摘要
普通感冒是一种非常普遍的、不复杂的上呼吸道疾病。然而,鼻病毒(RV)感染可导致哮喘加重,气道高反应性和支气管炎症恶化。目前的作者质疑这种肺内气道的累及是否是疾病特异性的。
12名非特应性健康受试者(1秒用力呼气量(FEV)1.) >80%预测,激发浓度导致FEV下降20%1.(PC20.) > 8 mg·毫升−1.)实验感染RV16。旁边的电脑20.对甲胆碱(MFEV)的最大反应1.和Mv′40便士),检测RV16接种前和接种后6天支气管活检中黏膜炎症细胞和上皮细胞间粘附分子(ICAM)‐1的表达。
RV16感染导致最大气道狭窄程度小但持续增加,而PC无变化20..RV16后支气管上皮ICAM‐1表达显著增加,而炎症细胞计数没有变化。而黏膜下CD3+细胞数量的变化与Mv′40便士.
综上所述,鼻病毒感染在正常受试者中诱导了有限但显著的最大气道狭窄增加,这与支气管T细胞数量的变化有关。连同支气管上皮细胞间粘附分子1的上调,这些发现表明,即使在健康受试者中,鼻病毒感染也会影响肺内气道。
本研究由荷兰“Stichting Astma Bestrijding”资助。
急性上呼吸道感染是人类最普遍的疾病1.. 它不仅导致缺课和缺勤,而且每年还导致高昂的治疗费用1..最常涉及的病毒有腺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒和鼻病毒2.,3.. 后者是普通感冒的主要原因,血清型>1001.–3..幸运的是,对于健康人来说,普通感冒通常是一种持续时间很短的自限性上呼吸道疾病。
然而,对于已经患有呼吸道疾病(如哮喘)的人来说,普通感冒通常与疾病的短暂恶化有关,有时甚至会导致危及生命的恶化4.这些临床和流行病学数据得到了使用实验性鼻病毒(RV)感染的人类研究的支持。实验性感染RV16的哮喘受试者表现出症状恶化、可变气道阻塞和气道高反应性,与敏感性增加相关5.并增加最大气道狭窄到支气管收缩剂6..这些生理结果强烈提示肺内低气道受累。事实上,在一项联合使用哮喘和非哮喘受试者的研究中,在RV16感冒实验中发现了支气管黏膜淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的增加7.. 然而,这种下呼吸道炎症是否具有疾病特异性,或者是否同样发生在非过敏性非哮喘受试者身上,仍有待确定。
在本研究中,测试了零假设,即健康受试者RV感染不会导致气道反应性恶化或可证明的气道炎症降低。因此,我们仔细选择了一组非特应性非哮喘受试者,在实验RV16感染前后,研究吸入methacholine的剂量/反应曲线和支气管活检标本的粘膜炎症程度。
材料和方法
学科
招募了12名不吸烟、非特应性、非哮喘的健康受试者(表1)⇓).他们的基线肺功能(肺活量测定)在正常范围内(一秒用力呼气量(FEV)1.) >80%预测),吸入methacholine反应正常(刺激浓度导致FEV下降20%1.(PC20.) > 8 mg·毫升−1.)8..通过对16种常见空气过敏原提取物进行皮肤点刺试验(ALK Abelló, Nieuwegein, Netherlands),结果为阴性。通过RV16血清中和试验(≤1:2血清稀释20-25×50%组织培养感染剂量(TCID),研究对象获得了低滴度的RV16特异性循环抗体50)). 该研究由荷兰莱顿莱顿大学医学中心医学伦理委员会批准,受试者给予书面知情同意。
设计
通过连续2天(第0天和第1天)接种RV16进行实验性RV感染。每天进行乙酰甲胆碱激发试验−3、5和14,以获得气道敏感度和最大气道狭窄。在两天内抽取血样−第2天、第3天、第6天和第27天进行洗鼻−2、3和6。在第天通过纤维支气管镜进行支气管活检−2和6。
Rhinovirus-16接种
RV16接种物是从先前在人体实验中使用的同一菌株和原种中获得的在活的有机体内5.,6..总剂量为0.6–24×104.TCID50稀释成3 根据先前描述的程序,向每位受试者施用含有0.5%(重量/体积(w/v))明胶的mL Hanks平衡盐溶液(HBSS)5.,6..RV16感染的确认是通过血清中病毒特异性中和抗体滴度至少增加4倍和/或通过鼻冲洗后病毒恢复而确定的。排除了可能的并发呼吸道感染5.,6..此外,受试者每天对自己的感冒症状进行三次评分,评分分为四分5.感染后的最高感冒评分见表 1.⇑.
