抽象的
CD4 + CD25 + FoxP3阳性T型调节细胞在控制免疫和炎症反应方面具有重要作用。本作者假设这些细胞可以参与慢性阻塞性肺病(COPD)的发病机制。本研究的目的是表征Foxp3在非莫克斯人的大小气道中的表达,具有正常肺功能和COPD患者的吸烟者。
共有19名非吸烟者、20名肺功能正常的吸烟者和20名因孤立性周围非小细胞癌而接受肺切除术的中度COPD吸烟者被纳入研究。免疫组化方法评估FOXP3在大、小气道中的表达。
与不吸烟者相比,肺功能正常的吸烟者和COPD患者大气道中foxp3阳性细胞数量增加。大气道FOXP3表达与烟熏组呈显著正相关。在小气道中,与无症状吸烟者和非吸烟者相比,COPD患者foxp3阳性细胞数量减少,这与气流阻塞负相关。
为了得出结论,慢性阻塞性肺病的特征在于大型气道中的FoxP3阳性细胞,但小气道的下调,与气流限制相关。本研究的结果有助于更好地理解慢性阻塞性肺病的发病机制。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征是通过缓慢进展和不可逆的气道阻塞。吸烟被牵连作为COPD发展的主要危险因素,大约90%的COPD患者是吸烟者1.但是,只有少数吸烟者发展COPD。这种现象的基本原因仍然很差。
慢性阻塞性肺病的病理特征是大、小气道的炎症和肺实质的破坏,导致肺气肿的发展2.支气管活检显示单核细胞浸润,特别是CD8+ t淋巴细胞,而非中性粒细胞。在肺实质中也发现了类似的变化,在实质破坏部位巨噬细胞和CD8+ t细胞占优势。炎症是由转录因子上调的,如核因子(NF)-κB,粘附分子如细胞间粘附分子(ICAM)-1或趋化因子受体CXCR33.-5..
CD4+CD25+ t调节(Treg)细胞在实现外周免疫耐受、下调持续性炎症和通过抑制其他t细胞反应预防自身免疫反应方面非常重要6.那7..人中的调节CD4 + CD25 + T细胞在总CD4 + T细胞的1-3%之间,积聚在抗原侵袭的组织部位,其中它们施加位点局部的免疫抑制产生白细胞介素(IL)-10并转化生长因子(TGF)-β16..
treg有两种不同的种群:自然的和适应的。CD4+CD25+天然Treg细胞产生于胸腺,驻留于血液和外周血淋巴组织中。适应性CD4+CD25 Treg细胞是naïve t细胞遇到抗原提呈细胞提出的抗原后在周围产生的。适应性的和自然的treg都依赖于一种叫做叉头盒P3 (FOXP3)的基因8.那9..
Foxp3的细胞内表达目前被认为是人Treg细胞的最特异性标记。人FoxP3局部地位于X染色体编码的Scurfin上,其与IL-2促进剂和粒细胞 - 巨噬细胞菌落刺激因子增强剂附近,接近活性T细胞(NFAT)位点的核因子。Foxp3压抑这些基因,从而通过CD4 + T细胞减少IL-2产生7.那8..虽然FOXP3的表达主要局限于CD4+CD25+细胞,但它是在CD4+和CD8+ t细胞克隆激活后被诱导的。大多数表达foxp3的调节性t细胞存在于主要组织相容性复合体(MHC) II类限制性CD4+辅助t细胞群中,并表达高水平的白细胞介素-2受体α链(CD25)。最近的数据表明,FOXP3基因在特殊条件下也可在CD25- t细胞中诱导表达。这些诱导的FOXP3表达细胞也具有抑制能力,这表明FOXP3表达和调节功能之间存在紧密联系8..
Tregs功能障碍可导致自身免疫性疾病、过敏和慢性炎症8.-11.在自身免疫性疾病患者中,循环CD4+CD25+ t细胞水平降低,特别是在患有少年特发性关节炎、银屑病性关节炎、丙型肝炎、病毒相关混合冷球蛋白血症、自身免疫性肝病、系统性红斑狼疮和川崎病的患者中6.那11.低水平的循环CD4 + CD25 + T细胞也与疾病活性或预后差相相关。已经提出,如观察到的,由外周CD4 + CD25 + T细胞的增殖受损,可能会引起Treg细胞的下调体外.因此,促炎t细胞和调节性t细胞之间的平衡可能被破坏,导致自身耐受的崩溃12-15.
