文摘
我们调查是否萎缩和肥大信号改变隔膜的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。
我们研究了膜片纤维尺寸和比例,表达的标记ubiquitin-proteasome通路,抑制核转录因子(NF) -κB通路,肌肉监管因素和隔膜的肌肉生长抑制素来自19个严重慢性阻塞性肺病患者的活检和13没有慢性阻塞性肺病患者。
I型比例显著增加在慢性阻塞性肺病患者的隔膜II型比例下降。所有的纤维类型的横截面积减少慢性阻塞性肺病患者。此外,MAFbx mRNA在慢性阻塞性肺病患者的隔膜而Nedd4 mRNA下降。Cytoplasmatic IκBα和IκBβ抑制剂蛋白质含量的减少慢性阻塞性肺病患者就像NF-κB p50 dna结合活性。MyoD mRNA和核蛋白质含量降低COPD患者的隔膜和myogenin信使rna和蛋白质水平保持不变。肌肉生长抑制素mRNA的蛋白质含量下降,但核和细胞质分数显著增加慢性阻塞性肺病患者。
这些数据表明,ubiquitin-proteasome通路,NF-κB通路和肌肉生长抑制素蛋白上调COPD患者的隔膜而MyoD表达减少。这些改变可能导致隔膜重构在慢性阻塞性肺病。
吸气肌无力患者的慢性阻塞性肺疾病(COPD)是临床相关,因为最大吸气压力是与这些患者的生存。改编的隔膜透露更大比例的I型纤维与II型纤维在慢性阻塞性肺病患者的比例下降1,2。这个转向较慢,含量资料,这也是符合适应观察到SERCA的表达(肌质内质的钙腺苷三磷酸酶)泵3,与慢性活动增加COPD患者的隔膜4。减少力代单隔膜纤维与降低肌凝蛋白含量也发现在慢性阻塞性肺病5。此外,这些纤维钙敏感性降低,可能导致肌肉无力的轻快,高频的激活5。这些变化已经出现在轻度到中度慢性阻塞性肺病患者。横桥自行车动力学、受损纤维萎缩和sarcomeric受伤也被观察到2,5。采用分子结构变化可能削弱肌肉纤维的稳定性,导致纤维损伤2,5。最后,蛋白质氧化,氧化能力的提高和线粒体功能发生符合疾病的进展5。
萎缩和肥大信号通路是否改变隔膜的COPD患者一直缺乏研究。然而,这个地区是特别感兴趣的知道慢性阻塞性肺病是最常见的呼吸道疾病和隔膜最重要的吸气肌肉。ubiquitin-proteasome通路的潜在作用,核转录因子(NF) -κB通路,肌肉监管因素(mrf)和肌肉生长抑制素是目前的研究调查。
ubiquitin-proteasome通路是一个主要的蛋白水解系统参与肌肉蛋白质分解。之前由蛋白酶体降解蛋白质需要ubiquitinated,过程要求E1 ubiquitin-activating酶,E2和E3 ubiquitin-ligating ubiquitin-conjugating酶酶。后者是很重要的,因为它决定了哪些蛋白质是针对退化。在E3连接,MuRF1 MAFbx期间迅速上调肌肉萎缩,因此,作为标记ubiquitin-proteasome通路的激活。另一个E3-ligase Nedd4,显示是上调的情况下停止使用而不是异化的状态6。
古典NF-κB通路被激活在炎症过程。抑制蛋白质IκB退化后,p65 / p50转移到细胞核形成目标基因的炎症通路7。有趣的是,停止使用肌肉萎缩造成的卸载了激活另一个涉及p50和Bcl-3但不是p65 NF-κB途径7。
磁流变液,MyoD myogenin,属于基本helix-loop-helix转录因子。在成熟的骨骼肌,MyoD主要表达在增大肌肉和myogenin slow-twitch肌肉8。改变MyoD和myogenin已报告去神经引起的肌肉停止使用后,固定或后肢悬挂8。改变MyoD和myogenin建议驱动肌肉表型适应8。
最后,肌肉生长抑制素,骨骼肌肉的抑制剂,被证明能增加在萎缩引起的下肢卸载或微重力条件以及激素性肌肉萎缩9。肌肉生长抑制素被认为是抑制肌肉前体细胞的增殖和分化和调控ubiquitin-proteasome系统9。
这些通路的含义在隔膜重构以应对慢性阻塞性肺病仍然是未知的。因此,萎缩的标志信号的表达(MuRF1, MAFbx Nedd4 ubiquitin-proteasome通路,和IκBαIκBβ,p50 NF-κB通路和p65子单元),以及肥大信号(MyoD, myogenin和肌肉生长抑制素)测量膜片的COPD患者与对照组相比。
