摘要
在花粉季节暴露于草花粉,敏感患者会出现变应性鼻炎、结膜炎和/或支气管哮喘的症状。目前尚不清楚的是,为什么在一些患者中只出现鼻炎症状,而在另一些患者中,类似的暴露会导致哮喘和鼻炎症状。
本文报道了一项相关研究,其中确定了人类白细胞抗原(HLA)-DR基因多态性对草花粉过敏患者症状差异表型表达的可能贡献。采用序列特异性引物聚合酶链反应法对82例季节性变应性鼻炎和/或支气管哮喘患者和52例健康非特应性对照者进行HLA-DR基因分型。
与单纯鼻炎患者相比,草花粉过敏患者HLA-DRB1*02、B5*单倍型与哮喘表型之间存在显著相关性。与无HLA-DRB1*01等位基因患者相比,HLA-DRB1*01等位基因患者血清总免疫球蛋白E水平显著升高。
本研究数据提示,人白细胞抗原- dr位点或连锁不平衡的其他基因可能在草花粉过敏患者哮喘表型表达和总免疫球蛋白E水平的测定中发挥重要作用。
本研究由国家科学研究委员会资助(No. 4P05B07909)。
近20%的欧洲人对草花粉过敏1.敏感患者暴露于草花粉后会出现鼻炎、结膜炎和/或支气管哮喘症状。目前尚不清楚的是,为什么在一些患者中只出现鼻炎症状,而在另一些患者中,类似的暴露会导致哮喘和鼻炎症状。对草花粉敏感的患者接触过敏原可能导致鼻炎症状,几年后又会出现哮喘症状(“过敏行军”)。然而,临床观察表明,一些鼻炎患者从未出现哮喘的症状2.在Settipane的研究中et al。3.在23年的观察期间,只有10.5%的鼻炎患者发展为哮喘。同样,丹尼尔森和詹森也是如此2在7年的随访中,只有6%的变应性鼻炎患者出现哮喘。因此,在大多数鼻炎患者中,特应性疾病表型在很长一段时间内保持稳定,可能是终生的。
变应性疾病的差异表现可能是遗传和环境因素共同作用的结果。例如毛et al。4证明特应性湿疹,而非哮喘或鼻炎,与肥大细胞糜酶基因多态性显著相关。哮喘的遗传模式表明它是一种复杂的遗传疾病。全基因组研究表明,哮喘表型与几个基因座密切相关5,6.Postmaet al。7将支气管高反应性(BHR)与染色体5q联系起来,并得出结论:调节IgE水平的基因可能与支气管高反应性有关。这些数据表明高血清IgE水平可能影响哮喘的发展。已有研究表明,高血清IgE水平和皮肤试验反应性与哮喘的发展有关8.据报道,染色体5q和11q13上的标记与总IgE浓度相关9,10.流行病学研究11,12研究表明,血清总IgE水平主要由遗传因素决定,年龄、性别、接触过敏原或烟草烟雾等因素对其水平的影响相对较小13.
在导致特应性疾病的遗传因素中,人类白细胞抗原(HLA)基因与触发过敏原特异性IgE反应有关。研究发现,HLA-DR等位基因与季节性特异性IgE反应的发展有关14和常年过敏原15还有一些药物16.Blumenthal的一项研究提出了HLA基因多态性的不同作用et al。17他发现花粉过敏中的哮喘表型可能与主要组织相容性复合体(MHC)扩展单倍型(HLA-B7/SC31/DR2)有关,单纯鼻炎患者(HLA-B8/SC01/DR3)单倍型的频率增加。同样的,莫et al。18显示扩展肿瘤坏死因子(TNF)‐α/HLA-DR单倍型与哮喘和BHR相关。但目前还不清楚HLA基因本身或其他相关基因是否对不同表现的疾病负有部分责任。
HLA-DR基因座可能通过影响特异性IgE反应在过敏性炎症的病理生理过程中发挥重要作用。在本研究中,我们评估了HLA-DR等位基因与器官特异性特应性疾病(即鼻炎或鼻炎和支气管哮喘)表达以及与季节性草花粉过敏患者血清总IgE水平的关系。
材料和方法
主题
82名生活在波兰中部地区的非亲属患者(女性46名,男性36名,平均年龄28.17岁,年龄17-61岁),表现为季节性鼻炎和/或哮喘的草花粉过敏患者被随机从作者科室门诊治疗的患者中选择。所有受试者在5月至8月至少连续3个季节有明确的季节性症状史。所有患者混合草花粉皮肤点刺试验呈阳性。根据个人病史和花粉季节的临床检查将患者分为两组。第一组包括在花粉季节有鼻漏、鼻塞和打喷嚏且下呼吸道无症状的患者(鼻炎组)。如果受试者在至少连续两个花粉季中有咳嗽、喘息、气短并伴有鼻炎症状,则将其分为哮喘和鼻炎(哮喘/鼻炎组)。42名仅患有鼻炎的患者和40名患有哮喘和鼻炎的患者被研究(表1)⇓).在这一年中,没有任何患者在其他时间出现哮喘和/或鼻炎症状。所有患者均未接受免疫治疗。
