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本研究介绍了结合自身免疫刺激(TLR-7/8受体激动剂)和内皮损伤(Sugen),建立了一个新颖的老鼠模型代表immune-vascular病理事件模仿人类多环芳烃与自身免疫性疾病相关https://bit.ly/3P3H5V0
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越来越多的证据支持免疫失调和自身免疫引起的争用和有助于描述肺动脉高血压的病理改造(PAH) [1,2]。多环芳烃是一种常见的结缔组织病(ctd)的并发症,尤其是系统性硬化症(SSc)和系统性红斑狼疮(SLE) [3]。此外,特发性肺动脉高压(IPAH)患者表现出免疫细胞浸润的改建船只,转变Th17 / Treg轴和循环细胞因子水平升高和自身抗体(2]。我们探索了全身的toll样受体7和8 (TLR7/8)自身免疫在保持血管内皮生长因子受体拮抗剂Sugen全身的5416 (SU5416)肺血管内皮损伤和功能障碍在起始和大鼠肺血管疾病的进一步发展(R-SU)。
TLR7/8免疫哨兵,选择性地识别子集的RNA序列抗病毒反应的关键。人类TLR7表达血浆树突细胞(髓)和B细胞,并产生I型干扰素(IFN)信号激活后,在TLR8髓细胞诱发核factor-κB-dependent细胞因子(4]。持久TLR7/8激活产生过度炎性信号往往是病态;例如,增强TLR7信号触发致命的病毒性肺炎患者细胞因子风暴(5]。异常TLR7-mediated干扰素生产pDCs促进autoreactive B细胞扩张和repolarises辅助T细胞,一直被认为是一种自身免疫签名(6]。局部应用TLR7/8兴奋剂resiquimod (R848)诱发SLE-like小鼠自身免疫性疾病,导致的细胞因子水平升高,产生自身抗体和多器官损伤;值得注意的是,这些R848-induced自身免疫反应在TLR7-deficient消除老鼠,这表明啮齿动物TLR8少或非功能性(7]。SU5416人们充分诱导内皮细胞凋亡,短暂而定义致病事件背后肺血管重塑的发展(8]。SU5416一直与其他侮辱结合使用,如慢性缺氧,肺切除术,低氧factor-1α刺激,作用于血管的压力源和T细胞耗竭,生成实验肺动脉高压(PH)在活的有机体内(8]。
在这项研究中,男性Sprague-Dawley老鼠(180 - 200 g)都被赋予了一项单一的皮下注射SU5416 (20 mg·公斤−1),其次是局部应用TLR7/8兴奋剂R848 (R-SU)耳朵·1.67毫克公斤−1三次每周5周(5 w)没有暴露于低氧(图1一个)。在初始阶段,局部R848引起红斑的皮肤变化对老鼠的耳朵。组织学R-SU老鼠耳朵的5 w显示表皮细胞增生和焦CD103-positive积累epidermal-dermal结(图1一个)。5 w R-SU老鼠表现出严重的表型PH值,包括平均肺动脉压(PAP)显著升高(图1 b)和右心室(RV)肥大(图1 c)。组织学检查发现闭塞的5 w R-SU鼠肺血管重塑(图1 d)。另外一个组大鼠(7 w R-SU)成立的纵向随访心脏磁共振成像(MRI)使用9.4 T BioSpec扫描仪2 -和5周时间点,和一个扩展的七周的计算(进一步维持2周没有R848应用程序)。值得注意的是,7 w R-SU老鼠保持升高行动党和肺血管重塑在相似水平的5 w R-SU集团(图1 b和d),建议5 w - 7 w是一种理想的窗口测试药理干预。我们没有观察到显著变化的系统性压力5 w或7 w R-SU组。核磁共振成像数据分析证实逐步下降房车性能随着PH值进展(图1 e)就是明证进步房车肥大和房车扩张,以及失去ventriculo-arterial耦合和房车功能恶化,如。拒绝房车射血分数(图1 e)。
R848-SU5416 (R-SU)大鼠肺动脉高压模型。局部的)建立R-SU组合R848应用(1.67 mg·公斤−1三次每周5周)的老鼠的耳朵和单一的皮下注射SU5416 (20 mg·公斤−1)。免疫组织化学分析显示出焦CD103积累+细胞在耳朵的epidermal-dermal结R848应用(箭头);mRNA的表达干扰素(IFN) A1, IFNB1, toll样受体7 (TLR7)和TLR8增加脾(n = 6),这表明血浆树突细胞(髓)的参与应对TLR7/8激活。TLR7-driven自身免疫的延续SU5416-induced有害刺激肺血管,最终导致闭塞的血管重塑。b)平均肺动脉压(肺动脉平均);c)右心室(RV)肥大富尔顿的指数计算的重量比房车左心室(LV) +隔;d)百分比R-SU肌肺血管的老鼠。