近年来,若干作者描述了COPD发病机制中的自身免疫组分的存在。Tarseviciene-Stewart.等等。16显示免疫内皮细胞的大鼠发生肺气肿。该疾病可通过血清或CD4+细胞被动转移到naïve大鼠。研究表明,该模型为自身免疫攻击可导致肺泡破坏的原理提供了证据。van der Strate的研究等等。17检查肺气肿患者肺部出现的淋巴滤泡,发现b细胞伴低克隆抗原特异性反应。在吸烟的老鼠身上也出现了类似的卵泡。其发展随时间呈递增趋势,并与空域扩大的增加有关。假设这些b细胞通过产生针对烟草烟雾残留物或细胞外基质成分的抗体,促进了炎症过程和/或肺气肿的发展和持续。李等等。18建议肺气肿可以具有通过抗胰蛋白抗体和T-辅助细胞(TH)型反应的特征的自身免疫组分18.此外,在吸烟的COPD患者中也观察到抗上皮抗体和烟草抗独特型抗体19那20..这些观察结果对Treg细胞在COPD发病机制中的作用提出了疑问。
最近,已经表明,在健康吸烟者和COPD患者的BAL流体中,Treg细胞增加了Treg细胞21.相比之下,巴塞罗等等。22显示具有保存肺功能的吸烟者具有突出的特雷格斯的突出性,即COPD患者缺席。还发现,与Foxp3 mRNA表达相关的肺气肿的肺部肺部肺部减少了CD4 + CD25 +阳性Treg细胞的数量18.
然而,在文献中没有数据表明FOXP3在吸烟的人的大气道和小气道中表达的比较。大气道炎症过程的性质可能与小气道不同。因此,本文作者试图比较FOXP3在不吸烟者、肺功能正常吸烟者和COPD吸烟者的大气道和小气道中的表达。
材料和方法
耐心
在研究中,共有59名受试者接受肺切除肺切除术治疗。他们被细分为三组:19个受试者是肺气通风功能正常的非吸烟者,20名受试者是目前肺功能正常的吸烟者,20个当前吸烟受试者具有中度COPD。根据慢性阻塞性肺病(金)指南全球倡议的定义建立了COPD的诊断1.COPD患者在一秒钟内具有强制呼气量(FEV1)/强迫肺活量(FVC)比率<70%和FEV1预测的50%至80%之间。没有一个研究受试者遭受最近的恶化,定义为与在研究前一月的痰液的质量和痰液的质量和数量变化相关的呼吸困难增加,这是在研究之前的一个月内。所有受试者都没有急性上呼吸道感染,没有在前一个月内接受糖皮质激素,茶碱或抗生素。所有受试者都是非植物,对常见过敏原提取物具有阴性皮肤测试,并且没有过去的哮喘或过敏性鼻炎的历史。
该研究由当地伦理委员会批准(paul Stradins临床大学医院伦理委员会,里加,拉脱维亚),符合赫尔辛基宣言;获得所有受试者的知情同意。各组的临床特征见表1⇓.
研究设计
小气道的肺组织标本取自胸膜下实质,而大气道的支气管环取自手术时尽可能远离肿瘤部位的肺叶的节段支气管。样品在不膨胀的10%中性缓冲福尔马林中固定,常规处理和包埋。
肺功能测试
根据在手术前一周内的英国胸部社会指南,对Jaeger Masterscreen Sporograph(Jaeger GmbH,Hoechberg)进行了肺功能测试。23.
免疫组织化学
对于免疫组织化学,将福尔马林固定的石蜡包埋的组织切割成4μm厚的部分。通过在国内微波治疗中实现抗原检索30分钟的柠檬酸盐缓冲液,pH6.0。将部分孵育在0.5%h中2O.2/ PBS以淬灭内源性过氧化物酶活性,然后用蛋白质块(Dako,Glostrup Denmark)封闭。然后将载玻片与初级单克隆小鼠抗人抗体孵育1小时(单克隆小鼠抗体,稀释1:100,克隆221d / d3; abd serotec,牛津,英国)。LSAB2套件(DAKO)用于与初生抗体的界定的可视化。简而言之,将载玻片在湿度室中温育30分钟,每次具有生物素化的二抗和链霉抗生物素蛋白,其在等渗缓冲液(pH 7.6)中的前后冲洗,三次5分钟。将3'3-二氨基苯甲酸四氯化硅烷(DAB)施用为色原(7分钟)。部分在血红素中染色(2分钟)。对于阳性对照,使用人腭扁桃体组织。通过省略初生抗体来进行阴性对照。
使用光学显微镜对气道进行分析,摄像机连接到计算机图像系统(Motic image Advanced 3.2,厦门,中国)。FOXP3的表达被鉴定为核免疫定位。两名病理学家(S. Isajevs和a . Kratovska)在不了解特定患者标本的临床数据的情况下,对病例进行编码和盲法测量。
细胞计数大气道
支气管从在手术中获得的叶片的节段支气管中取出,尽可能远离肿瘤部位。为每位患者鉴定至少两个直径> 2mm的完整气道。大型气道被定义为带粘膜腺体的软骨间支气管。大型气道中的Foxp3阳性细胞的数量随意调查,在每个截面的上皮和脑上,在每个部分中,不包括在鉴定出这些肌肉和粘液分泌腺体的区域。相关区域在捕获的图像上概述和使用图像分析软件测量的包含区域。所有细胞计数用cell·mm表示-2.
