文摘
(AHR)可能是由于气道高反应机制固有的气道壁,和/或由外因素引起的航空公司。的猪模型allergen-induced AHR是完整的航空公司利用调查的生理反应在体外和他们对响应的贡献在活的有机体内。
乙酰胆碱的反应(ACh)测定在八卵白蛋白(OA)敏化/挑战猪(测试)和八个saline-challenged控制。在活的有机体内响应从肺阻力(乙酰决心Rl)。在体外响应性,ACh决心从isovolumic支气管的气道压力段,暴露之后通过外膜或腔的表面。
增加测试猪肺(255±26%Rl,p < 0.0001)和皮肤反应OA,气道高反应性和乙酰胆碱(p < 0.0001)。在体外比控制、测试支气管不太敏感的ACh应用于气道动脉外膜(ACh的负对数浓度产生最大响应(pD的一半2)= 4.18和4.58,p < 0.01),但不是腔。测试支气管平滑肌规范化的数量增加了气道大小与控制(p < 0.05)。最大反应腔内课时在体外显示弱正相关与最大改变课时在活的有机体内(r = 0.599, p = 0.05)。
本研究得出结论:抗原对支气管反应性的影响随接触乙酰胆碱的路线。在体外反应腔内乙酰胆碱增加,尽管可能减少气管平滑肌的响应能力。支气管壁的反应只能部分解释了肺的响应能力在活的有机体内。
这项工作是支持的澳大利亚国家健康与医学研究委员会。
尽管中央气道狭窄的角色在肺挑衅刺激的反应,它的重要性在气道高反应性(AHR)尚未建立。由于平滑肌收缩气道直径的主要决定因素,一项提议是,AHR是由于气管平滑肌的收缩行为改变(ASM)。过敏动物模型研究表明,ASM收缩可能会增加1- - - - - -3,而平滑肌与哮喘患者的反应变量4,5。在活的有机体内,ASM以外的其他因素引起的气道,如负载从实质拘束6。一些研究表明,哮喘支气管有敏感性降低部队从实质拘束,可以支持更大的气道狭窄气道刺激6,7。
许多研究把重点放在了ASM隔绝后的反应,气道,通常气管8。相比之下,生理反应中描述完整的支气管气道隔绝哮喘病患者或动物模型是稀缺和支气管壁的贡献可能使气道高反应性,在活的有机体内仍然是有争议的。气道高反应性的猪模型给出了在这项研究中,由于其规模和唾手可得允许将不同大小支气管的功能性质研究9,10。早期allergen-induced反应以前报道的猪7,11。当前研究的初步目标,因此,确定敏感和反复过敏原暴露于猪随后导致了大战。进一步的目标是建立第一次生理反应是否完整支气管隔绝反应猪增加。这是假设,如果AHR在活的有机体内是由于生理或支气管壁形态变化,然后应该有增加肺支气管孤立的响应能力。在体外反应评估支气管部分,保留墙的结构组件在正常的几何关系。这使得平滑肌直接暴露于收缩的刺激,通过外膜的表面,或通过气道腔模拟在活的有机体内气溶胶的挑战。
材料和方法
敏化过程
16个白色/长白猪女猪(10公斤)进行了研究。八个实验动物被卵白蛋白致敏(OA)在0到7天如前所述7。四个控制动物是虚假的敏化(生理盐水和佐剂)在相应的日子里,虽然四天真的控制被安置为同一时间没有收到任何注射。
皮肤反应
敏化的成功决心在14至20使用50天µL皮内注射OA的10倍稀释(0.001 - 1毫克·毫升−1)。的最低浓度的OA积极回应(红色鞭痕> 5毫米直径)发生被记录下来,作为指数反应的过敏原12。
气溶胶的挑战
实验动物收到OA气溶胶(50 mg·毫升−1在14天盐水),17岁,20,而麻醉,气管插管,如前所述7。控制动物仅接受气溶胶的盐水。肺阻力(Rl)和动态遵从性(Cl使用一个既定协议)测量7。测量在基线和30分钟后挑战早期检测过敏原反应。
气道高反应性的评估在活的有机体内
气道反应性测定的量效曲线(crc)翻倍浓度的乙酰胆碱(空调采暖;σCastlehill、新南威尔士、澳大利亚)溶解在生理盐水。解决方案交付作为60年代气溶胶进入航空公司,作为过敏原交付的描述7。Rl和Cl每个浓度测量之前和之后。增加浓度的ACh管理直到Rl到达了一个高原。基线反应测定14天,第一个挑战之前,再一次20天,1小时后最后的挑战。反应到ACh最大的决心Rl在CRC记录。敏感性ACh决心从空调采暖所需的浓度增加Rl50%的基线和最大值之间的关系Rl获得的价值(PC50)。