Ctrl:健康的控制;R848: R848单独处理;苏:SU5416单独处理;5 w: 5周R848 + SU5416治疗大鼠; 7W: 7-week R848+SU5416 treated rats. n=6. e) RV ejection fraction (RVEF) from different time points (2-week (2W), 5-week (5W), 7-week (7W)) of the same R-SU, measured by cardiac magnetic resonance imaging. n=6. f) Histological examination demonstrates infiltration of inflammatory cells and vascular remodeling in R-SU rat lungs. Haematoxylin and eosin (H&E) staining shows prominent bronchus-associated lymphoid tissues (arrows) around pulmonary vessels; CD68 staining macrophages; CD117 and Toluidine blue (TB) staining mast cells; Elastic Van Gieson (EVG) staining shows occlusive vascular lesions; von Willebrand factor (vWF) staining endothelial cells; smooth muscle actin (SMA) staining smooth muscle cells; Ki67 staining proliferating cells; double immunofluorescence staining with CD31/Ki67, CD31/SMA and SMA/Ki67; Masson's Trichrome (MT) staining connective tissues. g) Protein expression in R-SU rat lungs assessed by Western blotting. The data were generated from optical density measurements of individual bands normalised to GAPDH (pSTAT3 to total STAT3; active MMP2/9 to pro MMP2/9) and presented as fold change relative to control group. n=6. h) Proteom cytokine profiles in R-SU rat serum using R&D systems Panel A. Serum of six individual rats per group equally contributed to the pooled samples to incubate the profiler membranes. The experiment was duplicated with separate sample preparations. The data were generated from optical density measurements of individual dots and normalised to reference spots on each membrane, and presented as fold change relative to control group. i) Enlarged spleen from R-SU rats compared with controls, the quantification was accessed by the weight ratio of spleen over body weight; Ctrl: 2.04±0.22×10−3与R-SU: 8.50±1.31×10−3(p < 0.001)。高碘酸希夫(PAS)染色从R-SU老鼠肾脏部分揭示肾小球肾炎。j) Fluorescence-activated细胞排序R-SU大鼠外周单核细胞分析显示增加CD3的频率−CD4+CD11b / c低MHC II级+细胞,激活pDCs, Th17比率增加(由CD3定义的+CD4+IL17A+)Treg细胞(CD3所定义的+CD4+CD25+Foxp3+)。n = 6。k)等离子体的自身抗体水平:核抗体(ANA), anti-double链DNA抗体(anti-dsDNA)和anti-endothelial细胞抗体(AECA) R-SU老鼠通过ELISA检测。Ctrl:健康的控制;5 w: 5周R-SU老鼠;7 w:七周R-SU老鼠。n = 6。所有值都呈现意味着±扫描电镜。差异是由单向方差分析评估(多个组)或未配对t检验(两组)。*:p < 0.05;* *:p < 0.01;* * *:p < 0.001。引物用于存在:IFNA1 (F-CAGCAGATCCAGAAGDCTCAARC; R-CAGGCACAGGGRCTGTGTTT) IFNB1 (F-TGCTGTGCTTCTCCACCACT; R-TAGTCTCATTCCACCCAGTGCT) TLR7 (F-TTTCCCAGAGCATACAGCTCAG; R - CACTCAAGGACAGAACTGCTGC), TLR8 (F: CCAGAGTCTTCCAAACTTGGCAAC; R-CAAGGCCTTGCCATAAGCAGTACA)。
