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提高结核病(TB)诊断的实验室能力导致了在大规模上替代常规显微镜和培养方法的分子测定的发展[1那2]。不幸的是,目前的分子技术检测活性和死细菌,阳性结果并不意味着病原体的活力。实际上,DNA可以在长期后持续到死亡和死亡细菌的核酸同等速度。因此,分子测定不适合治疗监测和/或感染控制目的。
我们报告了一种创新的方法来选择性地扩增来自可行的DNA结核分枝杆菌在临床标本中,可用于监测抗TB治疗期间肺结核患者的分枝杆菌载体。
该方案基于用单氮化物丙醇(PMA; Biotium Inc.,Haywarium,Ca,USA)的样品的预处理,一种化学化合物,可以插入非活性(或膜受损)生物的DNA,但被排除在外可行的细菌。在光活化后,PMA与DNA共价结合,防止其PCR扩增[3.]。曝光后,未结合的PMA不能进一步与DNA分子相互作用。
首先使用酸 - 快性杆菌(AFB)的测定优化,刺激性痰样品掺入死亡或在不同浓度下活的分枝杆菌。简单,生活重组史蒂姆加入细胞N- 通过涂抹显微镜以10的涂抹显微镜将苯乙串 - 半胱氨酸净化痰标本为阴性阴性。6.细菌·ml.-1。将该实验室样品的等分试样处理以热量杀死M. Fortuitum.细胞。将PMA储备溶液制备并储存在-20℃下,并根据制造商推荐的直至使用直至使用。以500μm的最终浓度加入PMA作为预处理,并在黑暗中在4℃下孵育30分钟,然后在蓝光发光二极管(LED) - 活性光(Geniul,Terrassa,Spain)中温育30分钟。)室温下15分钟。然后使用标准酚氯仿程序提取DNA。作为评估光曝光步骤的功效的对照,从一个中提取的裸体DNA等分试样M. Fortuitum.用先前暴露于LED灯的500μmPMA处理培养15分钟。然后进行商业线探针测定(Genotype®Imcobacteriumcm; Hain LifeScience,Nehren,德国),以鉴定临床相关的分枝杆菌物种[4.]。含有Live的样品M. Fortuitum.在硝酸纤维素条上显示正常杂交曲线,而杀灭细菌的样品没有显示出任何扩增,除了内部控制(数据未显示)。由于用光灭活PMA处理的裸体DNA显示出正常的杂交曲线,因此光曝光步骤有效,并且通过残留PMA不进一步抑制PCR。
优化了从死细菌衍生的DNA失活的方案,我们将其调整为Xpert®MTB/ RIF自动化测定(Cepheid,Sunnyvale,CA,USA)。由XPERT®MTB/ RIF执行的实时PCR提供阈值循环(CT),可用于计算样品与没有PMA预处理(ΔCT)的样品之间的扩增产量差异(ΔCT):低ΔCt表示存在来自活细菌的可扩增性DNA,而高ΔCt表明样品中的靶DNA源自死亡或受损的细菌,因此,PMA预处理显着影响其扩增。为了计算Δct值,我们认为为Xpert®MTB/ RIF测试中包括的每个探针(A至e)提供的每个探针提供的CT值之间的平均值[5.]。
我们使用Xpert®MTB/ RIF测定对PMA协议进行了在AFB阴性临床标本的CT校准曲线上进行的,其具有不同比例的热杀死/活的分枝杆菌。高死实时比率导致ΔCt值与PMA的活体部分之间的ΔCt值的最大差异,而含有类似百分比的杀死和活细菌的样品不能通过使用PMA预处理(数据未显示)。k报告了类似的数据ralik.等等。[6.]。