气道高反应性的评估在体外
阀杆支气管肺低切割从左和右叶的安乐死猪后20天完成在活的有机体内测量。实质是移除,侧分支结扎和25 mm长的段是安装在一个器官浴,如前所述7,13。这些片段被归类为基于内部直径的小型/中型(2 - 3毫米),位置(跨代9-14)和软骨的存在14。段动脉外膜沐浴在克雷布斯的解决方案和内腔充满克雷布斯是一个单独的水库。龙头的两端部分允许气道腔密封,经管压力使用校准压力传感器可以监测10。在每个实验段检查压力泄漏。
电领域刺激支气管(EFS 60 v 20赫兹和3毫秒脉冲)使用铂环电极和草S44刺激器(美国马草工具,昆西)。EFS反应被用来评估最优的被动压力和拉伸段(5而言不啻2O和110%放松的长度,分别,图1所示⇓)和确认支气管部分恢复了先前的乙酰胆碱浓度。
当一个可重复的EFS反应得到,轻快的高频的碱浓度,1×10−4M,添加到浴,其次是冲刷,提供一个稳定的收缩的历史。累积crc课时(1×10−71×10−2米)然后通过增加乙酰胆碱浴沐浴的外膜的表面部分。复苏后,非累积的ACh CRC (1×10−71×10−1M)是通过添加ACh液体洗浴段腔10,13。支气管反应在体外被量化为最大压力所做出的反应乙酰胆碱(E马克斯)和乙酰胆碱浓度的负对数产生最大压力(pD的一半2)。
形态
支气管5而言不啻是固定在一个经管压力2O缓冲福尔马林溶液的10%。固定组织石蜡包埋、5µm部分被切割和苏木精和伊红染色。ASM区、内外壁区15和内腔周边(π)测定使用图像分析软件(,南澳大利亚州阿德莱德前沿企业有限公司)。测量平均每个支气管的从五个随机选择的部分。面积归一化16气道大小差异的√░░区域/π。intra-observer变异系数小于1.3%。
组织学
代表的部分低肺叶缓冲福尔马林固定在10%。固定组织石蜡包埋,切片(5µm)和苏木精和伊红染色。组织样本分配一个编号,病理学家检查。视觉评估总体架构的细支气管和肺泡组织,血管扰动程度(水肿、充血和出血)和存在的炎症细胞(中性粒细胞,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)。
统计分析
皮肤和肺对OA的反应或生理盐水,反应性和敏感ACh比较群体内部使用配对t和团体之间使用未配对t。在活的有机体内和在体外crc每组间比较使用非线性回归(野生)未配对t用于比较形态学参数。
相关性测定数据的控制,测试和nonresponder动物,使用最小二乘的方法。一个假定值< 0.05被认为是重要的。数据显示在±sem,除非另有说明
结果
皮肤反应
七个八个实验动物显示强大的皮肤反应皮内注射OA 14天、20天。积极响应发生在较低的浓度在20天(几何平均数0.019 mg·毫升−1,范围0.001 - -0.01 mg·毫升−1比天14·毫升(0.037毫克)−1,范围0.01 - -0.1 mg·毫升−1,p < 0.02)。剩下的测试动物有一个弱响应在这两天(1毫克·毫升−1)。控制动物皮内注射OA没有反应。
在活的有机体内反应
天真和sham-sensitized控制动物肺功能没有差异或响应ACh(表1所示⇓)。数据组合成一组(n = 8)与测试的动物。
基线Rl和Cl测试和控制任何没有差异研究第七天的八个测试猪表现出强劲的增长Rl(255±26%,p < 0.0001),相应的减少Cl(90±3%,p < 0.0001),以应对OA气溶胶在20天(图2所示⇓)。控制动物没有盐气溶胶变化(Rl增加11±4%,Cl减少1±6%)。峰值响应发生在所有的动物的5分钟内完成气溶胶。
基线Rlpreallergen没有差异/盐水暴露和开始的CRC ACh 1小时后(测试:18.1±1.8而言不啻吗2O·L−1·s和17.8±1.5;控制:分别为18.7±1.4,18.3±1.7)。试验猪显示显著左移CRC ACh 20天(p < 0.0001),而与基线值14天(图3所示⇓)。相比之下,控制动物没有改变天14至20(图3所示⇓)。
