文摘
内皮素(ET)系统导致肺血管张力和改造在吸烟者和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。
本研究调查了香烟烟雾的影响(CS) ET受体(等一个)和B(等B)表达在人类肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)和人类的肺内的小动脉,以及其功能的后果。
CS提取物(CSE)增加等一个和等B表达HPASMCs和小肺内的动脉,应用波生坦减毒的,等一个拮抗剂BQ123等B拮抗剂BQ788,通过阻断ET-1对ET-1单克隆抗体,表明前馈机制由ET-1释放。ET受体(ETR)对抗减毒CSE-induced HPASMC增殖。此外,CSE暴露增加了急性ET-1-induced肺内的小动脉收缩,减毒的应用波生坦,BQ123 BQ788。吸烟和慢性阻塞性肺病患者的肺动脉显示更高的表达等一个和等B病人比不抽烟的人。
这些结果显示一个新颖的机制ETR封锁变弱CS-induced ETR超表达,随后,肺内的小动脉张力。这些数据可能是潜在的价值来解释应用波生坦治疗的影响在某些形式的不成比例的COPD患者的肺动脉高压。
肺动脉高压(PH)是一种相对常见的香烟(CS)全身的肺病。PH值发展∼6%的受试者有慢性阻塞性肺疾病(COPD)但存在于∼40%的患者用力呼气量在1 s < 1 L [1,2]。PH值在COPD的发病机制尚不清楚。目前的研究表明,PH值直接影响造成的CS在肺内的分泌的血管vasoconstrictive /增殖肽,如内皮素(ET)和血管内皮生长因子,后来导致血管重塑和PH值的发展(3]。ET-1的循环水平升高后暴露在CS在人类4),它已经表明,ET-1与慢性阻塞性肺病患者的肺动脉收缩压与PH值(5),这表明ET-1 CS-induced血管重塑。ET-1激活两个受体等一个和等B,位于肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),而只等B在内皮细胞存在。两个外星人一个和等B调解核扩散和PASMCs从小肺动脉收缩性,而内皮等B调节正常肺动脉血管舒张。等Bupregulation已经观察到在人类血管缺血性心脏病患者(6)、高血压(7)和严重的PH值(8]。最近,它已被证明,CS提取物(CSE)诱导等一个和等B超表达在抗脑动脉从老鼠机制暗示激活细胞内增殖作用的蛋白激酶(MAPK)细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2和p38,转录因子核因子(NF) -κB和c-Jun n端激酶(物)9- - - - - -11]。
upregulation的数据表明,ET受体(ETR)是一个重要的分子机制,可以发展的一个重要组成部分病理肺部动脉次要CS,如内膜的增厚、血管狭窄和博士因此,治疗干预措施主要集中在抑制ETR表达式可以改善肺动脉重塑和紧张的潜在价值与COPD吸烟。目前,没有数据存在关于CS ETR表达人类的影响PASMCs (HPASMCs)和人类肺内的小动脉,和ETR拮抗剂对ETR的规定的影响。
本研究进行分析CS的影响在HPASMCs ETR表达和ET释放和小肺内的动脉,以及带来的后果ETR upregulation HPASMC增殖和肺内的小动脉张力。此外,我们研究是否ETR对抗可能减弱ETR CS引起的表达及其功能的后果。我们发现,应用波生坦双重ETR拮抗剂部分抑制CS-induced等系统激活HPASMCs和肺内的小动脉,以及其功能的后果。这些数据可能是潜在的价值来解释应用波生坦治疗的影响在某些形式的不成比例的PH值与COPD吸烟。
方法
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病人