外周血白细胞计数
在接种病毒前和接种后第3天和第6天,通过自动血细胞计数分析(Technicon H1;Technicon, Tarrytown, NY, USA)。
气道反应性
根据2分钟潮气呼吸法进行标准化乙酰甲胆碱激发试验8..用FEV测量响应1.以及较敏感的部分流量/体积曲线(40%的强制肺活量仍未耗尽时的流量(v′40便士))5.,8..气道敏感性是通过刺激浓度的methacholine导致FEV下降10%来确定的1.(PC10FEV1.)而40%的人在v′40便士(PC40v′40便士).最大响应(MFEV)1.和Mv′40便士)的计算方法是将剂量反应平台上的连续点平均,或者在没有平台的情况下,取最高的数据点6..
支气管镜检查和活检处理
纤维支气管镜检查是根据标准化和验证的协议进行的9.在(亚)节段水平取6个活检标本。3个活检立即固定在10%的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲福尔马林(v/v)中,3个活检包埋在鸟酰氨甲酰转移酶(OCT)培养基中。诊断部门,埃尔克哈特,美国)和快速冷冻在异戊烷由冰二氧化碳冷却9.福尔马林固定活检标本被石蜡包埋并保存,直到进一步处理。快速冷冻的样品保存在−70°C的密封容器中。
支气管活检标本免疫组化染色
细胞标记物
3µm厚切片石蜡包埋组织免疫组化染色。抗CD3、CD4、CD8、CD68、胰蛋白酶(AA1)和中性粒细胞弹性酶的细胞型特异性抗体来自DAKO (Glostrup,丹麦),抗嗜酸性粒细胞(EG2)抗体购自Pharmacia (Uppsala,瑞典)。用适当稀释的一抗、二抗和结合辣根过氧化物酶的链霉亲和素-生物素三级复合物(SABC/HRP)证明抗原表达。3‐氨基‐9‐乙基咔唑(AEC)被用作显色剂。用辣根过氧化物酶偶联抗鼠EnVision系统(DAKO)检测CD4, NovaRED (Vector, Burlingame, CA, USA)作为显色原。这些切片用梅耶尔的苏木精(Klinipath, Duiven, Netherlands)进行了反染色。阴性对照,一抗省略9.
支气管活检分析
细胞标记物
使用三片彩色相机(1.732×10)获取染色切片的数字图像6.像素;1320×992µm2.;3×256灰度值)(蔡司视觉KS-400系统;康特隆/蔡司,Weesp,荷兰)。采用经验证的方法对上皮和固有层进行全自动或点交互(上皮中的CD3+和CD4+细胞)细胞计数9.阳性细胞以细胞数·0.1 mm表示−2..
细胞间粘附分子1
对上皮内ICAM‐1的染色进行半定量分析,采用四分制的染色强度(0=缺失,1=弱,2=中等,3=强烈)10.半定量ICAM - 1染色观察者内评分的变异性,表示为加权κW(κW> 0.7)。
统计分析
个人电脑10FEV1.,电脑40v′40便士,细胞计数进行log转化后进行统计分析。配对t检验用于比较感染前后的细胞计数和功能数据。应用Wilcoxon签名秩检验检测ICAM‐1染色的差异。结果参数之间的关系采用Spearman相关检验。p‐值≤0.05被认为具有统计学意义。
结果
除排除在分析之外的10例患者外,所有受试者均确认RV16感染。第1例患者在接种病毒后第6天退出,因为在第二次支气管镜检查中出现了利多卡因相关的不良反应。在任何鼻腔清洗中均未检测到其他呼吸道病毒(表1)⇑).感染后普通感冒症状评分较感染前显著增加(平均±sem)(第3天:0.91±0.34;postinfection: 3.73±0.73;p = 0.003)。与第2天相比,第3天外周血白细胞计数显示淋巴细胞数量显著下降(第2天:35.5±1.4;第三天:29.9±1.3%;P =0.006),随后在第6天显著回升至基线值(35.9±1.6%;p = 0.0008)。然而,外周血中性粒细胞计数在RV16感染期间没有显著变化(第2、3和6天:51.6±1.7、55.3±1.6、51.3±1.5%;p > 0.08)。
气道反应性
在研究期间,基线FEV没有显著变化1.与研究开始时的值相比(p>0.1)。感染后PC无明显变化10FEV1.和电脑40v′40便士(p > 0.1)。然而,两种MFEV测定的对甲胆碱的最大反应1.和Mv′40便士,感染病毒后第5天较感染前显著升高。第14天,两个MFEV1.和Mv′40便士与基线值无显著差异(p>0.1)(图。 1.⇓).
