文摘
背景囊性纤维化(CF),它是由突变引起的CF跨膜电导调节器(雌性生殖道的特点是慢性细菌性肺部感染和炎症。在CF,单核细胞和monocyte-derived显示巨噬细胞已被证明有缺陷的吞噬作用和抗菌活性有关肺的病原体,包括铜绿假单胞菌。因此,我们解决的影响雌性生殖道三调制器疗法(elexacaftor / tezacaftor / ivacaftor (ETI))在CF单核细胞的活动铜绿假单胞菌。
方法从CF患者单核细胞(PWCF) 1和6个月的ETI治疗前后血中分离的感染铜绿假单胞菌评估吞噬活性和细胞内的细菌杀死。氧化破裂和白细胞介素- 6分泌也确定。单核细胞从健康对照组也包括在内。
结果纵向分析的临床参数确认改善肺功能和肺部微生物指数。CF单核细胞的吞噬和杀菌剂的缺乏也明显改善,尽管不完全。此外,我们测量一个旺盛的氧化破裂在CF单核细胞疗法,大大减少了外星人。这导致了一个进步的活性氧生物杀菌活性。对细菌刺激炎症反应也较治疗前降低。
结论PWCF ETI疗法,在真实的环境中,除了临床恢复显示,单核细胞显著改善活动铜绿假单胞菌,这可能导致了整体指数对肺部疾病的影响。这也表明CF单核细胞障碍可能是专门针对在CF改善肺功能。
文摘
在患有囊性纤维化,elexacaftor / tezacaftor ivacaftor改善单核细胞对抗的抗菌活性铜绿假单胞菌通过降低它们旺盛的氧化破裂,从而导致肺部疾病的改善http://bit.ly/3hL2Z11
介绍
囊性纤维化(CF)是一种上来说是遗传疾病引起的突变CF跨膜电导调节器(雌性生殖道)基因,CFTR F508del检测突变是最常见的。在肺癌、离子运输功能失调的雌性生殖道产生了不平衡在气道上皮细胞,进而有利于慢性细菌感染与肺功能的下降(1]。广泛的CFTR野生型和突变检测蛋白质的结构和功能研究导致小分子的识别,通过互动CFTR突变检测,恢复它的活动。雌性生殖道调节器组成校正,如elexacaftor lumacaftor tezacaftor,旨在改善错误折叠和CFTR mistracked检测电位器,目标控制缺陷的突变特征的孔隙通道(2- - - - - -4]。电位器,ivacaftor是雌性生殖道调制器中第一个被批准临床使用,2013年,在主题与浇注突变(5,6]。随后,基于调节器的可能的协同活动,不仅在CFTR F508del检测,而且在其他突变蛋白质,这些药物结合使用(7- - - - - -9在纯合子和杂合的CF患者(PWCF)和至少一个F508del突变。
随机对照试验的疗效相比,雌性生殖道调节器与二类PWCF突变,包括F508del雌性生殖道等位基因,最近被评估10]揭示改善生活质量(QoL)和肺功能的三联疗法(elexacaftor / tezacaftor / ivacaftor (ETI)),小改进的双重疗法(一个校正器和一个电位器),而没有观察单一疗法相关的对肺功能的影响(10]。基于ETI的令人鼓舞的结果,2019年10月,美国食品和药物管理局批准这种联合治疗PWCF≥12岁,至少有一个F508del,紧随其后的是2020年8月欧洲药品局。此后,若是遇到使用显著增加,迅速扩展到几乎所有的合格PWCF预计[11- - - - - -13]。因此有必要研究指数的影响扩展到其他细胞区,除了航空公司的上皮细胞,已经被广泛地研究过了。
单核细胞和巨噬细胞monocyte-derived发挥关键作用在维持肺不育和调节炎症反应。在CF,这些免疫细胞已被证明显示肺相关的有缺陷的吞噬作用和抗菌活性对病原体,包括金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌和伯克cenocepacia(14- - - - - -19]。在体外和体外研究显示一些提高CF巨噬细胞功能治疗后mono (ivacaftor)或双CFTR (ivacaftor / lumacaftor)检测调节器(20.,21)以及快速调制相关的基因的转录活动炎症和免疫反应在外周血细胞(22,23]。然而,很少有人了解三联疗法的效果,这是最有效的从临床的角度来看,在吞噬细胞的功能。最近,复苏的雌性生殖道ATP / P2X7受体的表达和校正(P2X7R)信号,间接减少inflammasome激活和循环促炎症标记,是显示在单核细胞分离PWCF ETI疗法(下24]。