材料和方法
人口
隔膜肌肉活检获得19严重COPD患者和13个病人没有慢性阻塞性肺病(控制)。开胸活检获得在COPD肺移植的患者在oesophagectomy或叶切除术食管和肺癌,分别(T1-2阶段,N0-1 M0)没有慢性阻塞性肺病患者。从每个参与者获得知情同意。这项研究是大学医疗的伦理委员会批准Ziekenhuizen(比利时鲁汶)。
肺功能测试之前进行了手术。病人的特点如表1所示⇓。12的19 COPD患者服用皮质类固醇(甲强龙4毫克·天−1和8 mg·−1分别为8和4名患者)。
隔膜活组织检查
全层活检标本经肋隔膜。活组织检查的一部分被冻结在异戊烷组织学检查。另一部分是在液态氮冷冻和储存在-80°C,以确定标记的萎缩或肥大信号的作用。
组织化学
串行部分隔膜的苏木精和伊红染色法确定与肌纤维组织学变化和三磷酸腺苷酶测量纤维横截面积和比例。
RNA提取和实时定量PCR
总RNA孤立使用试剂盒的方法。反转录与上标三世第一链合成系统进行(表达载体、Merelbeke、比利时)根据制造商的指示。
定量rt - pcr检测进行ABI棱镜7700序列检测系统(应用生物系统公司、Lennik、比利时)使用铂Sybr绿色qPCR Supermix UDG工具包(表达载体),根据制造商的指示。在这项研究中使用的引物如表2所示⇓。18 s基因的表达被用来规范的量化目标的互补。
蛋白质的提取
大约40毫克的隔膜用于核和胞质蛋白的双重痛苦NE-PER装备根据制造商的指示(皮尔斯生物技术、Erembodegem、比利时)。蛋白质浓度测定采用布拉德福德法(Biorad,拿撒勒,比利时)。
凝胶电泳和免疫印迹
肌肉蛋白分离12% SDS-polyacrylamide凝胶和聚偏二氟乙烯膜转移到。膜是孵化与适当的初级和二级抗体(见补充材料)检测IκBα,IκBβ,MyoD, myogenin,肌肉生长抑制素或MAFbx。蛋白质与ECL +视觉检测设备(通用电气医疗集团,Diegem,比利时)。适当的核分离和cytoplasmatic分数评估而测量组蛋白H3(图E2在补充材料)和α-tubulin,分别。
NF-κB活动
激活NF-κB p50和p65被皮尔斯发现使用microtitre板测定生物技术。核蛋白质被孵化井涂以双链寡核苷酸NF-κB共识。绑定p50或p65被确认为各自的蛋白质和抗体检测与辣根peroxidase-coupled二级抗体ECL试剂,所推荐的制造商。发光信号读入光度计(f .克莱森斯提供的;非饱和Legendo比利时鲁汶)。
统计数据
使用一个未配对t检验(数据是正态分布),比较患者特点、mRNA和蛋白表达之间的两组。关系与皮尔森相关分析进行评估。的假定值≤0.05被认为是显著的。统计数据进行使用GraphPad软件(版本4.01;美国圣地亚哥GraphPad CA)。
结果
病人的特点
人体测量特征和肺功能表1中提供的数据⇑。慢性阻塞性肺病患者没有不同于控制对身高和年龄。身体质量指数显著降低在慢性阻塞性肺病患者。慢性阻塞性肺病患者严重(全球倡议慢性阻塞性肺疾病(黄金)III)或非常严重的慢性阻塞性肺病(黄金IV)。
隔膜组织化学
如图1所示⇓横截面积的I型和II型纤维显著降低了45%和30%,分别在COPD患者与控制。此外,有一个更高比例的I型纤维隔膜的COPD患者与对照组相比(73%与48%),II型纤维的比例下降。
讨论
目前的研究表明,萎缩和肥大信号改变隔膜的严重慢性阻塞性肺病患者。特别是NF-κB通路,ubiquitin-proteasome通路和肌肉生长抑制素被激活而MyoD信号很沮丧。隔膜萎缩和纤维适应较慢的形象也被观察到。
隔膜纤维转变和萎缩
与之前的研究结果相一致5,I型纤维的比例高的膜片慢性阻塞性肺病患者在这个研究。这适应被认为是有益的,因为慢性阻塞性肺病的隔膜会更耐疲劳1。这个转向较慢的概要文件也被观察到的水平SERCA的泵3。它也表明,静息能量消耗以隔膜张力时间衡量指数,增加神经驱动隔膜严重慢性阻塞性肺病在休息的时候4,10。这些改编建议由于连续超负荷的隔膜由于慢性阻塞性肺病。隔膜严重的慢性阻塞性肺病患者似乎经历长期温和持续的耐力训练5。在肢体的肌肉耐力训练的结果从快速转向缓慢纤维类型11。慢性阻塞性肺病患者的主要区别隔膜和肢体肌肉研究长期和持续的培训经历了由隔膜和年龄的人口,严重慢性阻塞性肺病影响老年人。此外,在终身训练的老年人,耐力训练的结果更大比例的I型纤维股外侧肌11。
