摘要
筛选手术切除的非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织和血清激活表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)突变未知。此外,比较精度不贵表皮生长因子受体突变试验、突变富集(ME)-PCR和高分辨率熔融(HRM)尚未确定。
我们分析了522例手术切除的I-IV期NSCLC的肺肿瘤DNA和64名受试者的匹配血清DNA表皮生长因子受体使用ME-PCR和HRM检测外显子19和21的突变。此外,97名受试者之前有表皮生长因子受体DNA测序数据可供比较。
ME-PCR和HRM检测表皮生长因子受体5%(522例中27例)的肿瘤样本中有突变。与DNA测序相比,ME-PCR的敏感性为100%,特异性为99%,HRM的敏感性和特异性为100%。六个科目表皮生长因子受体ME-PCR在3个样本中检测到突变,在2个样本中检测到HRM。在从不吸烟的研究对象中,那些患有表皮生长因子受体与野生型肿瘤相比,突变型肿瘤的生存率更低(30与49个月;p = 0.017)。
ME-PCR和HRM具有相似的检测精度表皮生长因子受体突变,但在切除的NSCLC中突变的预后影响值得进一步研究。
肺癌是一个全球性的健康问题,每年造成大约100万人死亡[1].非小细胞肺癌(non - small cell lung cancer, NSCLC)是最常见的组织学亚型,占肺癌诊断的80%。NSCLC的预后仍然很差,5年生存率为15%。即使在早期NSCLC (I期和II期),患者进行肿瘤手术切除后,I期NSCLC原发肿瘤复发的发生率为30-35% [2].基于铂的辅助化疗已被证明可以提高II期和IIIA期患者的生存率,但I期患者的获益存在争议[3.].
近年来,在晚期非小细胞肺癌中,表皮生长因子受体的引入(表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)(吉非替尼和厄洛替尼)已经证明了临床结果的改善,特别是在突变的受试者中表皮生长因子受体肿瘤(4- - - - - -6].其中,第19外显子(DEL)中包含亮氨酸747到谷氨酸749残基的15 bp缺失和第21外显子858 (L858R)密码子中精氨酸取代亮氨酸的点突变分别占NSCLC的44和41%表皮生长因子受体突变(7].这些突变与TKI反应有关,发生在酪氨酸激酶结构域的atp结合囊表皮生长因子受体被称为“激活”突变[8].但在筛选激活时表皮生长因子受体晚期非小细胞肺癌的突变具有重要的临床意义,该策略在接受手术切除的早期非小细胞肺癌受试者中的临床应用存在争议,研究结果相互矛盾。尽管一些研究尚未确定两者之间的关系表皮生长因子受体突变状态和总体生存[9- - - - - -13],其他人则认为在这些人中生存得更好表皮生长因子受体突变对象(6,14].此外,最近的研究表明,具有激活功能的受试者表皮生长因子受体突变可能从辅助化疗中获益,尽管并不显著[9,15].因此,评估筛查的效用是很重要的表皮生长因子受体由于激活突变的存在不仅可能决定预后,而且可能预测TKI的反应性,无论是辅助治疗还是肿瘤复发。
经典的检测方法表皮生长因子受体突变是二脱氧核苷酸测序。然而,将DNA测序用于常规检测受到了相对较高的成本以及对复杂设备和技术专业知识的需求的阻碍,而这些往往只有在专门的分子病理学实验室才能获得。此外,DNA测序不能用于精确检测表皮生长因子受体低肿瘤含量样本中突变等位基因含量<20%的突变[16].这将限制DNA测序测试的适用性表皮生长因子受体肿瘤复发等情况下的突变,获取肿瘤组织进行突变分析通常是一项挑战。因此,检测非小细胞肺癌受试者的血清样本进行突变分析的兴趣越来越大表皮生长因子受体突变(17].近年来,人们发展了新的分子方法来精确检测表皮生长因子受体非小细胞肺癌肿瘤组织和低肿瘤含量样本中的突变[16].这两种方法是突变体富集(ME)-PCR和高分辨率熔体(HRM)。ME-PCR利用限制性内切酶选择性消化野生型表皮生长因子受体等位基因,并放大突变等位基因[18].ME-PCR可以检测表皮生长因子受体组织和血清样本的突变[19].然而,ME-PCR需要人工处理,可能会出现假阳性结果。相反,人力资源管理不需要人工处理,因为它是一个封闭的管格式,比ME-PCR更有效率。HRM在肿瘤组织中具有>90%的敏感性和特异性[20.,但HRM在血清样本中的诊断准确性尚未得到评价。
在这项单中心回顾性研究中,我们评估了522例原发性非小细胞肺癌患者手术切除的肺肿瘤组织是否存在表皮生长因子受体19外显子DEL和21外显子的基因突变。我们还研究了匹配的血清样本,以确定ME-PCR和HRM检测的可行性表皮生长因子受体64个实验对象的突变。之间的关系表皮生长因子受体突变状态和临床病理因素,包括原发性非小细胞肺癌切除术后的总生存率,也进行了评估。