在这里,我们调查的影响指数疗法对单核细胞吞噬细菌的能力,当主管杀死他们。此外,我们分析了指数的贡献程度的精细平衡氧化破裂,最近被证明是人类巨噬细胞的主要杀菌剂的机制(25]。
方法
外周血单核细胞(PBMC)感染铜绿假单胞菌、吞噬作用,造成活动和活性氧(ROS)根据C进行了测量avinato等。(26]。西方墨点法和白介素6 (IL)量化进行了如前所报道(27,28]。详细描述中提供的材料和方法补充材料。
研究对象
PWCF (n = 41)检查在这项研究中参加了囊性纤维化区域中心,地区拉齐奥(意大利罗马)。这项研究的时候,Trikafta(美国顶点药品,波士顿,MA)还没有商业化。因此,PWCF获准进入同情使用基于临床的Trikafta条件。研究完全在PWCF的常规护理,包括收集血液样本获得常规评估。通知书面同意之前从所有的参与者获得Trikafta的开始。所有的方法都是按照指导方针和有关规定进行。淡黄色的外套,不用于其他用途,用于分离细胞健康的捐赠者。
统计数据
所有统计测试结果讨论与棱镜与生物统计和分析软件(美国GraphPad拉霍亚,CA)。进行测试的正常分布数据,然后选择参数或非参数测试。细节发表在图的传说。差异显著的假定值截止0.05。
结果
ETI疗法迅速提高PWCF的临床特点
若是遇到的临床疗效在现实生活中是评估在纯合子(F508del / F508del)和杂合的(F508del /其他)白人PWCF (表1),后者与第二个最小的变异函数,定义在Zemanicket al。(13]。在基线,没有差异百分比预计在1 s (FEV用力呼气量1% pred),汗水氯浓度(SSC),身体质量指数(BMI)和观察两组之间的生命质量(表1)。在1 (M1)和6 (M6)个月从一开始治疗,FEV1% pred显著增加,而SSC下降(图1)。特别是,FEV的平均增长1在该+ 8.43±6.65% % pred M1在M6进一步+ 4.77±3.32%,在杂合子在M1 + 11.81±11.61% + 4.89±6.84% M6。中可观察到类似的趋势SSC减少与更强的平均效应M1(−46.29±26.37, 44.37±25.25−更易·L−1分别在该和杂合体)相比,M6(−7.21±11.87, 3.81±10.81−更易·L−1)。这些结果,类似于以前的临床试验研究[29日,30.和最近的研究在现实环境下11- - - - - -13),突出CFTR快速改善肺功能和检测通道活动ETI治疗后。重要的是,这种改进是维持缓慢增加后续5个月。同意FEV1% pred和SSC数据,BMI和生命质量提高的学习小组(补充图S1)。没有观察到显著差异在这些测量纯合子和杂合的PWCF之间。共同的临床数据表明,所有受试者纳入本研究ETI积极回应。
肺部微生物显示铜绿假单胞菌37感染前41 (90.2%)PWCF疗法(表1)。ETI后,五个PWCF(四个在M1和一个在M6)检测结果为阴性铜绿假单胞菌,导致整体减少铜绿假单胞菌感染的13.5%。Multispecies感染,虽然非常有限,也积极影响指数。特别是,b . cenocepacia没有检测到两个PWCF铜绿假单胞菌+b . cenocepacia当一个病人铜绿假单胞菌+ S。葡萄球菌结果为阴性铜绿假单胞菌(表1)。集体,若是遇到看来,改善肺功能,还有助于减少肺部感染。
ETI迅速提高吞噬作用和杀害的活动铜绿假单胞菌CF的单核细胞
确定指数对CF单核细胞的活性的影响,铜绿假单胞菌吞噬作用和杀戮之前和之后的治疗进行评估。吞噬作用是评估通过确定细胞内的细菌的数量从PBMCs感染中恢复过来铜绿假单胞菌。PBMCs新鲜隔绝PAO1应变的血液样本被感染铜绿假单胞菌表达绿色荧光蛋白(PAO1-GFP),删除后non-phagocytosed细菌的抗生素治疗,吞噬细菌被枚举(CFU)。PBMCs隔绝巴菲大衣健康的捐赠者是作为控制。在报道图2一个基线,CFU恢复CF细胞明显低于恢复健康的捐赠者,但CFU从指数显著增加样本中恢复过来。特别是,细胞内的平均增加细菌与基线相比在M6在M1 2倍和2.5倍(图2一个)。的吸收铜绿假单胞菌PWCF进一步评估的单核细胞在感染后流式细胞术PBMCs PAO1-GFP和鉴定单核细胞的向前端散射(补充图S2和图2 b)。若是遇到之前,GFP的平均百分比+单核细胞低1.66倍PWCF比健康的捐赠者(图2 c)。ETI治疗1个月后(M1), GFP+单核细胞显著增加,而没有观察到显著差异M6与M1 (图2 c)。特别是对治疗之前,增加吞噬作用铜绿假单胞菌中检测出10个14 PWCF在M1和M6(12的17补充表S3)。在这些分析,没有发现F508del纯合和杂合的CF样本之间的差异。控制实验在细胞松弛素D的存在,吞噬作用的抑制剂,未能揭示GFP+单核细胞,证实的特异性试验(补充图S3)。此外,GFP的缺乏+血液淋巴细胞,细胞被向前散射,证实铜绿假单胞菌吸收主要是由单核细胞(补充图开通)。