总共六个不抽烟的人控制,七吸烟者和八COPD患者纳入研究。肺组织研究都是从冷漠肺组织在叶切除术切除恶性病变。远端肺的样本,从肿瘤尽可能远,被选择的研究。肺功能测试(迫使肺量测定法)和动脉血气测量在前几天进行手术。没有一个病人表现出临床证据博士HPASMCs在体外实验隔绝2-3-mm肺动脉不抽烟的肺部组织。展示肺片和肺内的小动脉(内部直径100 - 300μm)准备从不抽烟的人的肺部组织。孤立的肺动脉内直径0.5 - -1.0毫米被用来衡量ETR表达不吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病患者。协议是当地的研究和独立的伦理委员会批准的大学总医院瓦伦西亚(瓦伦西亚,西班牙)。通知从每个参与者获得书面同意。临床特征的病人中定义表1。
隔离和HPASMCs文化
发表材料从手术标本不抽烟的病人使用。HPASMCs手术标本中分离的人类肺动脉正如前面概述(12]。简而言之,肺动脉段(内部直径2 - 3毫米)与1%胶原酶消化(Gibco,佩斯利,英国)rpmi - 1640培养基为30分钟37°C。HPASMCs隔绝人类肺动脉内皮细胞(HPAECs)通过CD31-coated Dynabeads (Dynal生物技术,达姆施塔特,德国)正如前面概述(12在杜尔贝科修改鹰的培养基培养)和(DMEM)补充10%胎牛血清,1%二性霉素b和2%链霉素/青霉素。所有HPASMCs研究使用从通道1到4。
实时rt - pcr
实时rt - pcr进行正如前面概述(13]。总之,总RNA分离培养使用TriPure HPASMCs®隔离剂(罗氏,印第安纳波利斯,美国)。互补脱氧核糖核酸等放大与特定的引物B和等一个应用生物系统公司(预先设计,促进城市,CA,美国;等B:目录Hs00240747_m1数量;等一个:目录编号Hs03988672_m1)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(应用生物系统公司预先设计;目录编号4352339 e)作为看家基因。相对量化这些不同的成绩单决心与2-ΔΔCt方法使用GAPDH作为内生控制和正常对照组。
免疫印迹
从HPASMCs蛋白分离,人类肺展示片,和肺动脉组织不吸烟,吸烟者和慢性阻塞性肺病患者检测等B(50 kDa)等一个(54 kDa)磷酸化ERK1/2 (42-44 kDa)和β-actin (42 kDa)使用immunodetection免疫印迹正如前面概述(13,14]。给出细节在网上补充材料,部分的扩展方法。
CSE解决方案的准备
CSE准备如前所报道(13]。简而言之,研究香烟的烟雾(2 r4f;美国肯塔基州列克星敦市肯塔基大学)是由呼吸泵和通入生成一个包含25毫升DMEM烧瓶。由此产生的CSE CSE的解决方案被认为是100%,30分钟内被用于实验的准备。
为细胞毒性测试来自CSE HPASMCs服用CSE浓度高达10%的24和48 h。上层清液乳酸脱氢酶水平无显著差异(乳酸脱氢酶细胞毒性试验;开曼化工、马德里,西班牙)观察,而对照组(数据没有显示)。
细胞内自由钙测量
细胞内自由钙离子浓度(Ca2 +]我)是由荧光显微镜测量(TE200;尼康,日本东京)HPASMCs使用钙指示剂染料fura-2正如前面概述(13- - - - - -15]。fura-2荧光比率记录每0.1 s 10使用一个λ萨特(尼康)和荧光分析仪器与Metafluor®5.0软件(分子器件、桑尼维尔,美国)。(Ca2 +]我通过比率分析计算如前所述[13]。
细胞收缩
收缩HPASMCs回应ET-1研究牵引力显微镜正如前面概述(13]。与嵌入式荧光微Collagen-coated聚丙烯酰胺凝胶(直径200海里)。凝胶磁盘与培养HPASMCs被孵化24小时没有CSE(控制)或存在10%,单独或联合应用波生坦(CSE)前30分钟(10μM), BQ788(10μM)和BQ123(10μM)。后,凝胶磁盘与培养HPASMCs想起用显微镜使用具有亮照明。基线记录7分钟后,ET-1 (10 nM)和荧光图像获得了额外添加了12分钟。基质细胞是引起牵引力计算位移场的凝胶基质。
细胞增殖实验
HPASMC增殖是由比色测量免疫测定基于溴脱氧尿苷(BrdU)结合在DNA合成使用细胞增殖ELISA BrdU工具包(罗氏,曼海姆,德国)正如前面概述(14]。
ρ活动和化验