细胞计数小气道
小气道被认为是膜状支气管,没有软骨或腺体,内径<2mm,如前所述2.每位患者至少有4个直径< 2mm的完整气道。在每个气道中,定量检测上皮、粘膜下层和外膜中foxp3阳性细胞的数量。粘膜下层是指从基底膜远端边缘延伸至平滑肌内缘的区域,而外膜是指从平滑肌外缘延伸至肺泡附着体的区域。所有细胞计数用cell·mm表示-2.
统计分析
组数据用均数±表示sd用于功能数据或用于形态数据的中值(范围)。各组间功能数据采用方差分析,形态学数据采用Kruskal-Wallis检验。当差异显著时,组间比较采用ANOVA检验、unpaired t检验、Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney u检验。用斯皮尔曼秩法计算相关系数。p值<0.05被认为具有统计学意义。同一观察者在10张随机选择的切片上至少进行3次foxp3阳性细胞的重复测量,并用变异系数和类间相关系数评估观察者内的重复性。观察者内变异系数为6%,观察者内相关系数为0.88。
结果
临床研究结果
患者的临床特点及肺功能资料见表1⇑.正如选择标准所预期的,FEV的值1% pred和FEV1/FVC %在COPD患者中与非吸烟者和无症状吸烟者相比有显著差异。除非吸烟者组外,所有患者均为当前吸烟者。研究对象的年龄、体重和身高无显著差异。此外,无症状吸烟者与COPD患者的吸烟史无显著差异(27±14)相对30±15;p> 0.05)。非闻人组含有大约相同数量的男性和女性,但无症状的吸烟者和COPD患者主要是雄性。
大型航空公司的Foxp3表达
图1A⇓在大型气道中显示Foxp3表达。Foxp3主要在气道骨髓内裂皮中表达(图2⇓)。COPD患者的大型气道中Foxp3阳性细胞的中位数(范围)(26(14-48)细胞·mm-2)和肺功能正常的吸烟者(36(10-85)细胞·mm-2)明显高于非吸烟者(13(6-26)细胞·mm)-2;P = 0.001和P <0.0001)。此外,在将所有患者分析在一起时,捕获FoxP3阳性细胞数量与包装YRS之间存在正相关性(ρ= 0.697,P <0.0001;图4A⇓)。大型航空公司和FEV中的Foxp3阳性细胞数量较弱的负相关性1% pred (ρ = -0.32, p = 0.01;图3⇓)。
小型气道中的福索普3表达
图1B.⇑在小型气道中显示Foxp3表达。COPD患者小型气道中FoxP3阳性细胞的数量(7(2-12)个细胞·mm-2)明显少于肺功能正常的吸烟者(14(3-36)个细胞·mm-2;p = 0.005)和非摩托者(13(4-22)个细胞·mm-2;p = 0.001)。
小气道foxp3阳性细胞数与FEV呈弱正相关1% pred (ρ = 0.35, p = 0.02;图3 b⇑)。Foxp3阳性细胞数和烟雾包装Yrs之间没有显着的相关性(图4B⇓)。
在分析内分析时,COPD患者和具有正常肺功量的吸烟者的FoxP3阳性细胞的数量与大型气道相比,小气道(P = 0.0002和P <0.0001)。
讨论
本研究表明,COPD吸烟者大气道FOXP3表达增加,而COPD患者小气道FOXP3阳性细胞数量减少,这与气流受限有关。
在所有吸烟者的大型气道中增加了禽类3阳性细胞的数量,与烟熏包装的阳性相关是令人惊讶的。鉴于该T淋巴细胞亚贫化在组织稳态中的相关性,这种观察与旨在保护或修复来自目前烟草吸烟引起的损伤的生理反应相容24那25.导致吸烟者Treg淋巴细胞上调的具体分子机制尚不清楚。作者推测,吸烟的某些成分和/或随后炎症反应的产物的直接刺激作用可能导致了这一结果。