总的来说,这些结果表明,1月的ETI疗法显著提高CF单核细胞的吞噬能力铜绿假单胞菌,从而导致恢复这些细胞的吞噬作用的缺陷,虽然只是部分。改善了M1是保持至少6个月,十个里有八个PWCF虽然五人经历了轻微的减少吞噬后时间点(补充表S3)。剩下的PWCF,三个显示吞噬作用的进一步增加。
随后,指数的影响评估了CF单核细胞的杀菌活性。这样做是通过监测细胞内细菌的生存60分钟(t60(t)结束后感染0)。基于单核细胞的识别主要吞噬PBMCs组件(补充图S2与先前公布的数据()和协议31日- - - - - -33),这些细胞被用来执行这个分析。正如所料,CFU恢复健康的捐赠者在t细胞60在t明显低于恢复吗0,平均减少56.5%的可行的细菌,证实有效的杀死细菌(图3一和b)。在方差,若是遇到之前恢复CF细菌细胞的数量并没有减少,而是一个非常小的,但是意义重大,增加观察(图3一)。然而,在M1和M6 ETI治疗后CFU t中恢复过来60与恢复t相比显著降低0(图3一)。因此,杀死曲线的斜率CF PBMCs ETI之前从平均+ 2.3−24.8−17.9 M1和M6,分别为(图3一)。杀活动,定义为降低CFU比例,几乎没有在CF细胞疗法(−11.77%),但在M1和M6增加到32.5%和24.3%,分别为(图3 b和c)。特别是,提高杀菌活动中观察到所有PWCF M1和八11 PWCF M6 (补充表S4)。值得注意的是,尽管ETI治疗明显改善吞噬和杀菌剂的不足,CF PBMCs仍然没有完全恢复,因为他们似乎不那么活跃铜绿假单胞菌与non-CF细胞相比,至少这里的条件下研究了。
考虑到可能的差异由于感染病毒,我们比较的杀菌剂的活动PBMCs感染临床或引用铜绿假单胞菌菌株。考虑到,铜绿假单胞菌经历连续适应CF肺环境,这一分析,我们选择了克隆菌株AA2 AA44,分别代表早期和晚期的CF隔离(34]。所示图4治疗前,CF PBMCs显示没有区别的能力杀死临床分离株或PAO1。这个结果表明CF PBMCs也同样缺乏对临床分离株,它支持一个可能的积极影响ETI的抗菌活性与临床铜绿假单胞菌菌株。
ETI纠正CF单核细胞的氧化破裂
它最近表明,最佳的杀菌活性的巨噬细胞铜绿假单胞菌氧化和non-oxidative之间需要一个良好的平衡机制,而过度和持续氧化破裂妥协杀害吞噬细菌(25]。这些发现让我们假定的失调在CF单核细胞氧化破裂的原因有缺陷的杀菌活性。为了验证这个假说,生成的氧化破裂PAO1-infected PBMCs决心通过测量超氧化物阴离子O−2生产与鲁米诺试验。在感染细胞,测定显示O的快速增长−2生产紧随其后的是基础水平的降低∼120分钟,而细胞中没有检测到信号预处理的NADPH氧化酶抑制剂diphenyleneiodonium (DPI),确认的特异性试验(补充图S4)。此外,我们发现单核细胞ROS主要生产商在PBMC人口(补充图S5)。定量分析的化学发光信号表明CF细胞的氧化破裂之前指数明显高于健康捐献者的控制,但它是在M1显著降低(图5一个)。产生的更高层次的ROS CF细胞与控制是进一步证实了2′,7′二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (H2DFCDA)探测器(补充图S6)。
接下来,我们评估的贡献的杀菌剂的活动单核细胞的氧化机制。为此,细菌生存决定NADPH氧化酶2 (NOX2)抑制细胞DPI治疗并与未经处理的细胞。正如所料,阻塞O−2产量增加引起的细胞CFU恢复non-CF和CF (图5 b我)。然而,增幅高于健康捐献者PBMCs比CF(4.43倍)细胞(1.6倍)和改进的治疗后图5 bii和iii)。