在目前的研究中,I型和II型纤维的横截面积减少隔膜的COPD患者如前所述5。这些数据表明,尽管连续超载导致隔膜活动增加,慢性阻塞性肺病患者的隔膜萎缩发展。
磁流变液MyoD myogenin
本研究的数据表明,MyoD可能涉及纤维转变出现在慢性阻塞性肺病患者的隔膜。在骨骼肌中,改变MyoD和myogenin建议开车去神经等条件下纤维转移和卸货8。在这方面,MyoD减少将导致转向较慢,更多的氧化8。我们的研究显示减少MyoD信使rna和蛋白质水平的隔膜的COPD患者符合I型纤维比例的增加。逆MyoD蛋白质含量和I型比例之间的关系在当前研究中发现进一步支持MyoD纤维转移的一个角色。蛋白质含量减少膈MyoD最近仓鼠肺气肿模型所示12。
此外,calcineurin-nuclear因子激活t细胞(NFAT)通路,特别是诱发肌肉变成计划,可能扮演了一个角色在隔膜纤维转变COPD患者中观察到。过载的隔膜在这些患者可能激活钙调磷酸酶同时增加细胞内钙。的确,众所周知,钙调磷酸酶作为传感器的持续升高细胞内钙浓度。虽然不是在目前的研究中,调查calcineurin-NFAT的作用不应该被忽视。
肌肉生长抑制素
在目前的研究中,隔膜的慢性阻塞性肺病患者的肌肉生长抑制素mRNA水平降低,而其蛋白表达增加。肌肉生长抑制素mRNA和蛋白表达水平的差异之前报道在骨骼肌萎缩13,14。差异可能是相关的肌肉生长抑制素的auto-regulation机制基于负反馈循环活跃的肌肉生长抑制素蛋白水平增加的肌肉生长抑制素的差别导致对这些基因的mRNA的表达15。本研究的数据与这些研究结果一致。
隔膜的肌肉生长抑制素mRNA水平较低的COPD患者兼容I型纤维比例的增加肌肉生长抑制素是主要表达在fast-type纤维16。肌肉生长抑制素可能参与调节基因表达控制肌肉纤维类型。此外,肌肉生长抑制素基因被报道的目标基因MyoD肌肉生长抑制素的表达可以通过MyoD被激活17。膈MyoD在慢性阻塞性肺病患者的低水平的差别可能导致对这些肌肉生长抑制素mRNA。
令人惊讶的是,信使rna的肌肉生长抑制素水平,称为负调节肌肉的增长,减少在慢性阻塞性肺病患者的隔膜尽管出现萎缩。事实上,以前的研究在外围肌肉与我们的观察是一致的18,19。甚至有人认为,肌肉生长抑制素的作用将是肥大的抑制而不是萎缩的感应,由于增加了肌肉生长抑制素浓度并非足够的肌肉损失。
然而,在目前的研究中,肌肉生长抑制素蛋白水平在核和细胞质分数上调隔膜的COPD患者,和可能导致观察到的隔膜萎缩。事实上,一些研究报道加强废弃后动物的肌肉生长抑制素水平9和慢性肌肉萎缩患者9。
最后,肌肉生长抑制素蛋白在核分数的存在是有趣的但它并不新鲜13,16。事实上,肌肉生长抑制素蛋白被发现位于肌管的核心16,而在大鼠肌肉这显然是表示在核颗粒比在细胞质分数或总匀浆13。还需要进一步的实验来确定核肌肉生长抑制素的影响。
NF-κB通路
在目前的研究中,减少的内容cytoplasmatic IκBα和观察IκBβ隔膜的COPD患者,建议加强NF-κB信号。IκBα内容不如IκBβ下降。事实上,IκBακB识别序列在其启动子区域,因此,再合成NF-κB IκBα可以诱导;然而,这不是IκBβ20.。NF-κB p50 dna结合活性降低COPD患者的隔膜在目前的研究中,虽然p65 dna结合活性保持不变。然而,p50亚基能与另一个p50 dimerise单元,而这些为抑制基因转录21。类似的研究结果发表在2型糖尿病患者的股外侧肌和低级的慢性炎症22。有趣的是,抑制MyoD mRNA通过NF-κB被描述23。因此,增加NF-κB活动可能有助于减少膈MyoD蛋白水平在慢性阻塞性肺病患者。激活NF-κB也减少了MyoD蛋白稳定,所以可以促进MyoD退化24。NF-κB活动增加报道的股四头肌慢性阻塞性肺病患者体重较低,表明NF-κB的作用在这些患者的骨骼肌萎缩25。
