别匹配的作为对照人群(年龄53.2±17.6岁; 202(53.6%),女性和175(46.4%)男性)。所有的人都德的居民和在波恩,德国波恩大学的就业前的考试选择。都没有肺部疾病病史或呈肺或其他疾病的任何症状。所有显示正常胸片和实验室检测结果,包括血常规,尿液分析,肝脏酶活性和血尿素氮水平。
方法
9毫升的外周静脉血液样品通过标准静脉穿刺每个单独的绘制。DNA在外面协议通过米勒描述了使用盐析从EDTA血液中纯化等。[12]。
SNP选择和基因分型
选择的SNP rs1891467(TGF-β2)和rs3917200(TGF-β3)因为两者都报道与肺纤维化的结节病相关联五]。snp等位基因,PCR引物和荧光标记检测探针结构的变体TGF-β2和-β3等位基因表2]。基因分型TGF-β2和-β3多态性、实时PCR分析(Light-Cycler使用TM;(罗氏,曼海姆,德国),混合探针与光循环应用TMDNA万事达杂交探针试剂盒(Roche)。将两PCR的引物和荧光标记的检测探针通过TIB MOLBIOL,柏林,德国合成。
对于PCR,条件为3毫摩尔MgCl21每个杂交探针的pmol 20 pmol两个PCR引物,2μL Light-CyclerTMDNA杂交组合(罗氏)和100 pg大师10 ng 20μL DNA在最后一卷。5分钟后变性(95°C), 40 PCR循环(TGF-β3)和45 PCR循环(TGF-β2)进行3 s变性在95°C, 20年代退火58°C (TGF-β3)和54°C (TGF-β2)和25 s在72°C扩展。TGF-β2分化和-β3等位基因是由PCR后融化曲线测定。在开始温度为45°C,最后温度为80°C,温度梯度为0.4°C·s的情况下,在95°C下,经过5 s的变性期,得到了熔点曲线-1。用光循环仪在线检测聚合酶链反应和熔解过程TM乐器。作为内部对照,在自动DNA测序仪上随机选择10个测定序列(Qiagen, Hilden, Germany),并与光循环仪的结果进行比较TM技术。对于每个样品,制备熔解曲线,示出在荧光强度依赖于温度的降低(无花果1和2)。熔解曲线分析显示不同熔点最大值(-dF / dT)的该杂交探针,根据不同的基因型。关于TGF-β2,有一个单一的熔化最大58.0℃下,在野生型和56.1两个熔融最大值℃,64.2℃下,在杂合DNA的情况下是。纯合基因型变体显示出56.1℃的熔点。对于TGF-β3,单一熔融最大67.0℃下在和的58.0℃时的变体的基因型的情况下,在参考基因型的情况下找到。在杂合子,这两个熔化最大值分别位于58.0℃,67.0℃,如图图1),2。
因此,基因型的分化是通过熔解曲线分析成为可能。对于内部对照,10个随机选择的样品进行测序,显示出100%的一致性与光循环仪TM数据。
结果
确定snp TGF-β2和-β3影响结节病的易感性或表型的基因,我们执行一个关联分析标记的组对所有结节病,急性结节病,慢性课程结节病、纤维化和non-fibrosis结节病组。研究结果载于表3。在类肉瘤病患者和健康对照受试者TGF-β2和TGF-β3的等位基因携带者和基因型频率的分布没有从Hardy-Weinberg平衡偏离。
我们比较了急性结节病向慢性结节病发展的患者和对照组的患者。TGF-β2我们检测到更少的突变G-allele队列的一种慢性结节病。我们发现的重要关联TGF-β2 rs1891467: p = 0.001为慢性与急性组p = 0.030,慢性组p = 0.030与控制。对于洛夫格伦的队列,我们可以显示相同的结果(洛夫格伦的)与慢性,p < 0.001)。TGF-β3我们不能证明显著的结果。