商用,ELISA-based RhoA-GTP活动试验(G-LISA;细胞骨架,丹佛,美国公司)是用来测量的相对RhoA-GTP活动serum-starved HPASMCs实验治疗后如前所列出(13]。等被酶免疫分析法测量HPASMC文化上层的工具包(开曼化学)根据制造商的协议。
二乙酸二氯荧光素荧光测量的活性氧
细胞内活性氧(ROS)水平(H2O2和超氧化物阴离子)测定HPASMCs通过二氯荧光素二乙酸(DCF)正如前面概述(13]。细胞治疗应用波生坦(10μM), BQ788(10μM)或BQ123(10μM) 30分钟前添加10% CSE和孵化24 h。
潜伏期结束时,细胞被洗两次与PBS和荧光测量使用微型板块分光光度计(Victor 1420;西班牙,马德里,PerkinElmer)。结果表示为荧光光纤相对荧光单位。代表每个条件捕获的图像通过荧光显微镜。
免疫荧光
展示人类的肺片在应用波生坦的存在与否,孵化BQ788或BQ123 1 h和刺激10% CSE 24 h。然后,肺片与PBS和固定洗了三次(4%多聚甲醛在室温下4 h)。片是嵌入在10月™化合物(Tissue-Tek®,阿尔文,长荷兰)和应用等一个和等B抗体之后,第二个rhodamine-conjugated抗体的应用。比较研究自体荧光的内部和外部的弹性板使区分血管内皮和平滑肌细胞(smc)在肺内的小动脉。
准备展示肺片从人类肺切除
展示肺片得到正如前面概述(16与一些细微的修改。短暂,3% (w / v)极低熔点琼脂糖(σ,普尔,英国)注入肺组织,这是使用Krumdieck组织切片机切成展示片(模型MD4000;美国阿拉巴马州的研究和开发、Munford AL)切片厚度为260 - 300μm。我们精心选择了只有小动脉毗邻的小型航空公司。部分被放置在新的媒介和孵化的存在与否,应用波生坦(10μM), BQ788(10μM)或BQ123(10μM) 1 h之前刺激有或没有呈现10% CSE 24 h。片使用显微镜(Eclipse TE200,尼康;放大×40)连接到一个住电荷耦合器件相机(CoolSNAPfx;美国亚利桑那州图森市光度)。冲刷后(30分钟),80毫米氯化钾灌注了5分钟建立最大收缩反应(100%)。经过清洗和平衡灌注(通常10分钟),所需的最低浓度ET-1开始浓度响应(10−9-10年−6米)管理。小肺动脉收缩持续监控,表示为一个百分比的最大断面收缩率与氯化钾。动脉管腔面积测量使用MetaMorph软件(分子设备),在单位平方微米。结果表示为氯化钾面积的百分比。一个日志half-maximal有效浓度(EC50(E)值和最大的药物的影响马克斯)值为每个动脉来自量效曲线。给出细节在网上补充材料,部分的扩展方法。
分析的结果
所有值都报道意味着±扫描电镜。决定进行复制和至少三个独立的实验条件。双官能团进行分析比较使用依赖的双尾配对t检验样本,或为独立样本未配对t检验。多重比较分析了由单向方差分析Student-Newman-Keuls紧随其后事后测试。对于所有过程,假定值< 0.05的被认为是具有统计学意义。
结果
CSE-induced等B和等一个upregulation由应用波生坦预防
在体外暴露HPASMCs CSE引起剂量和时间的增加等一个和等B蛋白质和mRNA表达(图1一个和b), 24小时后达到峰值10% CSE的刺激。基于这些结果,我们选择10% CSE 24 h为后来的研究刺激条件。Pre-incubation HPASMCs与应用波生坦(10 nM 10μM)摄入量有关预防等一个和等B蛋白质upregulation (图1 c)。选择性等。B拮抗剂BQ788防止CSE-induced等Bupregulation浓度1和10μM浓度,观察而没有影响CSE-induced等一个upregulation (图1 d)。相比之下,选择性等一个拮抗剂BQ123成功预防等一个upregulation在100 nM 10μM和等B在1到10 upregulationμM (图1 e)。研究上执行mRNA表达显示相同的结果与观察到的蛋白表达(图1 f和g)。