敏感性ACh翻了一番测试动物从14到20天,但在控制显示没有变化。如图3所示⇑,乙酰胆碱的浓度导致基线和最大之间增加了50%Rl(电脑50)减少测试猪从基线9.9±1.5 mg·毫升−114天20天5.1±0.9,p = 0.01,而控制显示没有变化(8.3±0.6 mg·毫升−1和8.4±1.1)。个人电脑50明显不同的两组之间在20天(p < 0.05),而不是14天。
的意思是最大Rl从第14天增加到20(289±36%和387±68%,p < 0.05)在试验动物,但没有变化控制在14天(295±49%到332±60% 20天)。
响应性控制和测试支气管在体外
每头猪了在体外crc外膜应用ACh;然而,只有每组5动物产生最大crc食管腔ACh由于疲劳或泄漏的发展。数据从右和左支气管平均,没有响应(pD的差异2和E马克斯内在被发现(表2)⇓)。
腔内ACh CRC的统计分析显示一个小,但重要的区别测试和对照组(p < 0.03,图5所示⇓);然而,无论是pD2也不E马克斯组(pD之间的不同2:控制测试2.84±0.13和3.05±0.17;E马克斯:控制60.1±4.1而言不啻261.1±4.9而言不啻O和测试2O)。与腔内数据,测试显示支气管收缩效能的显著损失2.5倍外膜ACh相比控制(p < 0.0001,图5所示⇓)。pD2显著降低(控制测试4.18±0.07,4.58±0.10,p < 0.01),尽管吗E马克斯没有不同的两组之间(控制82.1±3.4而言不啻2啊,测试75.6±7.5而言不啻2啊,图5所示⇓)。
形态测量学
ASM面积增加测试猪(0.064±0.004毫米,p < 0.05)相比,控制(0.054±0.001)(表3所示⇓)。没有内在的差异,外或两组之间的墙总面积(表3⇓)。上皮细胞> 85%完整的控制和测试支气管,和正常的外观。
响应性在活的有机体内与在体外
响应性孤立的支气管腔内空调采暖与片段在活的有机体内响应气溶胶ACh控制、测试和nonresponder猪。反应,呵在活的有机体内(R马克斯)与反应性弱的正相关关系在体外(E马克斯)(r = 0.599, p = 0.05)。然而,灵敏度(日志PC之间没有相关性50)值在体外和在活的有机体内(r = 0.441, p = 0.175)。外膜反应ACh也与之相比在活的有机体内响应。在反应性(不存在相关性R马克斯与E马克斯,r = 0.079, p = 0.77)或敏感性(登录电脑50,r = 0.381, p = 0.146)。
组织学
淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞明显在试验猪的实质。周围有频繁,轻微的粒细胞成套小细支气管和间隙区域内多孔性的增加。控制动物偶尔显示领域的多孔性增加,主要是由于肺不张的实质。大的航空公司在外观是正常的测试和控制猪。没有观察到的差异的总体架构组织或血管的程度两组之间的干扰。
讨论
这项研究是第一个报告功能性质整个支气管的气道高反应性的模型。模型包含了哮喘的主要特征,即气道狭窄,和气道高反应性炎症。这个模型的一个独特的特性是动物的大小和可用性使得中小尺寸支气管的气道生理研究在体外后气道高反应性的示范在活的有机体内。这使得呼吸道的生理属性之间的可比性的墙在体外和肺的响应能力。此外,支气管部分评估气道功能的使用在体外ASM允许响应分别确定(通过外膜的应用ACh)和气道壁(通过腔)。从目前的研究结果表明,反复过敏原致敏猪的挑战产生复杂的变化影响支气管壁的几个组件。证据表明,ASM不如控制,响应过敏原暴露的支气管气道高反应性说明在活的有机体内可能与其他因素有关,调节ASM收缩,气道结构或外部负载的实质。