先用吸入变应原进行皮肤点刺试验,然后用特定草进行皮肤点刺试验。在特定牧草试验中使用了以下过敏原:白草、草地早熟禾、羊茅、鸭茅、黑麦草(Allergopharma, Reinbeck,德国)。阳性对照为组胺(10 mg·mL)−1),稀释剂作为阴性对照。皮肤点刺试验阳性的定义为平均伤口直径至少3mm或大于阴性对照,并伴有光斑反应。
所有患者对混合草花粉和所有特定草花粉的皮肤点刺试验均呈阳性。鼻炎组混合草花粉皮肤点刺试验的平均伤口直径为11.0±3.9 mm,与哮喘/鼻炎组(11.3±4.0 mm)差异无统计学意义。同样,在两组之间,将皮肤点刺试验的平均伤口直径与任何一种特定草进行比较,没有发现显著差异。其他过敏原皮肤点刺试验阳性的频率在两组间无显著差异,分别为:Dermatophagoides farinae-26.2%和30%;Dermatophagoides pteronyssinus28.6%和32.5%;链格孢属16.7%和10%;猫皮屑42.8%、37.5%;狗皮屑19%和20%;混合树种花粉占52.4%和47.5%;鼻炎组和哮喘/鼻炎组杂草花粉混合率分别为71.4%和62.5%。
非特应性对照组包括52名来自波兰中部地区的不相关受试者(种族类似于病例组),他们特应性疾病史阴性,父母或兄弟姐妹无过敏史,对一组吸入性过敏原的皮肤点刺试验阴性(表1)⇑).
支气管扩张剂反应
采用ABCPneumo 2000RS肺活量计(AbcMed, Kracow, Poland)对所有哮喘/鼻炎组患者和30例鼻炎组患者在花粉季节进行肺活量测定。在站立位置进行了至少三次测量,并记录了最好的结果。然后用计量吸入器给药200µg沙丁胺醇,15分钟后进行第二次肺活量测定。一秒内用力呼气量的变化(ΔFEV1)吸入药物前后按以下公式计算:
血清总免疫球蛋白E测定
所有受试者在花粉季节的总血清IgE水平均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法(赛诺菲巴斯德,巴黎,法国),根据制造商的方案进行测定。考虑到各组总IgE水平的非正态分布,将总IgE水平定义为一个定性特征,并在非特应组总IgE最高水平(195.1 IU·mL)以上设定一个临界点−1).所以总IgE水平> 200iu·mL的患者−1被认为是高IgE应答者。
人白细胞抗原dr B分型
根据原始方案,使用“Easy blood DNA Prep”(A&A,波兰格但斯克)从外周血中提取基因组脱氧核糖核酸(DNA)。如前所述,采用特异性序列引物技术(Dynal, Oslo, Norway)的聚合酶链反应(PCR)进行HLA-DR分子分型19.一个HLA-DRB分型包括24个PCR反应。每个PCR反应(10µL)由PCR缓冲液(DNA, Gdansk,波兰)、脱氧核糖核苷三磷酸(DNA) 200µM、5%甘油(Sigma, Poznan,波兰)、甲酚红(100µg·mL)组成−1)、0.5 U Taq聚合酶(DNA)、基因组DNA (200 ng)和特异性引物(1µM)。PCR扩增在GeneAmp 2400 (perkins - elmer,华沙,波兰)中进行,使用以下参数:2 min−94°C, 94°C 15 s和66°C 45 s的10个循环,94°C 10 s, 61°C 30 s和72°C 30 s的20个循环。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中用溴化乙锭染色并在紫外线照射下显示。
统计分析
将患者和对照组HLA-DRB等位基因的频率与双侧Fisher精确试验进行比较。A‐p值<0.05被认为是显著的。为了纠正偶然的显著性,将p‐值乘以被比较的等位基因的数量(p天哪).优势比(OR)以2×2表中95%置信区间(CI)内的交叉积计算。为了比较log总IgE水平,皮肤点刺试验和肺活量测定结果使用了Mann-Whitney试验和学生t测试。
结果
人白细胞抗原- drb等位基因与草花粉过敏的不同表型
HLA-DRB等位基因在哮喘/鼻炎症状患者、单纯鼻炎患者和非特应性对照组中的分布见表2⇓.