在第二次计算中,我们比较了32位纤维瘤患者和200位非纤维瘤患者。由于无法获得目前的放射学分期,我们不得不排除总结节病队列中的64例患者。在TGF-β3,我们观察了患者肺纤维化患者中的突变C-allele假定值为0.050。TGF-β2,纤维化患者显示突变G-allele低于患者无纤维化明显皮尔逊卡方检验的统计趋势(p = 0.091)。
讨论
我们检查了两个snp TGF-β2和TGF-β3基因协会与结节病的进程和肺纤维化的发展。rs1891467基因的g -等位基因似乎可以防止慢性病程的发生。因此,这项研究我们所知是第一个在结节病病人建议基因意味着TGF-β2作为一个潜在的结节病的保护因素。此外,对单核苷酸多态性我们可以观察一个清晰的、甚至TGF-β3边缘显著,趋势肺纤维化的形成。
越来越多的证据表明,只有遗传易感的个体才会患上结节病。由于导致结节病的假设的外源性刺激仍然没有被发现,在过去的十年中已经进行了大量的努力来寻找“”结节病基因或可能导致结节病的易感基因模式。此外,疾病修饰基因的发现越来越重要。这些基因可以起到保护作用,像洛夫格伦综合征一样自然地终止疾病,也可以改变疾病,使其发展成一个涉及多个器官的慢性过程,如肺纤维化。
因此,在本研究中,我们要回答这个问题,如果在单核苷酸多态性TGF-β2(rs1891467)和-β3(rs3917200)可能会改变结节病的过程中或有可能对肺纤维化的患者的结节病发展的保护还是适得其反的影响。两个单核苷酸多态性研究被选为有来自Kruit最近发布等。[五在荷兰的一组结节病患者中,这些snp与更高的肺纤维化率相关。
我们研究的主要发现是突变摹TGF-β259941 A / G等位基因的患者减少量与结节病的慢性过程。此外,在慢性组中,我们发现少了野生型等位基因,为显著发现的主要原因的事实明明是患者的纯合G-突变的数量较少。慢性相较于纤维化组,有意思的是在慢性组,我们观察到更多的患者纯合子突变的等位基因。其实我们本来预计纤维化患者更频繁地趋向于一个慢性过程,并反之亦然,慢性病人更容易发展成肺纤维化。造成这种差异的最可能的原因是“慢性病程”和“纤维化”是两种不同的表型,只有在一些罕见的病例中才可能重叠。可能有不止一个遗传因素在起作用。
如上所述,我们无法详细复制荷兰队列的结果。此外,在TGF-β2我们检测到突变等位基因在肝纤维化组少,而Kruit等。[五]发现纤维化组显著更多的突变。我们的TGF-β3结果和荷兰队列的结果指向同一个方向,在我们的研究中一个临界统计学意义。这些部分不同的结果可能是解释的,由于纤维化组,32例患者在我们的研究和荷兰研究24的样本大小。这两项研究的纤维化患者被分配到基于放射学结果,而不是肺功能和影像学观察的组合纤维化队列。我们的结论是“肺纤维化”类肉瘤病患者由一组异质性的患者的过程由遗传和临床参数确定的变量。在这两项研究的对照组基因型分布是TGF-β317369 T / C颇为相似。但也有在TGF-β259941 A / G的基因型分布明显不同。因此,有可能与纤维化患者的放大subcohort达到不同的效果。我们不得不承认,在这两项研究中,荷兰和我们自己,小纤维化组的分析,可能是动力不足。
然而,尽管功能数据失踪,我们认为TGF-β家族是一个有前途的目标在结节病肺纤维化的基因。之间的串扰TGF-β亚型并不完全理解。三个亚型TGF-β1,TGF-β2和TGF-β3与不同的功能(15]。而TGF-β家族的亚型1和2与profibrotic通常描述属性,TGF-β3似乎更多元化的性质(16,17]。最近的一项研究表明,TGF-β3可能只对TGF-β1的表达调节作用[18]。先前发表的一项研究表明,这三种亚型均可通过刺激成纤维细胞来促进胶原的合成,从而促进纤维化。不同的亚型在效力上有相当大的差异。TGF-β3 10倍更有效的比其他两个亚型(19]。在同一组中的另一项研究中,TGF-β3基因的表达也被在自发人类肺纤维化检测[20.]。在这里,然而,TGF-β1基因表达是最高的。在最近的一项研究中,profibrotic影响鼠肺外源性添加TGF-β3后可以检测到。不过,也在这种情况下,诱导profibrotic TGF-β1成为主流的影响(18]。