斯明等等。21最近的研究表明,在BAL液中,健康吸烟者和COPD患者的Treg细胞上调。此外,FOXP3 t细胞计数与烟熏包年显著正相关。相比之下,Barcelo等等。22在BAL流体中证明,在COPD患者中不存在的无症状吸烟者中的Tregs突出上调。本研究结果通过表明具有和不带COPD的吸烟者的大型气道中的禽类3阳性细胞数量增加与小型气道中的细胞数不相关,在COPD患者中发现了较少的Treg细胞。与此同时,在本研究中,无症状吸烟者和COPD患者之间的吸烟包装史没有差异。因此,应排除吸烟的效果。
目前的研究发现,吸烟者的小气道中FOXP3阳性细胞的数量没有变化,尽管他们有吸烟习惯,但FOXP3阳性细胞的数量没有变化,而COPD吸烟者与不吸烟者相比FOXP3表达减少,这与气流限制呈正相关。
目前的结果与Lee的研究一致等等。18,从肺气肿患者中展示了肺组织中的CD4 + CD25 + Treg细胞数量下降,这又与Foxp3 mRNA表达相关。这种COPD患者小型气道中的FoxP3阳性Treg细胞响应的这种模式实际上与从支气管肺泡灌洗液中获得的γδt淋巴细胞的响应非常类似,这是涉及组织修复的T淋巴细胞的另一个亚群26.此外,在动物模型中,Treg淋巴细胞敲除小鼠(这种t细胞亚群的特征在小鼠和人类之间惊人地相似)表现出明显增加的炎症反应27.
尽管有大量吸烟消耗,但目前的结果支持证据表明Foxp3 Treg细胞抑制了维持正常肺功能的吸烟者中的炎症反应。相比之下,在开发COPD的吸烟者和无法进行有效的Treg反应的人中,炎症反应不受控制地进行。
为什么FoxP3 T细胞在大型航空公司中上调,但在具有COPD的吸烟者的小型气道中下调,因此是非常有趣的。本作者假设抗原或其表位可能在大型和小气道之间有所不同。例如,在小型气道中,这些可能是由Tarseviciene-Stewart的假假设的弹性分解或内皮细分产品的产品等等。16.有研究表明,暴露在香烟烟雾中可诱导先天免疫系统细胞分泌蛋白水解酶,释放肺弹性蛋白片段,在易感个体中可启动T细胞和b细胞介导的抗弹性蛋白免疫。结果表明,肺气肿以存在抗弹性蛋白抗体和Th1反应为特征,并与肺气肿的严重程度相关18.另外,证明了弹性纤维的体积减少到COPD患者中的小型气道和肺泡中的相似程度,与气流限制相关28.
此外,建立烟草吸烟调节淋巴细胞的增殖和死亡途径,可以通过干扰凋亡细胞的间距来通过直接氧化现有蛋白或间接地产生新的表位,从而将沉淀的细胞内抗原暴露于免疫系统。此外,由环境颗粒产生的病毒感染和氧化应激也可能有助于开发新/改变的表位29那30..
在任何研究中,都有一个令人困惑的因素,那就是从肺癌患者的手术中提取的肺组织的独特特征。有人认为,癌症本身可能会影响实验结果。然而,在这项研究中,外科标本是唯一可用来检查大小气道的材料。尽可能远离肿瘤部位的肺组织被检查,对照组也包括肺癌患者;因此,目前的作者感到自信的发现是有效的。
综上所述,慢性阻塞性肺疾病的特征是大气道中foxp3阳性t调节细胞上调,而小气道中foxp3阳性t调节细胞下调,从而导致肺组织中持续的和改良的炎症反应。
支持声明
该研究得到了欧洲社会基金会(ESF)补助金的支持。
兴趣表
没有宣布。
致谢
作者要感谢N. Jurka(拉脱维亚大学实验医学研究所,拉脱维亚里加)的初步统计分析。
- 收到了2007年的11月2日。
- 公认2008年7月23日。
- ©ers Journals Ltd