哮喘/鼻炎患者与鼻炎患者的比较仅显示哮喘患者DRB1*15 (p=0.006)和DRB1*16 (p=0.03)等位基因频率较高,但校正后差异不显著。然而,当两个等位基因(DRB1*15和B1*16;分析发现,DRB1*02等位基因的频率显著高于DRB1*02等位基因(OR=5.57, 95% CI= 2.14-14.53, p=0.0002, p天哪=0.003)。与单纯鼻炎患者相比,独立分型DR B5*基因和DRB1*02/B5*单倍型患者在哮喘/鼻炎组中同样出现更高的频率(OR=5.57, 95% CI= 2.14-14.53, p=0.0002, p天哪= 0.003)。亚组患者与非特应性组比较,哮喘/鼻炎患者DRB1*16 (p=0.03)、DRB1*02 (p=0.02)、DRB5* (p=0.02)等位基因频率较高,但校正后差异不显著。HLA-DR等位基因在单纯鼻炎患者与非特应性组之间以及草花粉过敏患者与非特应性组之间的分布均无显著差异。
人类白细胞抗原等位基因和特异性免疫球蛋白E反应
通过皮肤点刺试验(对混合和特异草花粉过敏原)测定的草花粉特异性IgE反应水平与患者HLA-DRB等位基因分布之间没有显著相关性。
人白细胞抗原等位基因与支气管扩张剂反应
意味着ΔFEV1哮喘/鼻炎组吸入沙丁胺醇后为10.9±5.2%,显著高于ΔFEV1鼻炎患者(3.5±3.23%,p<0.0001)。然而,在研究的70例患者中,气道可逆性与HLA-DRB等位基因分布之间没有显著关联。
人白细胞抗原等位基因和血清总免疫球蛋白- E
各组血清总IgE水平及其对数转化值(tIgE)在数量性状上均未呈现正态分布特征(数据偏向低IgE值)。单纯鼻炎患者和有哮喘/鼻炎症状的患者中位总IgE水平无显著差异。DRB*01等位基因患者tIgE水平显著升高(p=0.004)(中位数为394.9 IU·mL−1),与无此等位基因的患者相比(中位163.1 IU·mL−1),总IgE水平与HLA-DR等位基因在整个草花粉过敏患者组中的分布有关。然而,当分析非特应性对照组时,有或没有DRB*01等位基因的受试者之间的tIgE水平没有显著差异(图1)⇓).
由于各组总IgE水平不是正态分布,因此也将总IgE水平作为一个定性性状进行分析。总IgE水平>200 IU·mL的患者组−1(高IgE应答者)39例(女性18例,男性21例,平均年龄28.2岁,范围17-61岁)。20例(51.3%)有哮喘和鼻炎症状,19例(48.7%)仅有鼻炎症状。43例患者(女性26例,男性17例,平均年龄28.2岁,年龄19-54岁)纳入总IgE <200 IU·mL组−1定义为低IgE应答者。20例(46.5%)患者有哮喘/鼻炎症状,23例(53.5%)患者仅有鼻炎症状。两组HLA-DRB等位基因频率见表3⇓.高IgE应答组(tIgE >200 IU·mL) HLA-DRB1*01等位基因频率较高−1)与低IgE应答者相比(OR=6.15。95% CI= 1.98-19.1, p=0.0009, p天哪= 0.01)。在IgE水平为>200 IU·mL的患者中,DRB1*01等位基因的频率也显著较高−1(OR=4.16, 95% CI= 1.l64-10.54, p=0.002, p天哪= 0.026)。与低IgE应答组相比,高IgE患者出现DRB1*07的频率较低(OR=0.36, p=0.02),尽管经过校正后这一情况并不显著。当临界值为100 IU·mL时,HLA等位基因与高总IgE水平没有显著相关性−1(非特应性组平均总IgE+1 sd)。
讨论