关于结节病,Zissel的研究等。[21)发现增加TGF-β1水平与自发缓解。访问组的最近的一项研究,探索结节病易感基因,能够展示协会功能TGF-β1单体型和一种慢性的结节病(22]。在我们的研究中,尚不清楚哪些功能影响是由snp引起的。因此在未来的研究的功能TGF-β亚型,尤其是TGF-β2 -β3,snp躺在这些基因的功能的影响还有待探索。
精确的表型决定了遗传关联研究在复杂疾病中的表现,特别是在对亚群进行分析时。在本研究中,肺纤维化的定义是困难的。结节病患者的分类通常是根据sc的传统放射学分类[8]。但是现在,计算机断层扫描(CT)通常是除了胸部x光检查之外的另一种检查方式。由于CT扫描分辨率的提高,结节病患者常被划分为放射期III期或期,即使常规胸片检查未见明显改变。我们试图通过常规的胸片检查来排除这种可能性,但CT扫描结果可能存在一定的偏差。尽管纤维化组的一氧化碳转移因子较低(ŤL,有限公司)肺功能测试不是所有患者影像学诊断为肺纤维化显示功能受损ŤL,有限公司。有趣的是,ŤL,有限公司在这项研究中比在荷兰的研究高得多(83与63%)。然而,这些差异很难解释,在我们的研究中,ŤL,有限公司32例患者中有31例有相关数据,而在荷兰的研究中,只有23例纤维化患者中的7例有相关数据。这使得直接比较这两项研究变得困难。
此外,在急性和慢性病程结节病的表型不是特异性的,但已被证明是一个有用的描述工具。这已经在BTNL-2(类丁基嗜酸细胞2)中得到证实,到目前为止,BTNL-2是与结节病关系最密切的基因,与慢性病程关系最密切[10,23]。分裂成两个子组“急性”和“慢性”为我们所定义的可能是任意的。当然,还有许多其他可能的方式以表型结节病的患者。在同伙甚至比我们更大的不同表型工具可能有资格。目前我们建议,对于大型的同伙,表型分型的SCAC(结节病的临床活动分类),最近由普拉瑟定义等。[24]。这种分类也使得后2年削减定义一个慢性过程。因此,我们认为我们的子类合理选择和细分在六个SCAC类会导致subcohorts太小,我们的研究。我们的样本规模达到296个例,尽管结节病是一种罕见的疾病;因此,这项研究应该有足够的统计力量来产生有效的结果。相比于其他结节病遗传学研究,296名以及表型病人等于,甚至超过,受试者在此前发表的研究报告的数量[25-27]。
总之,我们检查了两个snp,一个在TGF-β3 TGF-β2和基因,协会与结节病的进程和肺纤维化的发展。运营商的G-allele rs1891467 TGF-β2似乎受发展中一个长期的过程。这项研究是第一个在结节病病人建议基因意味着TGF-β2结节病的保护性因素。此外,在这两个snp我们可以观察一个清晰,TGF-β3近显著,趋势肺纤维化的形成。
致谢
我们要感谢所有患者和健康对照者,是他们使这项研究成为可能。另外,我们要感谢波恩结节病协会的H.和B. Stachetzki在实施波恩结节病网络(www.sarkoidose-bonn.de),这使多数患者对我们的项目的募集。最后,我们要感谢M. Lennarz(波恩大学,波恩,德国)在执行上述实验中她出色的技术支持。
脚注
支持声明
这项研究得到了机构赠款(BONFOR)的支持。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年7月28日。
- 公认2010年11月6日。
- ©2011人队