支气管活检
细胞间粘附分子1
RV16感染与支气管上皮细胞ICAM‐1表达显著增加相关(评分0、1、2和3:preRV16: 0、37.5、62.5和0%;postRV16: 0、0、62.5、37.5%;p = 0.048)。
讨论
本研究结果显示,在非哮喘、非哮喘志愿者中,实验性RV16感染对最大气道狭窄至乙酰甲胆碱的影响较小,但一致。支气管上皮中ICAM-1的表达显著增加。尽管与对照组相比,支气管炎性细胞数无显著变化因此,RV16感染后支气管固有层CD3+细胞的变化似乎与最大气道狭窄的变化呈正相关。这些数据表明,普通感冒导致肺内气道的生理和细胞变化,即使在正常受试者中也是如此。
在非哮喘健康对照中,很少有关于RV感染的生理和炎症结果之间关系的比较数据。这对于评估病毒诱发哮喘加重的疾病特异性机制至关重要11.首先,在考虑正常受试者的生理变化时,最大气道狭窄增加的观察扩展了以往哮喘患者RV感染实验的发现6..其次,全身效应,如外周血淋巴细胞下降,确实发生在rv感染的正常受试者中,正如在哮喘患者中观察到的那样6.,7..然而,在肺内气道的组织病理学水平上,正常人的表现似乎与哮喘患者不同7.,12,因为没有观察到明显的气道浸润细胞增加。
所有的研究程序都是根据经过验证的方案进行的。我们仔细选择了12名受试者的样本量,特别是肺内细胞计数的分析。通过目前对11名受试者的分析,统计能力可以检测到粘膜嗜酸性粒细胞或PC的两倍变化20.,分别为0.77和0.858.,9.目的通过抗体滴度升高和/或病毒培养阳性证实RV16感染。在这项研究中,非特应性正常受试者的冷得分相对较低,特别是与Grünberg和同事的研究相比10,12,其中使用了相同的病毒批处理。显然,非特应性健康受试者的感冒症状比哮喘患者轻,尽管这仍然是一个有争议的问题13,14.
这些数据在正常受试者中如何解释?在这项研究中,生理和细胞研究结果表明RV感染对非哮喘受试者的肺内影响。最大气道狭窄的增加本质上是否可能反映小气道受累15.这可能与右心室抑制微血管渗漏导致气道壁肿胀有关16,或直接影响气道平滑肌17,18.有人认为是右心室感染了下气道的支气管上皮细胞19,20.可能通过病毒诱导的ICAM‐1上调而增强21.事实上,目前的研究结果证实了健康受试者在RV感染期间上皮细胞ICAM‐1表达的增加,与哮喘受试者的观察结果类似10. 受感染的上皮细胞和其他细胞释放各种介质22能吸引炎性细胞,如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞,从而增强肺内炎症。正常受试者的上皮或固有层中CD3+ T细胞增加,正如在哮喘中观察到的那样7.,12,未被发现。然而,最大反应的变化和T细胞数量的变化之间的相关性支持了生理变化可能的炎症起源。RV后的支气管嗜酸性浸润在哮喘中一直存在争议7.,12.正常受试者的嗜酸性粒细胞计数没有增加,这与当前作者最近在哮喘中的观察结果一致12.然而,正如Grünberg在哮喘患者中所证明的那样,病毒诱导正常受试者的嗜酸性粒细胞活性增加等23,不能排除哮喘患者RV感染后痰液ECP水平升高。
总之,鼻病毒感染导致全身和肺内影响,即使是非特应性、非哮喘受试者。然而,气道反应性和支气管活检的改变肯定是有限的。作者推测,正常人和哮喘患者对普通感冒反应的任何差异可能是由宿主因素解释的,如预先存在的过敏性炎症和/或气道高反应性24,从而可能促进感染、肺内炎症和既往疾病的临床恶化。
致谢
作者真诚地感谢所有参与这项研究的志愿者。他们还感谢荷兰莱顿大学医学中心肺科部门的J.J. Brahim, A. ten Brinke, J. Stolk和L.N.A. Willems在支气管镜检查中的出色表现,以及A.C.J.A. Tiré在这些支气管镜检查中提供的技术支持。作者还感谢莱顿大学医学中心病毒学系C.J.G. van Zeijl-van der Ham的技术支持。
- 收到了5月23日,2001年。
- 认可的2002年2月20日。
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