特应性过敏的症状可能表现在不同的病人,不同的器官集合受到影响。在本研究中,季节性哮喘和鼻炎症状的草花粉敏感患者HLA-DRB1*02/DRB5*单倍型的发生率显著高于单纯鼻炎患者,而非非特应性组。哮喘患者HLA单倍型显著增加(47.5%),而鼻炎患者仅为14%,且与非特应性组相比缺乏这种关联,这可以解释为对照组中DRB1*02/DRB5*单倍型(29%)的高频率。在波兰中部的普通人群中观察到类似的单倍型频率(33%)20..众所周知,包括哮喘在内的特应性疾病是由基因数量决定的,因此,要找到相关的基因关联,需要足够大的人群或适当的对照组选择。本研究数据提示,草花粉过敏患者出现哮喘可能部分与HLA-DRB1*02/DRB5*单倍型或其他连锁不平衡的基因有关。在本研究中观察到的非特应性和整个草花粉过敏患者组中DRB1*02/DRB5*单倍型的相似频率表明,相关基因与特应性或草花粉过敏无关,但它们可以确定对特定刺激的更强烈的炎症反应,导致更广泛的免疫反应。据报道,与HLA位点连锁不平衡的强效促炎细胞因子TNF - α基因多态性可能影响细胞因子的生成和疾病的严重程度21.有趣的是,扩展的TNF- α单倍型(LTα NcoI*1/TNF-308*2/HLA-DRB1*02)与哮喘也有报道18这表明,定位于6号染色体(特别是扩展单倍型)的不同多态位点的组合影响了哮喘的表型。HLA-DR位点关联可能只是一种连锁不平衡现象。
将哮喘/鼻炎患者与单纯鼻炎患者进行年龄、性别、是否吸烟、总IgE水平及对草类和其他吸入过敏原的特异性IgE反应进行皮肤点刺试验比较,两组间无显著差异。除了不同的症状外,唯一的预期差异是吸入沙丁胺醇后支气管气道可逆性。与仅患有鼻炎的患者相比,哮喘患者对支气管扩张剂的反应明显更高(p<0,0001)。哮喘通常被定义为三个特征,即间歇性可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症。尽管这些成分都被认为是哮喘表型的重要组成部分,但最近的研究表明,支气管气道反应性以及气道可逆性和气道中的炎症过程可能是不同的22.在本研究中,哮喘患者是根据连续几个花粉季节的哮喘症状病史选择的。最近的数据表明,哮喘诊断的肺活量测量标准,包括对支气管扩张剂的反应,应重新评估作为临床试验纳入的参数23.在这个研究中与Blumenthal的研究相反et al。17气道可逆性不是选择标准。根据高应答者气道可逆性程度将哮喘患者分组(ΔFEV1>12%)和低反应者(ΔFEV1<12%)两组HLA-DR等位基因分布无显著差异(数据未显示)。在布鲁门撒尔的研究中et al。17,其中有15%的FEV反转1为选择标准,未观察到HLA-DR2单独与哮喘表型的显著相关性。这些数据表明,DRB1*02/DRB5*单倍型频率的增加与气道可逆性不直接相关,而是与哮喘表型的一些其他特征相关。
本研究中第二个最重要的发现是血清总IgE水平与HLA-DRB1*01等位基因密切相关。这些数据与Ulbrecht的研究一致et al。24他发现德国人群中总IgE水平高与HLA-DRB1*01相关。在他们的研究中,在选定特定的IgE阳性病例之前,相关性并不显著。在这项研究中观察到的更强的相关性可以解释这样一个事实:所有草花粉过敏患者都有针对草花粉的特异性IgE,这是通过皮肤点刺试验确定的。对HLA区域作用的进一步支持来自全基因组搜索,显示高总IgE水平与6号染色体标记的关联5.在那些基于疾病表型和对多年生变应原(HDM)的特异性IgE反应而不是总IgE水平来定义特应性状态的研究中,没有观察到HLA位点与特应性的关联25.因此,本研究的数据表明,高总IgE滴度可能与独立于过敏表型的特定HLA-DR位点有关,并可能与IgE调节机制的上调有关。同时,在英国人群中总IgE水平与DRB1*0701显著相关,在澳大利亚家庭中与DRB1*01显著相关,证实了HLA-DR位点与总IgE的相关性26,27.
HLA等位基因可能与参与总IgE调节的其他位点相关。例如,已经证明高总IgE水平的非常强的遗传决定因素位于11q染色体上9和5问28这进一步使总IgE反应的基因调控变得复杂。
综上所述,本研究表明,人白细胞抗原- drb1 *02/B5*单倍型与草花粉敏感患者的哮喘表型有很强的相关性。此外,无论草花粉过敏表型如何,DRB1*01等位基因均与高总免疫球蛋白E水平显著相关,表明人类白细胞抗原位点在特应性过敏病理生理学中的作用并不局限于特异性过敏反应。
- 收到了2001年7月10日。
- 接受2002年1月28日。
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