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基于核磁共振(NMR)的呼出呼吸冷凝物(EBC)代谢组学分析是一种无创方法,已被用于研究呼吸系统疾病[1那2].在之前的一项研究中,我们质疑基于nmr的EBC分析的准确性,证明可重复使用的冷凝器部件的清洁方案产生了一个混杂的代谢物指纹,这在很大程度上与来自呼吸道和呼出呼吸的肺泡部分的内源性代谢物无关[3.].在这里,我们提出了新的数据,提供了定性评价外源污染物的核磁共振波谱分析EBC,一些来自室内空气。考虑到这些污染物在核磁共振光谱中的存在,将这些成分分类为肺功能的生物标志物应该非常谨慎。先前的研究报告了在对人类呼出气体中的挥发物进行质谱分析时存在室内空气成分[4.那5.]和人类呼出气体冷凝物中的非挥发性物质[6.].然而,尽管EBC的先前基于NMR的代谢物研究报告存在外部杂质,例如消毒剂或唾液信号[1[不考虑污染代谢物在室内空气中的影响。
为了分析外源信号对EBC分析的影响,采用ecoScreen冷凝器(Jaeger,Würzburg,德国)收集了来自健康志愿者的房间空气凝结物和EBC。采用空气冷凝物的样品,用一个装置以流速将室内空气连续泵入冷凝器(15升·min-1)和正常人类呼吸的典型潮气量(500毫升)。典型的样本采集所需时间是15分钟。另一组室内空气样品收集通过定位一个陷阱air-contained水溶性有机化合物之间的泵、冷凝器研究外源信号的起源是为了区分室内空气信号和其他污染物。在这种情况下,周围的空气被引导通过一个装有蒸馏水的房间,这样任何水溶性的环境化合物都将留在水中。过滤后的空气随后被压缩到用于整个实验的同一套EcoScreen设备中。EcoScreen冷凝器的可重复使用部分用次氯酸盐溶液浸泡(15分钟),然后用去离子水冲洗(15分钟)。因为次氯酸盐溶液不会产生1H NMR信号,此清洗程序应避免消毒剂污染房间空气凝结水和EBC样品。
一股温和的氮气流流过冷凝物,以去除挥发性物质。氮气暴露5分钟后,样品立即在-80°C冷冻并保存至NMR分析。为了评估干燥对NMR代谢组学分析的影响,在进行NMR分析之前,一半的样品在Cryodos-50冻干机(Telstar, Barcelona, Spain)中冻干。将未冻干的样品解冻,将400 μL的冷凝物转移到2ml eppendorf管中。50 μL 1 mM丙酸三甲基硅基(TSP)在氘水中(D2O),以提供场频锁定和内部化学位移参考。冻干后的样品用150 μL D重建2o和25μl1mmtsp在d中2O.两组样品都转移到3毫米NMR管中。1H-NMR光谱在700.13 MHz下使用配备TCI CryoProbe的BrukerAvance III光谱仪(Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)进行,并在4°C下操作以减少代谢物降解。标准溶剂抑制光谱分为32,000个数据点,平均超过256个采集点。数据采集持续16分钟,使用基于NOESY脉冲序列的第一增量序列抑制水共振,限制B0和B1不均匀性对光谱的影响。
这1健康受试者的冻干呼出气体冷凝物与室内空气的核磁共振氢谱显示高度对应(图1).同样的对应关系在1从EBC获得的非冻干样品的H NMR光谱信号(图S1A)和室内空气冷凝物(图S1B)。冻干和非冻干样品的比较表明,非冻干光谱呈现较少的NMR信号,表明样品浓度(冻干和重悬浮)改善了NMR敏感性。1冻干室内空气冷凝物样品的核磁共振氢谱清晰地显示出丙二醇、丙酸、醋酸、乳酸、甘油、苯甲酸和甲酸等成分的存在(图S2)。根据人类代谢组数据库分配共振[7.].非滤波和滤波室空气的比较表明,集电器疏水阀(图2).不过,过滤后的室内空气样本仍给1核磁共振信号,包括乳酸和非识别信号(图2b).