吸烟增加内皮素受体A和B(等一个和等B分别)。香烟烟雾提取物(CSE))剂量- b)时间增加等B和等一个蛋白质和mRNA表达在人类肺动脉平滑肌细胞。c)应用波生坦(BOS), d) BQ788和e) BQ123摄入量有关防止CSE-induced等B蛋白表达,只有BOS和BQ123摄入量有关预防等一个表达式。f) BOS和BQ123摄入量有关防止CSE-induced等B和等一个基因的表达。g) BOS, BQ123 BQ788摄入量有关防止CSE-induced等一个表达式。数据意味着±扫描电镜三个独立实验的条件。*:p < 0.05与各自的控制(C)条件;#:与CSE组相比p < 0.05。
CSE-induced等B和等一个表达式是部分由ERK1/2 RhoA-GTP和细胞内ROS下游通路,以及由一个自分泌ET-1前馈机制
孵化的HPASMCs ERK1/2抑制剂PD98059(10μM), Rho-kinase抑制剂Y27632(10μM)或抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(NAC)(1毫米)有效地预防等B和等一个蛋白质过度引起的CSE (图2一个)。同样,HPASMC孵化与单克隆抗体ET-1(10μg·毫升−1)也抑制CSE-induced等B和等一个超表达(图2一个)。在其他的实验中,ET-1 (10 nM)(24小时)增加等B和等一个蛋白表达(图2 b)。应用波生坦(10μM), BQ123(10μM), PD98059 Y27632或NAC部分防止ET-1-induced等B和等一个蛋白表达同时BQ788(10μM)唯一的预防等B超表达(图2 b)。这些结果符合B和等一个基因表达(图2 c)。有趣的是,10%的CSE(24小时)上层的ET水平明显增加(p < 0.05)与控制;图2 d),由应用波生坦预防、BQ788 BQ123, PD98059 Y27632, NAC(1毫米)(图2 d)。
吸烟增加内皮素受体A和B(等一个和等B分别通过一个机制,这其中牵扯到的细胞内活性氧,细胞外signal-regulated激酶1/2,RhoA-GTP和自分泌内皮素(ET)前馈机制。的增加等一个和等B香烟烟雾提取物(CSE)诱导10% (24 h(孵化)阻止了PD98059(10μM), Y27632(10μM)或N乙酰半胱氨酸(NAC)(1毫米)在人类肺动脉平滑肌细胞。孵化与ET-1单克隆抗体(mAb)(10μg·毫升−1前30分钟CSE之外也预防等一个和等Bupregulation,与消极的免疫球蛋白(Ig) G1同形像控制。孵化10 nM ET-1 24 h显著增加等一个和等Bb)蛋白质和c) mRNA表达,由应用波生坦预防(BOS)(10μM), BQ123(10μM), PD98059, Y27632和南汽,而BQ788(10μM)唯一的预防等B,但不是等一个,表达。d) 10% CSE ET释放增加,减毒的BOS, BQ123, BQ788, PD98059, Y27632和南汽。数据意味着±扫描电镜三个独立实验的条件。*:p < 0.05与各自的控制条件;#:与CSE组相比p < 0.05。
CSE-induced细胞内ROS, ERK1/2磷酸化和RhoA-GTP激活被应用波生坦预防。
CSE来自DCF形成胞内荧光强度增加了∼2.73倍24 h后,应用波生坦BQ123显著降低CSE-induced ROS形成1.17∼∼1.5倍,分别虽然BQ788并未达到显著减少(∼2.23倍)(图3和b)对照组。此外,CSE增加ERK1/2磷酸化和RhoA-GTP激活24 h后,由应用波生坦,有效地防止BQ123,在较小程度上,通过BQ788 (图3 c和d)。
