摘要gydF4y2Ba
外泌体是通过内体隔室的向内萌发形成的30-100nm直径囊泡,并且由几种细胞类型产生,包括T细胞,B细胞和树突细胞(DC)S。从DCS表达主要的组织相容性络合物(MHC)I类和II类和其表面上的共刺激分子,并且可以诱导特异性T细胞的抗原活化。gydF4y2Ba
本研究的目的是研究来自健康个体的支气管肺泡灌洗液(BALF)的外来体的存在,并建立这些外来患有MHC和共刺激分子。gydF4y2Ba
作者分析了来自七个健康志愿者和使用的外来体从单核细胞衍生DC(MDDC)培养物为基准取BALF。超速离心后,外泌体结合于抗MHC class II包被的磁珠并通过流式细胞术和电子显微镜分析。gydF4y2Ba
作者首次报道外泌体存在于BALF中。这些外泌体与MDDC衍生的外泌体相似,因为它们表达MHC I类和II类、CD54、CD63和共刺激分子CD86。gydF4y2Ba
结果表明,外泌体存在于肺中,由于它们包含主要的组织相容性复合体和共刺激分子,因此它们很可能来自抗原呈递细胞,可能在局部免疫防御中发挥调节作用。gydF4y2Ba
这项工作是由瑞典研究理事会(16X-7924,74X-14182,和6537赠款没有。)的支持下,瑞典议会的工作生命科学,瑞典哮喘和过敏协会研究基金会,Hesselman基金会,Konsul TH伯格基金会瑞典心肺基金会,基金会Vårdal,中心过敏研究的卡罗林斯卡医学院,在国王奥斯卡二世禧基金会,国王古斯塔夫V第80个生日基金和卡罗林斯卡研究所。gydF4y2Ba
外泌体是由不同细胞类型产生的30-100nm直径的囊泡,包括网状细胞gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,血小板gydF4y2Ba2gydF4y2Ba, B淋巴细胞gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,t淋巴细胞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,肥大细胞gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,上皮细胞gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和树突状细胞(DC)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba.外来体是由向内出芽内体区室的限制膜,称为多泡体(MVB)S的形成gydF4y2Ba8gydF4y2Ba.在抗原递呈细胞(APC)■MVBs是加载主要组织相容性复合体(MHC)II类和循环MHC I类分子与外源性抗原的主要场所。所述MHC分子位于既在限制膜和在内部囊泡。当MVBs与质膜融合的内部囊泡细胞外释放并成为外来体gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.APCs分泌外泌体,携带肽负载的MHC分子,可以刺激T细胞增殖gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.当使用大鼠肥大细胞的外泌体来表达小鼠或人类MHC II类分子时,也发现了T细胞刺激gydF4y2Ba9gydF4y2Ba.在小鼠模型中,外泌体已经显示出良好的用作癌症治疗工具的潜力,其中具有肿瘤肽的MHC分子的外泌体用于肿瘤根除gydF4y2Ba7gydF4y2Ba.APCs的外泌体不仅表达MHC分子,还表达协同刺激分子,如CD86。它们进一步表达细胞表面未检测到的蛋白,如四跨蛋白CD63和CD82gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,它与膜蛋白相互作用,例如整联蛋白和人白细胞抗原(HLA)-DRgydF4y2Ba10gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
外泌体不仅可以在T细胞活化中具有作用,而且还可以用作免疫系统中细胞之间的通信器。肠上皮细胞分泌外出的囊泡,其中有利于肠上皮和粘膜中的T细胞之间的交叉通信或血液中的T细胞gydF4y2Ba6gydF4y2Ba.在T细胞受体(TCR)触发时,T细胞产生表达TCR和CD3的外渗囊泡,其可以将信号传递给靶细胞的靶细胞,以右肽复合物递送靶细胞gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
肺部不断暴露于吸入颗粒,并且具有许多毛细管,使其在环境和内部组织之间的粘膜脆弱的表面。因此,有一个强大的局部免疫防御是重要的。外泌体是否是肺部肺部这种防御的一部分。本研究的作者研究了来自健康个体的人支气管肺泡灌洗液(BALF)中的外泌体,使用来自单核细胞衍生的DCS(MDDC)的外泌体作为参考。作者首次使用流式细胞术和电子显微镜(Em)来显示,所述外泌体存在于BALF中。作者发现,选择用于MHC II类表达的这些外索体,例如衍生自MDDC培养物的外泌体,表达HLA-DR,MHC I类,CD54,CD63和共刺激分子CD86。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
主题gydF4y2Ba
我们分析了7名22-51岁不吸烟的健康个体(中位数为25岁)的BALF,其中2名男性和5名女性。均无特应性病史,血清免疫球蛋白E值均正常(<120 kUL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba, immuncap, Pharmacia Diagnostics, Uppsala,瑞典),研究前胸部x线片正常,且无呼吸道感染症状≥1个月。当地伦理委员会批准了该研究,并获得了所有受试者的知情同意。gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液和手机的处理gydF4y2Ba