1冻干冷凝物的核磁共振氢谱(NMR)来自a)健康受试者呼出的气体和b)通过连续的气泵泵入冷凝器的房间空气。Ppm:百万分之一。
![图2-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/40/5/1294/F2.medium.gif)
1h -核磁共振(NMR)谱a)冻干冷凝物从房间空气和b)房间空气过滤水溶性有机陷阱。Ppm:百万分之一。
主成分分析(PCA) [8.用于分析室内空气冷凝样品之间的可变性。PCA模型采用连续两天收集的八个房间空气凝聚液开发:第1天,早晨(N = 2);第1天,下午(n = 2);第2天,早上(n = 2);和第2天,下午(n = 2)。在PCA之前,1H-NMR光谱数据被自动还原为等长(δ0.01 ppm)的整体片段或桶,以补偿共振位置的变化[9.并归一化至已知浓度的TSP峰值。最后,对数据进行集中和帕累托缩放。PCA得分图(图S3)显示了第1天和第2天收集的样本之间沿着第一个主成分的完美区分。此外,在上午样本和下午样本之间,沿着第二主成分也观察到明显的分离。此外,为了评估EBC光谱数据的过拟合,将8个房间空气冷凝物分为任意两组(A和B),每组在每个采集时间包含一个样本。偏最小二乘分析[10应用了研究两组之间的显着差异。通过配对T检验比较光谱变量。在低于0.05的p值下差异被认为是统计学意义的。统计计算和光谱处理进行了代谢型封装(Rel.3.3.1)进行了[11].
在我们看来,本研究证明了EBC样品中存在一种与内源性肺代谢无关的人工代谢指纹。比较的1来自健康受试者的EBC样品与同时收集的房间空气冷凝物样品的核磁共振波谱显示了明确的相关性。我们的1H NMR分析表明,室内空气中含有代谢相关的信号,如丙酸、乙酸和乳酸,这些信号在早期的研究中被提出作为呼吸系统疾病的生物标志物[1].在我们的研究中,对房间空气变异性的无监督统计分析表明,房间空气代谢物分布与收集的日期和时间有关。此外,作为代谢组学分析中统计缺陷的证据,房间空气冷凝物被随机分配到两个任意组,并进行监督PLS分析以检测这些组之间的差异。PLS得分图(图S4)显示出两组之间清晰的分离,PLS模型得到R2值为98.57,这通常被认为是一个良好的分类模型。有96个光谱区p值低于0.05。这个测试的结果加强了这样一种想法,即PLS评分图单独不足以评估组间的差异。PLS算法完全能够在少于50个样本的多变量和超大变量空间中搜索和识别代谢谱之间的任何差异。因此,在没有监督的情况下,PLS算法可以检测任意类之间的虚假差异。代谢组学数据分析中的分类问题已被广泛讨论[12那13]大多数模型遭受过度装备。从这里呈现的结果,我们可以得出结论,培训数据的简单成功分类不能被视为模型的强大参数。有关数据可预测性和提高解释质量的更现实信息将需要其他数据集进行外部验证分析。
本研究证明存在外源性代谢型材1EBC的核磁共振氢谱,反映室内空气污染物的存在。此外,我们已经识别了空气室内污染物,并通过实验日期和时间证明了室内空气冷凝物光谱的可变性。房间空气冷凝物含有与以前的出版物中假定的疾病生物标志物相同的代谢物[1[我们对PLS测试的目前分析提出了对EBC的NMR分析开发的模型的统计稳健性。
在我们看来,定量呼吸中的代谢物的研究人员必须以某种方式补偿背景空气中的分析物。这可能是核磁共振方法的一个问题,因为在采集期间过滤掉这些信号是不可能的。然而,对于基于质谱(MS)的方法来说,这不是一个问题。因此,我们认为基本上有三种工作选择。1)忽略问题。这可能是最糟糕的情况,不幸的是,大多数关于EBC主题的论文都没有提到这个问题。我们的结果表明,这不仅是挥发性代谢物的问题,也是EBC代谢物的问题。我们的结论是,基于ebc的呼吸组学数据是有偏差的,如果这些代谢物仍然存在于分析中,结果可能会过度拟合。2)在采集EBC数据之前和期间为受试者提供医疗空气。目前,这种方法需要在严格控制的研究中进行验证,可能是任何相关的基于EBC数据的NMR的唯一解决方案。 In theory, this new control could provide an unambiguous picture of breath metabolism. 3) Subtracting the air background from the breath signal (alveolar gradient). This method is currently applied in MS breath analysis by measuring the metabolic concentration in volatiles (also in EBCs) and subtracting (filtering) the analytes from room air. Details about room air measurement have been previously reported [14].类似的方法不能容易地转化为基于NMR的代谢组数据。
总之,我们提出医疗空气吸入应该是未来基于NMR的代谢组分的要求。
致谢
我们感谢西班牙马德里康普卢腾斯大学核磁共振中心的D. Molero获得了核磁共振光谱。S. Bartlett (CNIC,马德里,西班牙)提供英文编辑。
脚注
本文提供了补充材料www.www.qdcxjkg.com.
支持声明
该研究得到了PI-Net欧洲网络(ITN-FP7-264864)和西班牙经济和竞争部(SAF2011-25445)的支持。CNIC由Pro-CNIC基金会和经济部和竞争部提供支持。
感兴趣的语句
没有宣布。
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