这些结果强烈表明CF单核细胞可能是由于的杀菌剂的不足,至少在某种程度上,过度氧化破裂。这个假设被评估进一步证实NADPH氧化酶的活化的蛋白质水平。为此,p47phox亚基及其磷酸化形式,phospo-p47phox(p-p47phox),占NOX2激活单核细胞蛋白质溶解产物进行分析。p47phox若是遇到高在CF单核细胞与健康的捐赠者单核细胞显著减少1月ETI疗法(M1) (图6和b)。正如所料,p47phox相似的和感染单核细胞无毒性non-CF和CF细胞(图6和b)。不同,p-p47phox在基线,尽管高CF对健康的捐赠者单核细胞,并没有改变后ETI疗法(图6 c)。然而,感染后p-p47的更高层次phox中检测出CF单核细胞与non-CF细胞相比,这是降低指数(图6 c)。在方差,p40分析phox和p-p40phox未能揭示CF和non-CF单核细胞之间的显著差异(补充图S7)。总之,ETI p47部分扭转了这种不平衡phox在CF单核细胞减少,而p-p47的显著下降phox仅限于感染细胞。
总的来说,这些结果显示一个明确的联系恢复杀菌活性和降低氧化破裂在单核细胞从PWCF ETI疗法,这表明指数提高了杀菌活性的单核细胞减少这些细胞的过度氧化破裂。
指数降低了生产CF单核细胞的il - 6
基于上述发现,我们想知道外星人也可能影响吞噬细胞的炎症反应。为了解决这个问题,PBMCs,之前和之后的治疗,是挑战与脂多糖(LPS)铜绿假单胞菌促炎细胞因子il - 6,据报道其生产在CF先天免疫细胞中特异表达,决心在文化上层清液28]。首先,我们证实,单核细胞主要贡献PBMCs产生的il - 6 (补充图S8)。接下来,在被观察到了类似的il - 6水平non-stimulated CF细胞,在1个月后ETI LPS-treated细胞显示降低il - 6的水平,尽管差异没有达到统计学意义(图7)。纯合子和杂合的科目之间的观察(没有区别补充图S9)。
讨论
CFTR最近评价临床试验与检测调节器已确认的卓越疗效ETI三联疗法相比以前开发的mono和双重疗法(10]。因此,研究小组,分析了在真实的环境中,包括学科急需治疗,ETI治疗成功的证明了一个重要的改进包括FEV CF临床参数1% pred, SSC, BMI和生命质量。因此,若是遇到的临床受益支持细胞模型选择的有效性,即。新孤立PBMCs和纯化单核细胞,研究指数对吞噬细胞的功能的影响,其活动非常相关的肺内稳态和防御入侵的病原体。已经证实,单核细胞吞噬细胞和细胞因子主要生产商在PBMC的人群,他们用于这里大部分的测试报告,而纯粹的单核细胞用于蛋白质含量分析。之前的数据显示,从PWCF单核细胞受损的吞噬和杀菌剂的活动与健康对照组相比31日,32]。这里我们报告,指数显著提高这两个活动,最高的影响被观察到在治疗1月后(M1)和后续维护的影响随着时间的推移,6个月(M6)。虽然我们不能评估对CF细胞感染临床ETI的影响铜绿假单胞菌隔离,限制我们的研究中,观察到类似的针对PAO1杀菌剂的缺陷或临床菌株,它是合理的假设外星人也可能提高monocyte-mediated临床分离株的间隙。这也是支持的一项研究显示,ivacaftor提高的活动在体外分化CF巨噬细胞感染铜绿假单胞菌应变与CF痰(21]。
总的来说,虽然吞噬作用和杀害铜绿假单胞菌CF单核细胞不完全恢复的ETI-treated主题,观察改进的活动可能导致的整体复苏CF疾病。这也是由肺部微生物显示减少PWCF阳性铜绿假单胞菌和b . cenocepacia。
为了研究分子机制的改进活动CF ETI后单核细胞疗法,我们集中我们的注意力在氧化破裂,最近被提出的条件必要条件随后激活的non-oxidative杀菌剂的机制(25]。从观察的氧化破裂的CF与non-CF细胞相比,指数样本显示,显著减少的反应类似的层面non-CF细胞,进而出现CF单核细胞的杀微生物的活动积极影响。因此,高活性氧产生的杀菌剂的活动PBMCs (CF Pre)显著低于低ROS产生PBMCs (CF M1和M6)。这是同意非常最近的一项调查,在单细胞水平,表明夸张的活性氧产量,巨噬细胞抑制整个杀菌活动(25]。这个逆ROS生产和造成效率之间的关系也证实了健康对照组,这显示ROS水平低和高指数前杀死活动与CF相比细胞。
