抽象
通过使用多重聚合酶链式反应和等位基因特异的标记的探针的组合,所述oligoligation试验被设计用于检测已知囊性纤维化跨膜调节突变。这项研究表明,该试验也可能是有用的发现新的基因突变。
一个家庭Bosnic的起源的第二个孩子表现出囊肿性纤维化的肠和肺部表现的所有症状。没有信号可以用于等位基因特异探针1898 + 1G>一种来获得。这可能由附近的局部序列的变化,阻止聚合酶链式反应的引物或寡核苷酸探针的结合与靶序列进行说明。事实上,序列分析表明一个新的1894G>科技交流(Glu587Stop)。双方的父母和弟弟的健康携带这种突变。因此,索引患者是纯合的1894G> T,将其从父母双方继承。
囊性纤维化(CF)是一种遗传性疾病,其特征在于,呼吸系统疾病和胰腺功能障碍1。CF从基因突变编码CF跨膜传导调节蛋白(CFTR)的结果。在CF的表型可以通过在CFTR基因> 900个不同突变造成的2。与外显子10(ΔF508)更常见的3个碱基对的缺失外,绝大多数的突变是罕见的或限制到特定的人群。为了使为较常见的已知突变可能的一种有效的筛选,该oligoligation试验(OLA)已于近日出台3。通过使用多重聚合酶链式反应(PCR)和连接到CFTR突变位点等位基因特异fluorescentlylabelled探针的组合,可以制备携带每个31个常见的突变的脱氧核糖核酸(DNA)片段。的CFTR基因型识别是通过尺寸分离和基因扫描一个ABI 377设备上实现仪(Applied Biosystems,福斯特城,CA,USA)。该OLA试验被设计用于检测的已知突变的特异性探针必须可用于其中。然而,这种分析表明,该法已在家庭Bosnic的起源的一个新的无义突变可能的检测。
案例报告
Bosnic的起源有两个孩子的家庭进行了研究。After normal delivery, the second child showed symptoms of dyspnoea, dilated bowel and intestinal obstruction at the age of 3 h. After meconium aspiration, connatal pneumonia was diagnosed. The child was treated with antibiotics and the intestinal obstruction was resolved with enemas. At the age of 4 months, he was readmitted to the hospital because of an atelectatic pneumonia. At that time, the diagnosis of CF was verified by a pathological sweat test and he was referred to a CF centre. The second and third sweat test were found to be pathological (sodium: 74 and 83 mmol·L-1)和胰腺功能不全的诊断依据。那孩子有CF的肠道和肺部表现的所有症状哥哥是健康的,并没有CF或儿童的家庭早期死亡的历史,但双方家庭的祖父母都出生于同一个村庄。
DNA样品从家族的所有成员从如先前所述制备的干燥的血液污渍得到五。它们按照常规通过来自Applied Biosystems的CF测定试剂盒的检测手段。
讨论
研究在南部欧洲人群中进行,包括前南斯拉夫,鉴定ΔF508,G542X,G551D,621 + 1G> T,W1282X和N1303K作为最常见的CF突变6。据笔者所知,没有数据公布关于Bosnic的人口。
为了屏幕CFTR突变,从索引病人得到的DNA样品通过该OLA测定进行分析。For 30 of the allelespecific probes the assay revealed no differences to the wildtype sequence (fig. 1⇓)。然而,可以为任一野生型或等位基因特异性探针的突变位点1898 + 1G>一种在内含子12可以得到无信号8。这可以通过,阻止PCR引物从结合到靶序列,从而抑制了DNA片段携带1898 + 1G> A基因型的扩增的序列变化来解释。可替换地,在用于寡核苷酸连接探针结合结构域的序列改变可以预防片段分析。然而,数据表明,该网站1898年+ 1G附近的序列偏差。为了检验这一假设,外显子12,包括exonintron界限,进行测序。Sequence analysis showed a G>T exchange at the base position 1894, which generated a termination signal at amino acid position 587 (Glu>Stop; fig. 2⇓)。
缺乏在位置1898G> A有外显子12的OLA信号因此可以对其它等位基因解释为以同时缺失外显子的区域相关联的杂合G> T交换/内含子12,或者,可替代地,可能已经由于纯合g>的在1894年父母双方以及索引患者的健康兄弟位置T交换因此被检查1894G> T的存在。All three individuals were found to be heterozygous carriers of the mutation 1894G>T (figs. 1 and 2⇑⇑)。因此,索引患者继承从父母双方的突变并被列为纯合的突变1894G> T(Glu587Stop)。
呈现的数据显示了oligoligation测定的,用于检测singlebase取代的灵敏度和效率。如果常规条件下的等位连接探针不能产生使用oligoligation测定特定片段和荧光信号,则因此直接的测试序列通过测序相应脱氧核糖核酸片段或外显子的变体。最后,进一步探索Bosnic的人口中的突变1894G> T的频率会很有意思。这可以通过使用oligoligation测定的被有效地实现。
- 收到2001年7月2日。
- 公认2001年7月31日。
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