内皮素受体拮抗变弱全身的香烟烟雾提取物(CSE)活性氧(ROS),细胞外signal-regulated激酶(ERK) 1/2磷酸化和RhoA-GTP激活。a、b) 10% CSE提高细胞内ROS生成后24小时的暴露评估的二氯荧光素(DCF)人类肺动脉平滑肌细胞的荧光强度。CSE-induced ROS生成抑制了应用波生坦(BOS)(10μM)和BQ123(10μM)但不是BQ788(10μM)。细胞内ROS)代表荧光图像。酒吧= 20μm规模。c) 10% CSE引起ERK1/2磷酸化后24小时的接触,由BOS,抑制由BQ123减毒,在较小程度上,通过BQ788。d) 10% CSE RhoA-GTP激活也是抑制增加了BOS,减毒BQ123,在较小程度上,通过BQ788。数据意味着±扫描电镜三个独立实验的条件。RFU:相对荧光单位;福利:磷酸化ERK;OD490年:光密度测量在490海里。*:p < 0.05与各自的控制条件;#:与CSE组相比p < 0.05。
应用波生坦预防CSE-induced HPASMC增殖
CSE细胞增殖增加了∼2倍(图4)。应用波生坦抑制细胞增殖而BQ123和BQ788扩散减少了1.31,∼∼控制权分别1.6倍(图4)。此外,PD98059 Y27632 NAC(1毫米)也阻止了细胞增殖。因为它已被证明,CSE增加浮在表面的ET水平,我们选择性地阻止ET-1 ET-1单克隆抗体,随后减少细胞增殖到基底的水平(图4)。自从HPASMC扩散在活的有机体内主要是由生长因子,如血小板源生长因子(PDGF),我们治疗细胞存在与否的CSE人类重组PDGF-BB 10 ng·毫升−1。PDGF-BB增加细胞增殖没有CSE的3.1倍和3.5倍的CSE。应用波生坦,BQ123 BQ788抑制细胞增殖诱导CSE和PDGF-BB 1.6 - 1.9和2.1倍,分别为(图4 b)。
吸烟增加肺动脉平滑肌细胞增殖。香烟烟雾提取物(CSE)增加10%)人类肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)扩散后24小时的暴露。应用波生坦(BOS)(10μM), BQ123(10μM), BQ788(10μM), PD98059(10μM), Y27632(10μM),N乙酰半胱氨酸(NAC)(1毫米)和内皮素(ET) 1单克隆抗体(mAb)(10μg·毫升−1)有效防止CSE-induced HPASMC增殖。b)血小板源生长因子(PDGF)在10 ng·毫升−1HPASMC扩散增加了3.1倍。在CSE 10%, PDGF (10 ng·毫升−1)HPASMC扩散增加3.5倍,被BOS(10μM)减毒,BQ123(10μM)和BQ788(10μM)。数据意味着±扫描电镜三个独立实验的条件。搞笑:免疫球蛋白。*:p < 0.05与各自的控制条件;#:p < 0.05相比,CSE组;¶:与CSE + PDGF组相比p < 0.05。
HPASMC接触CSE增加ET-1-induced (Ca2 +]我和细胞收缩
HPASMCs CSE受到急性暴露于10%增加10 nM ET-1-induced (Ca2 +]我平均±扫描电镜峰值为493±46与未经处理的细胞274±34海里(控制)(p < 0.05;图5和b),应用波生坦BQ788或BQ123添加CSE接触之前和期间减少急性ET-1-induced峰值增加(Ca2 +]我304±41,分别为395±36和343±32 nM (p < 0.05)与CSE孤独;图5和b)。ET-1 (10 nM)增加细胞收缩和在这些细胞暴露于更高CSE (10%)与未暴露的细胞(p < 0.05;图5度)。细胞与CSE预处理的应用波生坦的存在,BQ788或BQ123不太容易ET-1-induced细胞收缩,细胞收缩接近控制水平(图5度)。
香烟烟雾tslp肺动脉平滑肌细胞急性内皮素(ET) 1-induced胞内钙和细胞收缩。人类肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)被暴露于香烟烟雾提取物(CSE) 10%的存在与否,应用波生坦(BOS)(10μM), BQ123(10μM)或BQ778(10μM) 24 h·a, b)细胞被洗了三次与PBS和孵化fura-2 acetoxymethyl酯30分钟。然后,细胞被刺激与ET-1(10海里)。数据提出了摩尔细胞内自由钙离子浓度(Ca2 +]我)在12细胞实验中,共有四个实验条件。c)磁盘与培养HPASMCs被放置在显微镜和细胞成像具有亮照明。收缩反应的时间进程与ET-1 HPASMCs挑战(10海里)。总力的数据提出了细胞在总共6个细胞基质/条件。数据意味着±扫描电镜。*:p < 0.05与控制;#:p < 0.05与CSE。