最后,我们在临床标本上测试了这种方法。在第一次验证研究中包括10名诊断患有活性肺结核的患者(痰涂片阳性和培养阳性)。在诊断时收集样品(T.0)和治疗10-20天后(T.1),N- 根据国际指南,对Mgit-960液体培养(BD诊断系统,MD,美国)进行脱盐和加工[7.]。所有患者均通过痰涂片显微镜静止T.并行,通过Xpert®MTB/ RIF测定法处理250μL去污样品,通过Xpert®MTB/ RIF测定进行分子分析,无需PMA预处理。然后按照制造商的XPERT®MTB/ RIF测定的说明加工样品。
如图所示图1,PMA没有显着影响所收集的标本的PCR产量T.0(平均值±SEM.ΔCT2.3±0.5),而在治疗期间收集的样本T.图1显示了PMA处理后的ΔCt10.5±0.9(p = 0.0003),证实这些样品的痰涂片阳性主要是由于受损的细菌受损。此外,Δct计算T.0和T.在PMA - 未处理的样品中发现过低(ΔCT2.9±0.9),以欣赏由于治疗而导致的细菌负荷的实际降低。
两名患者评为“低”T.0由Xpert®显示负面文化T.1,而所有其他患者的额定“培养基”或“高”含有MGIT阳性的培养。虽然无法评估阳性的确切时间,但我们观察到来自样品的培养物收集T.1与来自样本收集的样本的培养物相比,大约7-10天变得阳性T.0,表明活细菌负荷严重降低。
所有患者在治疗结束时成功地治疗并固化,这与PMA测定检测到的活细菌的减少一致。
作为阴性对照,我们回顾性也包括治疗失败案例(5个月的标准治疗后AFB阳性和培养阳性)。在这种情况下,PMA在治疗期间收集的净化痰样品的PMA预处理并未显着影响PCR产量(ΔCT〜2),从而支持抗TB处理的低效率。
原则上,相同的协议应与世界卫生组织诊断结核病的其他CE批准的分子试验和线探针测定兼容;需要进一步研究来排除这种可能性。
之前的学习 [3.那6.]已经证明使用PMA使用25-50μm的浓度来使用PMA区分活体和死基团。在方案设置期间,最终浓度为100μm,完全避免扩增来自热杀伤的DNAM. Fortuitum.;由于DNA从热杀死的扩增而疲软的背景玉米菌菌观察到(数据未显示)。我们可以推测不同的细胞壁组合物以某种方式影响PMA渗透受损的分枝杆菌的能力。确实,Kralik.等等。[6.]观察到PMA诱导的Live和Dead之间的信号降低分枝杆菌无性系种群。paratuberculosis.与其他细菌物种的那些相比较低。此外,考虑到可能潜在地螯合在净化的烟库中的碎片量,我们将最终浓度增加到500μm。进一步研究评估PMA治疗效果对显示不同细胞壁组成的菌株的差异(例如北京菌株和/或与不同特征的斯坦塔(例如含有血液的痰液)可以更好地阐明在不同临床环境中该测试的有用性。
根据L.Øvdal.等等。[8.[假定死亡或严重受伤的小比例不能生长。存在严重受伤但不追加的少量细胞可以解释为什么我们仍然在收集的样本中具有正信号T.1尽管PMA预处理。PMA预处理不能避免检测小比例的死细胞(用于活力测定的假阳性):因此,可能是高估可行的分枝杆菌。然而,从临床的角度来看,与低估可行的分枝杆菌的风险(对于该测试非常小的风险相比,这将代表轻微误差。
我们的数据首次表明,定量分子技术结合PMA方法可以替代直接显微镜和培养来监测早期治疗反应和初步评估个性化方案。使用这种方法可以更早地评估治疗效果,显示出重要分枝杆菌负荷的明显下降。然而,对治疗缺乏反应也可能被检测迅速发现,允许改变方案,并限制感染的传播和进一步的耐药性发展[9.]。
脚注
支持声明
导致这些结果的研究已获得欧洲共同体第七框架计划(FP7 / 2007-2013)的资金,该计划于授予D.M.FP7-223681。Cirillo。
兴趣表
没有宣布。
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