CF单核细胞的氧化破裂,与健康细胞相比,响应也报道了来自烟曲霉属真菌与恶化的疾病严重程度的加重,肺功能评估33]。相反,更不同的CFTR功能检测对巨噬细胞的氧化破裂的影响已经被报道。尽管monocyte-derived巨噬细胞产生的活性氧来响应铜绿假单胞菌感染CF和健康对照组没有差异,观察高活性氧产量与CF monocyte-derived巨噬细胞相比,CF肺泡巨噬细胞(16]。进一步观察变化b . cenocepaciaCF monocyte-derived来华的巨噬细胞,产生低水平的活性氧与健康细胞相比,这一缺陷分配给缺陷激活NADPH [17]。总的来说,这些结果表明,氧化破裂反应由单核细胞和巨噬细胞可能影响不同的缺乏CFTR功能检测和感染的病原体。
基于当前视图的存在一个严格的氧化与non-oxidative杀菌剂的机制必须精细的最佳杀死入侵的病原体(25),我们的研究结果有力地表明,外星人,通过减少NOX2 NADPH氧化酶,提高整个杀菌单核细胞的活性。这个改进可能是由于更一般的外星人对蛋白质的影响膜贩运,进而导致NADPH氧化酶的组装和活动正常化和/或作为一个由获救的雌性生殖道的间接影响。特别是,看来,这适用于p47phox持续升高的CF单核细胞减少了外星人,不管铜绿假单胞菌感染。相反,NOX2激活p-p47探测到phox(35],它出现在CF细胞高度可变,因此需要进一步调查,只在感染细胞降低了外星人。其他NOX2子单元,如p40phox,似乎没有受到雌性生殖道在单核细胞功能障碍,与最近的示威在协议的不相关性NOX2活动在这些细胞(36]。雌性生殖道校正技术的可能性,通过提高雌性生殖道膜贩运,有助于拯救其他蛋白质,与雌性生殖道的贩运和活动,已经被证明了的恢复膜结合PTEN在CF(磷酸酶和tensin同系物)单核细胞治疗CFTR突变特异检测校正(32]。最近,雌性生殖道调节器的作用也在复苏ATP-induced P2X7R-mediated inflammasome激活单核细胞分离PWCF接受ETI治疗(24]。此外,它可能会猜测,雌性生殖道调节器,通过减少呼吸道症状和体征,可能导致肺微环境正常化,从而干扰免疫细胞的表观遗传重编程37]。
CF肺是由高水平的促炎细胞因子,移植后大大下降,这表明雌性生殖道表达和功能需要控制肺部炎症的环境(38]。目前的复苏hyper-inflammatory反应ETI CF单核细胞的治疗已经记录了有限合伙人/ ATP-induced IL-1β分泌(24]。我们的数据显示减少,虽然不明显,LPS-induced il - 6分泌的单核细胞ETI疗法后,支持更广泛的抗炎特性的ETI疗法描述需要进一步调查(24]。这和之前发表的作品让我们假定的分子途径被认为是负责具体的CF细胞功能失调,如旺盛的炎症反应或有缺陷的杀菌剂的活动,可以考虑发展新的治疗策略,旨在提高CF疾病。这个机会似乎是特别重要的治疗对雌性生殖道的PWCF调节器,谁可能会受益于替代疗法改善宿主防御入侵的病原体和炎症反应的管理。
补充材料
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确认
作者感谢雅格布Savastano(流行病学、拉齐奥地区卫生服务,罗马,意大利)对他的支持与统计分析。
脚注
作者的贡献:·德尔·波尔图g .西米洛和f . Ascenzioni概念化的研究。g .西米诺·e·费拉拉,p . Baiocchi和g . Mandarello招募了主题和收集样本。西米洛和e·费拉拉提供临床资料。l . Cavinato F.R. lu,诉帕斯托雷,d . Chiappetta和g Sangiorgi进行了实验。l . Cavinato p·德尔·波尔图和f . Ascenzioni分析数据和写的手稿。所有作者回顾了最终版本的手稿。
利益冲突:所有作者没有披露。
支持声明:这项工作得到了Sapienza大学罗马,意大利,格兰特数字RM11916B88E57B66 RM120172B1634AA0 RP12117A86637295。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2022年4月5日。
- 接受2022年11月12日。
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