如前所述进行支气管肺泡灌洗(BAL)的支气管镜(BAL)(五个50mL磷酸盐缓冲盐水(PBS))gydF4y2Ba11gydF4y2Ba.然后,BALF通过双层涤纶网(Millipore, Bedford, Ireland)过滤,并以400×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下10分钟。细胞活力由台盼蓝排除测定,并以> 90%确定。对于差异细胞计数,以20×制备细胞螺旋素gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟并在May-GrünwaldGiemsa染色。总共计数了500个细胞。gydF4y2Ba
从外周血产生单核细胞衍生的树突细胞gydF4y2Ba
从卡罗林斯卡医院血库(卡罗林斯卡医学院,瑞典)六名健康献血者白细胞层被用于发电的MDDC的如前所述gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.通过密度离心在Ficoll Paque(Amersham Pharmacia Biotech Ab,乌普萨拉,瑞典)上分离外周血单核细胞。CD14.gydF4y2Ba+gydF4y2Ba根据制造商的说明,使用抗CD14 Microbeads(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach,Bergisch Gladbach,Bergand)阳性选择单核细胞。通过流式细胞术分析分离的细胞,其表达CD14和纯度范围为88-96%(中值92%,n = 6)。将细胞稀释至4×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞·ml.gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4存在下培养7天gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.如前所述,培养基从外泌体中耗尽gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.在第7天,通过流式细胞术分析了MDDCs,并具有典型的不成熟表型gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.CD1a的表达范围为81-91%(中位数为86%,n=6)。gydF4y2Ba
外泌体制备gydF4y2Ba
BALF储存在由七个健康志愿者或从培养7天的MDDC cellsupernatants -80℃,被用于外来体的制剂。与较小的修改先前描述的方法纯化的外来体gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.上清液3000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba室温(RT)20分钟,以10,000×超速离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下30分钟去除细胞碎片。对于Exosomes的收集,上清液以110,000×超速离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C保存1小时。外泌体被洗涤并在PBS中重悬,在−80°C保存。根据制造商的说明,使用BioRad DC蛋白测定法(Bio‐Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)测定外泌体样品的蛋白质含量。BALF制备的外泌体蛋白含量为0.20 ~ 0.51µg protein·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,median 0.30 µg protein·mL−1gydF4y2Ba,原始卷Balf,n = 7。gydF4y2Ba
外泌体涂层到珠gydF4y2Ba
外泌体吸附在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.01%叠氮化钠在RT下过夜与小鼠IgM预涂在PBS中的抗人II类MHC(DYNAL®,奥斯陆,挪威)的DynabeadsgydF4y2Ba15gydF4y2Ba.来自MDDC上清液(MDDC-Exosomes)的eXOSOMES的导频实验显示珠子以1μg蛋白质的浓度饱和至外蛋白至1μl珠子(〜4×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba珠子)。作者还测试了来自BALF(BALF-Exosomes)的外来珠子的饱和度。在这里,作者需要多达10倍的蛋白质,以使抗MHC II类珠子饱和。由于BALF-EXOSOMES的限制量,作者将珠子涂有HLA-DR为≥17的平均荧光强度(MFI)的珠子。同种型匹配对照抗体的MFI标准化为10个荧光单元gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.对于EM,作者使用4-5µg蛋白每1µL珠作为BALF‐外泌体,1µg蛋白每1µL珠作为MDDC‐外泌体。由于外泌体数量有限,作者无法使用流式细胞仪和EM分析来自所有个体的所有分子的外泌体。gydF4y2Ba
流式细胞仪gydF4y2Ba