CSE暴露增加ET-1-induced人类肺内的小动脉收缩,这是通过应用波生坦预防
展示肺片孵化与CSE显示增加等B蛋白表达,应用波生坦显著预防BQ788 BQ123,而CSE-induced等一个蛋白表达是预防应用波生坦和BQ123 (图6)。这些结果被免疫荧光实验定性复制(图6 b)。在这方面,CSE暴露增加了等B荧光强度在内皮细胞和smc。等一个荧光强度增强只有在smc的面积。应用波生坦展示肺片预处理与显示的荧光强度降低等B和等一个(图6 b)。展示肺片预处理的CSE增加血管ET-1敏感性为10%。计算日志EC50对CSE治疗组为-9.36±0.32与-8.47±0.16 M控制(p < 0.05;图6 c和d)。展示肺片暴露在应用波生坦,CSE BQ788或BQ123 ET-1日志EC的显著增加50-8.76±0.3,-8.73±0.17,-8.64±0.24 M,分别。CSE也增加了ET-1 E马克斯收缩与对照组(184±5.7与136±3.6;p < 0.05;图6 f),它被应用波生坦减毒,BQ788或BQ123预处理ET-1 E马克斯127.8±4.3,160.9±3.6,145.8±4.3,分别为(图6 f)。然而,吸烟和慢性阻塞性肺病患者的肺动脉显示增加等一个和等B蛋白表达与不抽烟的患者(p < 0.05;图7)。
吸烟增加内皮素受体A和B(等一个和等B分别)表达在人类肺内的小动脉,增加肺血管收缩,以应对严重的内皮素(ET) 1。小的人类肺内的展示片暴露在香烟烟雾提取物(CSE) 10%的存在与否,应用波生坦(BOS)(10μM), BQ123(10μM)或BQ788(10μM) 24 h)执行西方墨点法测量等一个和等B蛋白表达。b)展示片进行固定和免疫荧光等一个和等B若丹明二次抗体。内部弹性薄板弹性板(IEL)和外部(鳗鱼)评估绿色自体荧光。艾凡:内皮细胞;M:平滑肌细胞。酒吧= 100μm规模。c)代表图像的时间进程的人类小肺动脉收缩反应ET-1视频显微镜下可见。d-f)浓度ET-1收缩曲线在两片每共有三种不同的患者的条件条件。数据意味着±扫描电镜的a, b)三片和d-f)从三个病人每两片条件。电子商务50:half-maximal有效浓度;E马克斯:最大的药物效应。*:p < 0.05与控制;#:p < 0.05与CSE。
内皮素受体A和B(等一个和等B分别在肺动脉)是调节吸烟者和慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。肺动脉不吸烟者,吸烟和慢性阻塞性肺病患者仔细隔绝发表人类肺组织手术标本。总蛋白提取和探测等一个和等B抗体免疫印迹。结果代表的表达等一个,等。B和管家蛋白β-actin六不吸烟者,七吸烟者和八慢性阻塞性肺病患者。密度测量数据显示等一个和等B相对于β-actin蛋白表达和正常不抽烟的表情。数据意味着±扫描电镜每个病人的微免疫印迹。*:p < 0.05与不吸烟者。
讨论
的相关性研究是建立在两个主要的假设:1)慢性CS接触负责肺血管重塑和PH值在COPD恶化发展(17];和2)等系统直接与COPD患者的肺改造(18]。这项研究的结果表明,ETR对抗可能减弱CS-induced HPASMC核扩散和张力,以及肺内的小动脉张力,ETR和,差别等对这些应用波生坦因此暗示可能是有用的治疗某些形式的PH值与COPD吸烟,建议最近[19,20.]。此外,我们提供了一个新颖的机制所依赖的行动CS增加ETR表达式通过前馈机制介导ERK1/2 ET释放和激活,RhoA-GTP和细胞内ROS。所有这些细胞内途径被应用波生坦减毒。
是否适用于我们的结果在活的有机体内CS吸入取决于假设CS组件达到较小的肺动脉血管床的。一些观察加强这一假设。1)CS组件中迅速吸收到血液中吸烟(∼1分钟)21在气体交换表面),表明迅速平衡。2)许多烟组件高度水溶性,过氧硝酸盐等被认为是一种有效的改造剂在肺动脉22),允许容易解决进入肺泡衬里和组织液。3)呼吸气体交换已经证明在肺血管一样大3毫米23),这表明吸烟可能获得较小的肺动脉;我们所获得的细胞获得相同的结果,∼3毫米动脉在肺内的小动脉的直径100μm内部(展示肺片实验)。4)烟组件存在于血液循环数小时后吸烟(24),允许再循环期间持续暴露于肺血管床。