R-SU鼠肺组织学检查显示广泛的血管周的免疫细胞招聘/渗透在肺部。无论是R848还是SU5416就足以引起PH值明显病理变化。R848和SU5416“双重打击”R-SU老鼠表现出明显的炎性细胞浸润在闭塞的血管病变在肺,以及扩大此外淋巴组织(波罗的海国家)(图1 f)。先前的研究从人类IPAH和PH值由缺氧和野百合碱诱导的动物模型表明,波罗的海国家是一个病态的自身抗体的来源,如。anti-endothelial细胞抗体(AECAs),导致内皮细胞凋亡(9]。在R-SU鼠肺,免疫组织化学(图1 f)显示肥大细胞的积累(CD117和甲苯胺蓝染色)和CD68+巨噬细胞围绕血管改建,更高的Ki67积极增生血管包括内皮细胞(血管性血友病因子(vWF)和平滑肌细胞(平滑肌肌动蛋白(SMA),分别。此外,有过多的纤维结缔组织的形成沉积(马森的三色的蓝色染色;图1 f)在肺部,表明在R-SU大鼠肺组织损伤和炎症。这类似于独特的病理观察到严重的人类PAH,在免疫细胞浸润co-reside同心血管内膜增生的血管细胞病变。一致,R-SU老鼠PH-related内皮功能障碍的典型特征,包括骨形态形成蛋白受体2型(BMPR2)不足,高信号传感器和转录激活3 (STAT3)磷酸化和phospho-vimentin (endothelial-to-mesenchymal过渡(EndoMT))10]在肺部(图1 g)。此外,抗凋亡标记,如生存素和bcl - 2高表达在R-SU鼠肺一起升高GLUT1表达式反映糖酵解与前导表型变化(图1 g)。有趣的是,R-SU老鼠表现出突出的细胞因子/趋化因子包括咆哮(激活规范,正常T细胞表达和分泌)、白介素(IL) -10年,可溶性细胞间粘附分子(描述)和巨噬细胞炎性protein-1A。咆哮的表情表明下游信号的完整性,以应对干扰素生产(图1 h)。符合矩阵增加蛋白质(MMP2、MMP9 / TIMP1表达R-SU鼠肺,咆哮海拔显示持续的趋化反应和不断改造的肺细胞外基质,促进免疫细胞外渗,迁移和渗透。
R-SU老鼠发达lupus-like系统性自身免疫反应与多个器官,还如脾肿大(> 4叠化脾与体重的比例)和肾小球肾炎(图1我)[7]。I型干扰素(IFNA1 / IFNAB1)和TLR7/8表达在R-SU鼠脾细胞高度增加,证明R848的反应。重要的是,R-SU老鼠表现出循环CD3细胞频率增加−CD4+CD11b / c低MHC II级+子集,同系物人类髓(11),以及增加Th17 (CD3+CD4+IL17A+)/ Treg (CD3+CD4+CD25+Foxp3+)比在外周血细胞(图1 j)。Repolarisation tlr 7激活和减少对Th17细胞调节性T细胞亚群)意味着失去自我耐受性和增加自身免疫,这被描述与疾病严重程度及预后相关性在人类各种形式的多环芳烃以及自身免疫性疾病(12,13]。此外,等离子体的自身抗体水平明显增加R-SU老鼠,包括AECAs、抗核抗体和anti-dsDNA (图1 k)。自身抗体的生产也是一种常见的多环芳烃immunopathy和自身免疫性疾病。值得注意的是,TLR7受体激动剂会导致致命的狼疮自身免疫涉及系统性高血压和血管炎症在雌性老鼠14];我们怀疑女性倾向TLR7-driven自身免疫反应在较高可能归因于gene-dose x染色体biallelic表达的影响(15]。出于这个原因,成年雄性老鼠为本研究选择和无显著变化在体循环中指出R-SU老鼠。
这项研究强调了复杂immune-vascular互动参与肺血管疾病与自身免疫相关/传染性疾病。与现有的PH值实验模型相比,如Sugen-hypoxia老鼠,老鼠R-SU显示突出的炎症细胞聚集在血管周的地区改建船只在肺部。R-SU老鼠清单immune-vascular病理事件代表人类的多环芳烃和其它相关肺部疾病(如。肺纤维化,病毒性肺炎COVID-19),并作为小说和肺血管研究领域的重要实验工具。
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脚注
作者的贡献:局域网赵,fc。Yeh和碳氮。陈开发概念和写的手稿。fc。赵叶、陈碳氮和局域网设计/实现实验和解释数据。fc。叶进行统计分析。bxcy。谢协助蛋白质分析和细胞因子测定。n Baxan林和赵心脏磁共振扫描和分析。 A. Ashek assisted in co-immunofluorescence. F. Sabrin performed Masson's trichrome staining and quantification. A. Lawrie and M. Wilkins provided advice on the final manuscript.
利益冲突:作者没有潜在的利益冲突披露。
支持声明:这项工作是由英国心脏基金会项目授予PG / 18/2/33446和陆海空三军种总医院台湾政府博士奖学金(2015 - 2019 fc。叶)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2023年2月3日。
- 接受2023年5月30日。
- 版权©2023年作者。
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