通过流式细胞术分析来自七个健康志愿者,MDDC-EXOSOMES和来自六种献血者的DC的BALF-外泌体。使用以下小鼠单克隆抗体(MAB):抗HLA-DR(荧光素异硫氰酸盐(FITC)),抗CD14 FITC和抗CD54植物(PE)(PE)(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA),反CD86 FITC,防CD80 FITC,防CD40 FITC,抗MHC等级I FITC,防CD63 PE(Pharmingen,San Diego,CA,USA)和抗CD1A PE(Coulter Corporation,Hialeah,FL,USA)与同种型匹配的对照(Becton Dickinson)进行比较。将珠粒上的细胞或外泌体与MAb在冰上孵育30分钟,在黑暗中,在PBS中,具有0.05%氧化钠和0.5%BSA的细胞和含有0.01%氧化钠和0.1%BSA的PBS的外索体。通过荧光激活的细胞分选分类来分析样品(Becton Dickinson)。至少10个gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞和至少5×10gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba对每个样品的珠子进行了检查。同型匹配对照的MFI归一化为10荧光单位。使用MDDC‐外泌体进行五次检测,评估FACS染色的差异。MFI为同型对照抗体小鼠IgGgydF4y2Ba2gydF4y2Ba用于HLA-DR的CD14和55.3±1.34的-FITC为10.0±0.05,10±0.05。基于这些观察结果,作者将末端点设置为10.2(10.0 + 3×SD用于同种型对照抗体)的末端点。gydF4y2Ba
通过流式细胞术分析来自BALF的细胞,用于使用一抗抗体和二次PE缀合的抗- 使IgG抗体(Dako Corporation)。至少10个gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在FACSCalibur流式细胞仪检查每个样品的细胞。gydF4y2Ba
电子显微镜gydF4y2Ba
来自三个健康志愿者的Balf-Exosomes和从一个血液供体的MDDC-Exosomes涂覆到珠子上并与纯化的小鼠IgG孵育gydF4y2Ba1gydF4y2Baanti - CD63 mAb (PharMingen)和纯化的大鼠IgGgydF4y2Ba2gydF4y2Baanti - HLA - DR mAb (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA)在4°C过夜。反复洗涤后,用5 nm金标记的抗大鼠IgG抗体和10 nm金标记的抗小鼠IgG抗体(Sigma化学公司)孵育珠。然后将外泌体包裹的小球成球(13,400 g, 30分钟,RT),并在3%戊二醛中固定在0.1 M卡可迪酸钠‐HCl缓冲液(pH 7.3)和0.05 M蔗糖中。标本用1.5%四氧化锇、0.1 M卡可酰酸缓冲液(pH 7.3)和0.5%亚铁酸钾在4℃下固定90分钟,乙醇脱水,用2%乙酸铀酰乙醇染色,环氧树脂包埋。使用Leica Ultracut (Leica/Reichert, Vienna, Austria)切割50-70 nm厚度的切片,在网格上采集,用柠檬酸铅染色,并在Philips CM120 EM (Philips, Eindhoven, The Netherlands)中检查。统计每种制剂的50个外泌体上的金颗粒数量,并与同型匹配对照小鼠IgG进行比较gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(达科,Glostrup,丹麦)和鼠IgGgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(PharMingen公司),和每外来体的金颗粒的平均数计算。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗液细胞计数gydF4y2Ba
从所有七个人中检索并计数BALF细胞(表1gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).结果类似于健康的非闻名者的对Bal细胞的先前报道gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,以巨噬细胞为主,少数为淋巴细胞、肥大细胞或中性粒细胞。偶见少量上皮细胞。流式细胞术分析了所有7例患者的BALF细胞,发现它们表达HLA‐DR、CD14和CD86(表1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
外泌体存在于支气管肺泡灌洗液中gydF4y2Ba
外泌体支气管肺泡灌洗液中的所有七个人用流式细胞仪检测。The BALF‐exosomes expressed HLA‐DR, CD54, CD63 and CD86 (table 2⇓gydF4y2Ba和图。 1⇓gydF4y2Ba).此外,三分之二的人的外泌体显示MHC I类表达(表2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).在BALF‐外泌体上发现的分子与MDDC‐外泌体上发现的分子一致(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).此外,MDDC-Exosomes表达了CD40和CD80,在Balf外泌体上未检测到该CD40和CD80。BALF外出体供体之间的MHC I类和II表达的水平也是MDDC-EXOSOMES的(表2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).作者未检测到任何CD3或CD14的表达(表2)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba和图。 1⇓gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