烟雾的浓度组件周围血管床是很难估计的。在这项研究中,我们使用CSE浓度为2.5 -10%,这可能相当于0.5曝光与吸烟有关2包/天,正如前面概述(25];因此,我们的实验可能估计吸烟习惯的生物学意义。
等系统似乎有很大影响肺血管重塑的发生和发展。事实上,呼出的气息凝结和循环ET-1水平在慢性阻塞性肺病患者的PH值增加,而两者都是与肺动脉收缩压(5]。此外,动物暴露在CS显示基底ET-1水平和血管收缩性的增加,这可能导致肺部病理生理学与CS (26]。最近的研究对大鼠动脉来自各种组织,如大脑、肠系膜和肾脏,得出结论,CSE移植等B和等一个表达的机制,这其中牵扯到的激活或磷酸化ERK1/2, p38,物,蛋白激酶(PK) C和NF-κB [9- - - - - -11]。然而,目前,没有数据的影响CS ETR表达人类肺动脉是可用的。在这项研究中,我们首次发现CSE-stimulated增加等B和等一个蛋白质和基因表达可以抵消了双重ETR拮抗剂应用波生坦的选择性等一个拮抗剂BQ123。相比之下,选择性等B拮抗剂BQ788唯一的预防等B超表达。这个过程是解释说,在某种程度上,通过前馈机制介导ET释放。在这方面,CSE能够提高上层清液等水平,因此抑制了应用波生坦和BQ123,在较小程度上,通过BQ788。这些结果显然是与先前的报道相比,应用波生坦BQ788和增加ET-1 mRNA在内皮细胞(27]。这种效应解释是因为细胞外水平ET-1被清除通过内吞作用的等B;因此,阻碍细胞外间隙ET-1封锁,诱导ET-1 upregulation。然而,在这项研究中观察到的结果获得完全不同的上下文的CSE暴露;CS增加内皮细胞ET释放和气道smc,正如前面提到的(28,29日]。在这项研究中,我们观察到在HPASMCs CS-induced ET释放是由一种机制包括活性氧生成,ERK1/2磷酸化和RhoA-GTP激活。同样的机制已经被我们小组还观察到在肺动脉内皮细胞(13]。因为阻塞ETR能够减弱CS-induced ROS, ERK1/2磷酸化和RhoA-GTP激活,它是合理的假设ETR对抗抑制CS-induced ET释放。
CSE, ET-1孵化也能移植等B和等一个在HPASMCs表达式,进而证实了类似的结果中观察到HPAECs [13]。由于内皮细胞ET-1的主要储层,可以假设一个CS ET-1增加内皮细胞,这可能与HPASMCs交互,增加ETR表达式。所以,直接影响的ET-1 CS-induced ETR超表达在HPASMCs不能统治。
有趣的是,ET-1刺激诱导更高等一个表达式比CSE (图1一个与图2 c)。因为等一个主要是由ET-1,可能认为BQ788防止CSE-induced ET的阳痿吗一个表达可能是由于其低影响CSE-induced ET释放。
众所周知,细胞内ROS可能激活几个细胞内途径,如PKC、不同MAPKs (如。ERK1/2 p38和物)和转录因子(如。NF-κB) [30.]。事实上,最近的报告显示,这些途径都参与CSE-induced等B和等一个表达鼠底动脉(9,10]。此外,CSE和ET-1激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶复杂生产细胞内ROS (31日,32]。有趣的是,CSE氧物种H2O2和ET-1-induced细胞内ROS介导的激活等一个,因为它已被证明,BQ123抑制在胎儿PASMCs [32]。在这项研究中,抗氧化剂南汽,应用波生坦和BQ123减毒CSE-induced ROS,等B和等一个超表达。相比之下,BQ788 ROS和ET的水平没有影响一个CSE引起的,所以这些结果可以解释,在一定程度上,影响CSE-induced BQ788的不足等一个表达式。然而,ERK1/2抑制剂PD98059足够防止CSE ET-1-induced等B和等一个表达式,它是符合先前的报道在动物模型9,11]。在这方面,应用波生坦,BQ123,某种程度上,BQ788阻止ERK1/2磷酸化,从而突出ERK1/2在CSE-induced ETR upregulation。