从敏化猪增加了ASM支气管,这与如哮喘患者气道重构的一致16。然而,当评估在体外从敏化猪支气管响应外膜ACh比控制。响应能力可能受到炎症刺激和平滑肌细胞的存在与不同的收缩或分泌表型17。在一些动物模型,增加气管平滑肌收缩1- - - - - -3。在支气管有更少的研究,但是人类的一项研究显示支气管平滑肌减少力量事后剖析5。减少支气管的反应在目前的研究表明,外膜ACh ASM力和灵敏度降低,尽管更多的ASM的存在。目前,作者没有收缩在更外围航空信息,这可能显示不同级别的响应能力。与外膜的路线,向右有一个适度的敏化支气管腔内CRC的转变,认为是更多的生理的路线。小腔内灵敏度增加表明存在某种机制(s)气道壁内采取行动增加ASM的激活。特别重要的是粘膜上皮,如果损坏导致主要增加腔内反应由于增加药物渗透到底层平滑肌13。虽然没有改变总值在测试支气管上皮细胞形态学观察研究,更微妙的上皮通透性的变化可能是礼物。
早期的流行使用这个猪呼吸道吸入过敏原反应模型是87%,这与其他过敏动物模型为多18。一个敏感猪未能回应OA气溶胶和显示一个贫穷的相比其他七个测试动物皮肤的反应。这是典型的生物变异物种不是高度近亲繁殖,因此一些研究小组使用的筛查,如皮肤反应,预选的动物研究11,18- - - - - -20.。antigen-sensitized动物发明了一种典型的鞭痕和耀斑响应,表明生产抗原免疫球蛋白e的IgE抗体12;然而,无论是天真还是sham-sensitized控制猪对皮肤的抗原。一个更敏感的敏感指数将是有利的。到目前为止,不可能直接测量猪IgE浓度,因为没有商业化antiporcine IgE单克隆抗体。然而,重大进展最近用的隔离猪IgEε链21。
所有控制动物暴露在气溶胶的盐水,盐水稀释剂而不是OA,重复OA气溶胶暴露可能足以使动物没有一个初始的抗原注入22。Sham-sensitized猪表现出天真的猪一样的反应(表1所示⇑)。第三组OA-sensitized和saline-challenged猪先前评估在目前作者的实验室与类似的结果(未发表的数据)。
多种过敏原暴露被用于几种动物模型23- - - - - -25诱导的一些功能和struclural变化出现哮喘。在这项研究中,三个气溶胶暴露OA导致轻度炎症在实验动物尤其是小航空公司。ASM地区也有增加,但没有其他变化的总体架构组织或血管的程度从控制扰动杰出的实验动物。
本研究的目的是确定肺部的响应性的差异在活的有机体内可能是由孤立的气道壁的属性。数据控制、测试和nonresponder猪相结合提供了一个广泛的响应。目前研究表明之间的关系最大反应腔内的挑战在活的有机体内和在体外。之前的研究使用环或条平滑肌8未能显示这样一个协会,可能是因为解剖过程可能妥协上皮和其他结构特点,有助于响应在活的有机体内。最近,正树et al。26显示之间的正相关效应lumenally-applied ACh气管狭窄在体外吹气压力在活的有机体内OA-sensitized群豚鼠。相比之下,一项由Woisinet al。27没有发现之间的相关性在活的有机体内和在体外响应性控制和敏化兔子;然而,敏感群体未能相比表现出高反应性控制。本研究扩展了这些发现,因为它包含一个群正常猪与致敏动物表现出明确的大战。
目前的结果表明,反应性在活的有机体内可能与个人的支气管反应性,确定吗在体外。没有这样的敏感性之间的关系在活的有机体内和在体外。这些发现符合灵敏度时引起的多个机制。外在气道机制,以及当地气道改变,可能导致反应所显示6。目前作者以前显示支气管从测试猪不如控制兼容的7,这是符合结构改造。在目前的研究中,实验动物显示气道壁改造的形式增加气道平滑肌。这可能导致更加激烈的航空公司,这可能不太容易相互依存在肺部的力量。任何减少后载荷对气管平滑肌收缩,因相互依存的力量,可能有利于气道狭窄在活的有机体内,但不会明显个人气道在体外。后来的研究可能会发现使用这个模型,在细胞水平上,机制产生支气管气道功能的改变。
- 收到了2001年3月20日。
- 接受2001年7月30日。
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