ubiquitin-proteasome通路
Upregulation MAFbx mRNA的被发现在慢性阻塞性肺病患者的隔膜MuRF1 mRNA持平。这些数据符合轻度到中度COPD患者发现之前报道,也兼容增加蛋白质泛素化在慢性阻塞性肺病患者的隔膜5。有趣的是,MAFbx与特定的有关肌凝蛋白的降解26。因此,upregulation MAFbx隔膜的COPD患者符合减少隔膜肌凝蛋白内容发表在这些患者27。相反,MuRF1已发现目标的特定子集肌纤维蛋白,如肌28。保存隔膜COPD患者的肌小节的内容27在同意改变MuRF1 mRNA的表达。
在目前的研究中,Nedd4 mRNA显著下调隔膜的慢性阻塞性肺病患者。Nedd4是同源E6-AP羧基末端域包含E3 ubiquitin-protein连接酶已被证明是上调萎缩造成的减少肌肉紧张,但不是在恶病质萎缩6。减少被动隔膜张力存在于慢性阻塞性肺病患者27。减少肌肉紧张可能涉及整合素信号或肌转导。在COPD患者中,可变剪接的肌肌基因导致调制的春天段已被建议作为一个潜在的因素减少被动张力的拉伸隔膜纤维27。因此,看来这个减少肌拉伸不诱导Nedd4在当下研究的老年病。这些数据表明,被动的减少迫使代报道在慢性阻塞性肺病患者的隔膜不会诱发ubiquitin-proteasome通路的激活upregulation Nedd4。
潜在的触发
有几个因素与慢性阻塞性肺病,可能影响了不同的路径在当前研究调查。首先,缺氧,在COPD患者中,一个共同的特征就是抑制肌肉监管因素的表达29日和激活NF-κB通路30.。其次,隔膜缩短引起的肺恶性通货膨胀可能影响其中的一些途径。事实上,在慢性恶性通货膨胀,人类隔膜肌肉纤维减少休息肌节长度根据肺恶性通货膨胀的程度31日。增加蛋白水解作用可能参与肌节删除。因此,隔膜缩短可能间接导致ubiquitin-proteasome通路的激活。此外,增加机械载荷引起的肺恶性通货膨胀可能也导致MyoD和/或肌肉生长抑制素表达的变化而模仿耐力训练的效果。然而,在文献中没有明确的数据支持这一概念。此外,皮质类固醇使该细胞的MAFbx MuRF1,32,并有选择地减少MyoD表达式33和调控肌肉生长抑制素基因的表达9可能是促成改变在我们的研究报道。显然,慢性炎症,如发生在慢性阻塞性肺病患者,可能改变了其中的几个途径。众所周知,特别是循环细胞因子刺激通过ubiquitin-proteasome通路蛋白水解作用34和破坏MyoD24。
总之,这项研究表明,膜纤维萎缩和纤维适应较慢的概要文件中存在严重的慢性阻塞性肺病患者的隔膜。此外,一些信号通路改变隔膜的慢性阻塞性肺病患者。这些包括NF-κB通路的老年病,MyoD的差别ubiquitin-proteasome通路和肌肉生长抑制素,对这些。综上所述,这些改变可能导致隔膜COPD患者的功能障碍。
支持声明
d . Testelmans和m . Crombach同伴的昏聩voor Wetenschappelijk Onderzoek——Vlaanderen(比利时布鲁塞尔)和本研究支持的昏聩voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen (G.0386.05)。
感兴趣的语句
一份声明中对m . Decramer可以发现www.erj.ersjorurnals.com/misc/statements.dtl
确认
作者真诚地感谢t . Lerut p . De Leyn和d . van Raemdonck提供隔膜活检。他们也感谢移植协调团队的合作实验室团队。他们尤其感谢移植肺病学实验室的团队(Katholieke项目鲁汶鲁汶,比利时)与活检的存储他们的帮助。作者还要感谢p Weckx (anatomo-pathology实验室,鲁汶)切割和组织化学染色隔膜样品分析和f . Vanderhoydonck连续支持实时PCR。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2008年6月16日。
- 接受2009年8月12日。
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