众所周知,吸烟和慢性阻塞性肺病患者显示的表达水平增加RhoA-GTP Rho-kinase下游因子,参与内皮功能障碍,血管收缩性和改造(33]。正如我们先前发现HPAECs [13),CSE上调RhoA-GTP活动的能力被应用波生坦预防,BQ123,在较小程度上,BQ788治疗。此外,Rho-kinase抑制剂Y23670防止CSE ET-1-induced等B和等一个upregulation,这其中牵扯到的RhoA-GTP激活过程中ETR表达式。
过程中肺血管重塑,PASMC增殖导致内膜的增厚。以前,研究呈正相关CS血管SMC增殖(34)涉及ERK1/2激活的机制。在这项研究中,我们观察到应用波生坦,BQ123 BQ788阻止HPASMC扩散过程中涉及这两种ETR形式。加上这个,HPASMC扩散激活介导的细胞内ROS, ERK1/2 Rho-kinase,以及通过自分泌等作用。
在其他实验,得出结论,CSE暴露显著增加急性ET-1-induced (Ca2 +]我和细胞收缩。进一步的研究显示,根据CSE-induced等一个和等B表达式,应用波生坦的抑制功效,BQ123和BQ788 CSE-derived结果。
基于这些在体外结果,我们试图翻译CSE的效果对人类肺内的小动脉的肺片,展示模型。众所周知,人类肺动脉血管重塑发生在小,resistant-type肺内的血管(< 3毫米)和pre-capillary动脉(内部直径∼20μm),形成肺血管床的一部分负责压力海拔在PH值(3]。在目前的研究中,展示肺片从肺内的小动脉中一个和等B在二级CSE暴露血管smc和内皮细胞。应用波生坦,在较小程度上,BQ123抑制ETR upregulation, BQ788只减毒等B在协议在体外电池数据。肺动脉收缩增加继发于急性ET-1是ETR upregulation的结果被应用波生坦和压制,在较小程度上,BQ123 B788。这些结果可能被视为一种近似模型在活的有机体内条件,因为我们发现孤立的吸烟者和慢性阻塞性肺病患者肺动脉移植等B和等一个。
尽管这部小说机械化的途径研究,我们意识到这项研究的局限性。首先,我们进行了一次在体外急性(24小时)模型CS曝光,但进步恶化人类诱导只有慢性肺血液动力学的CS接触多年。其次,在体外研究并不总是代表在活的有机体内公布的结果,因为许多物质是CS和抵消不同细胞类型在同一时间;因此,结果观察到孤立HPASMCs可能不同体内。第三,尽管我们已经发现ETR过度吸烟者和肺动脉的COPD患者,他们都没有显示PH值,所以慢性阻塞性肺病患者的PH值是否有ETR upregulation还是应用波生坦变弱ETR upregulation在活的有机体内仍然是未知的。
这项研究的结果表明,应用波生坦双重ETR拮抗剂有效减少ETR过度引起的CSE HPASMCs和小肺内的动脉。这种直接的抑制作用可以解释在某些形式的应用波生坦的有利影响COPD患者的不成比例的PH值。
确认
我们感激的宝贵帮助p . Banuls和a·塞拉诺(研究基金会的瓦伦西亚大学总医院,瓦伦西亚,西班牙)在获取和孤立HPASMCs。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项工作是saf2008赠款支持- 03113 (j . Cortijo) saf2009 - 08913 (E.J. Morcillo),和CIBERES (CB06/06/0027)从科学和创新部和健康研究所卡洛斯三世的西班牙政府和研究经费(Prometeo / 2008/045和新兴团体GE-029/10)从地区政府(“Generalitat Valenciana”)。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2011年2月4日。
- 接受2011年7月25日。
- ©2012人队