BALF外泌体和MDDC外来物在通过免疫em分析时对CD63和HLA-DR具有阳性染色(图2gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba).根据以前的发现,外泌体的大小为30-100nmgydF4y2Ba17gydF4y2Ba.BALF‐外泌体有更多的抗CD63标记(中位数,1.7;范围,1.2-2.1抗体/外泌体)比抗- HLA - DR标记(中位数,0.1;范围0.1 - -0.2 /外来体)的抗体。相比之下,MDDC外泌体的HLA‐DR标记(2.5抗体/外泌体)高于CD63标记(0.6抗体/外泌体)。流式细胞术分析外泌体时,这一点也很明显(表2)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba和图。 1⇑gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
作者首次证明外泌体存在于从健康个体获得的BALF中,它们与MDDC外泌体相似,表达HLA‐DR, MHC I类,CD63,以及CD86和CD54。gydF4y2Ba
用MDDC外泌体饱和珠粒所需的蛋白质水平是高度可重复的,支持MDDC上清液是外泌体的可靠来源的理论。需要较高水平的蛋白质以使抗MHC II型磁珠与Balf外来渗透,可能是因为来自BALF的外来来自不同的细胞来源,包括MHC II类阴性细胞。与MDDC外来体相比,抗MHC II型磁珠饱和需要较高的蛋白质水平的另一个原因可能是来自BALF的外泌体的纯化可能导致表面活性剂的共纯化,这是一种复杂的脂质混合物和脂质的混合物肺功能至关重要的蛋白质gydF4y2Ba18gydF4y2Ba.因此,表面活性剂可以有助于来自BALF的外出组制剂中的总蛋白质含量。与MFI通常的原因与MDDC外来组相比,BALF外泌体可能是由于由于狭窄的BALF外泌体的量而没有饱和的珠子。gydF4y2Ba
来自DCS的外泌体发现的MHC I和II,CD63,CD86和CD54的表达符合先前的研究gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,也是CD14的缺失和CD80的表达不良gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.然而,CD40对MDDC外来体的检测是相互矛盾的调查结果ofClaytongydF4y2Ba等等。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba谁是无法检测CD40。MHC和共刺激分子不仅存在于从外来体的DC,因此在BALF检测外来体也可能从其它细胞类型中导出。从肠上皮细胞的外来体承受两个MHC I类和II类分子,除了CD63gydF4y2Ba6gydF4y2Ba.CD54,CD86,CD40和MHC II类已被发现对肥大细胞衍生的外来体gydF4y2Ba19gydF4y2Ba.此外,已经在衍生自B细胞的外索体上检测到CD54,CD86,CD63和MHC等级I和IIgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.来自T细胞的外泌体已被证明携带CD63和MHC I类和II类分子gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.可以预期,BALF中检测到的大多数外泌体来自巨噬细胞,因为它们是迄今为止最主要的细胞类型(表1)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba).另一种可能性是一些外来体源自在BALF中没有恢复的细胞,gydF4y2Ba例如gydF4y2Ba上皮细胞。gydF4y2Ba
CD86是一种共刺激分子,可重视预防厌氧,诱导克隆膨胀和T细胞的分化gydF4y2Ba21gydF4y2Ba.CD54是一种粘附分子,可与淋巴细胞功能相关抗原(LFA) 1相互作用,将T细胞像DCs一样保留在apc表面gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,它还可以向T细胞提供共刺激信号gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.此外,CD54对细胞迁移很重要。外来物位于抗原进入部位的肺中的事实,并且这些外来表达MHC II类和I,以及CD86和CD54,表明外来物能够归还淋巴中的T细胞区域节点并通过粘附和呈递抗原以及提供共刺激信号,具有在T细胞刺激中的作用。此外,它们可以在刺激肺中存在的记忆T细胞中具有作用。外来肌瘤上的CD54可以引发对其他细胞类型的粘附性,从而递送免疫系统的细胞之间的信号。在最近的研究中,发现外泌体能够促进DCS之间的功能肽MHC复合物的交换,这可以增加承载某种肽的DC的数量gydF4y2Ba24gydF4y2Ba.另一项研究表明,滤泡树突可以获取来自其他细胞的微泡gydF4y2Ba25gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
外来体的确切功能gydF4y2Ba在体内gydF4y2Ba仍然是未知的。APC可以分泌患有抗原负载的MHC分子的外索体,这可能有助于刺激T细胞并产生扩增的免疫反应。或者,可以分泌外来以抑制T细胞活化并保持免疫系统平衡。鼻孔状结构称为耐受性,从小肠上皮细胞释放gydF4y2Ba26gydF4y2Ba.Tolerosomes携带MHC II类与从肠腔采样结合的抗原肽,和能够诱导抗原特异性耐受的幼稚受体大鼠gydF4y2Ba26gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
综上所述,目前的研究结果表明外泌体存在于支气管肺泡灌洗液中。它们表面存在I类和II类主要组织相容性复合体,以及CD86、CD63和CD54。这表明外泌体可能在气道抗原暴露期间的抗原传递或免疫调节中发挥作用。作者有关于在结节病患者和桦树花粉过敏患者的支气管肺泡灌洗液中存在表达人白细胞抗原‐DR的外泌体的初步数据。未来的任务将是研究外泌体在肺炎症反应中的作用。gydF4y2Ba
- 收到gydF4y2Ba2003年4月14日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2003年5月29日。gydF4y2Ba
- ©ers Journals LtdgydF4y2Ba