材料和方法
样品
从1992年至2009年期间向澳大利亚布里斯班查尔斯王子医院捐赠残余组织样本的受试者身上,获得了新鲜冷冻手术切除的肿瘤组织。只要有可能,就从受试者身上采集匹配的血液样本。从血液样本的血清中提取了DNA。这项研究得到了查尔斯王子医院和澳大利亚布里斯班昆士兰大学人类研究伦理委员会的批准。有关研究样本的更多细节请参阅在线补充材料。
稀释化验
稀释研究使用了美国组织细胞收集(Manassas, VA, USA)肺癌细胞系H1650和H1975,它们分别携带DEL和L858R突变[21].H1650和H1975 DNA与人类女性基因组DNA混合(Promega,悉尼,澳大利亚)(表皮生长因子受体野生型)50%、10%、5%、2.5%和0.5%稀释液。
ME-PCR化验
我们发现有必要优化原始ME-PCR检测[18]以适应我们实验室使用的设备、条件和试剂。EGFR外显子19 DEL实验包括PCR扩增和MseI酶切。采用atcccagaaggtgagaaagataaattc(正向引物,外显子19-S1)和CCTGAGGTTCAGAGCCATGGA(反向引物,外显子19-S1)进行PCR扩增。最终产品采用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,其中88-bp条带代表DEL等位基因,100-bp条带代表野生型等位基因。
表皮生长因子受体21外显子L858R实验分别采用两轮PCR扩增,中间穿插用MscI和Sau96I酶切步骤。采用CAGCCAGGAACGTACTGGTGA(正向引物,外显子21-S1)、CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT(正向引物,外显子21-S2)和TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT(反向引物,外显子21-AS1)进行PCR扩增。最终产品用4%琼脂糖凝胶电泳分析,99-bp条带代表L858R等位基因,130-bp条带代表野生型等位基因。在线补充材料中提供了该方法的更多细节以及对原始ME-PCR方法的修改。
人力资源管理分析
人力资源管理方法和引物改编自已发表的协议[20.]1.用于表皮生长因子受体外显子19正向为:GTGCATCGCTGGTAACATCCA;和反向:AAAGGTGGGCCTGAGGTTCA;和表皮生长因子受体外显子21正向:CCTCACAGCAGGGTCTTCTCTG;和反向:TGGCTGACCTAAAGCCACCTC。每个实验都是用表皮生长因子受体野生型对照(人类女性基因组DNA)和突变阳性对照样本。使用归一化和差异曲线来解释人力资源管理结果。显示与阳性对照相似的歪斜曲线的样本被认为含有突变。在线补充材料中提供了该方法的更多细节。
DNA测序
DNA测序的表皮生长因子受体522名研究对象中的97人(先前研究的一部分)有19和21外显子[11].分别对经ME-PCR或HRM鉴定的突变阳性样本进行DNA测序。双向测序在澳大利亚基因组研究中心(布里斯班,澳大利亚)使用HRM正向和反向引物进行。
统计分析
我们使用SPSS (Chicago, IL, USA)统计软件第17版进行分析。应用Fisher精确检验来评估两者之间的关系表皮生长因子受体突变状态及临床病理分类特征。双尾p值<0.05被认为有统计学意义。使用Kaplan-Meier法估计手术切除后5年的总生存时间,使用log-rank检验分析生存差异。
结果
学科特点
我们评估了522例切除的肺肿瘤样本和64例匹配的血清样本。共有345名男性和177名女性,487名吸烟者和35名不吸烟者。其中腺癌294例,鳞状细胞癌161例,大细胞癌32例,腺鳞癌35例。病理分期显示,259例(49%)为I期,140例(27%)为II期,108例(21%)为III期,15例(3%)为IV期。498名受试者报告非土著(推断为白种人)民族,6名受试者报告亚洲民族,2名受试者报告澳大利亚土著民族,16名受试者未报告他们的民族。研究对象的临床病理特征列于表1.
ME-PCR和HRM的稀释研究
我们通过连续稀释含有杂合子的细胞系DNA来评估ME-PCR和HRM的DEL和L858R突变等位基因检测阈值表皮生长因子受体野生型DNA突变(图1).对于ME-PCR, 50%、10%、5%、2.5%和0.5%稀释混合物中检测到DEL和L858R突变。使用HRM检测,DEL突变在50%和10%的突变等位基因频率中检测到,而不低于5%,L858R突变在50%、10%、5%和2.5%的突变等位基因频率中检测到,而不低于0.5%。
表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)外显子19 DEL和外显子21 L858R的高分辨率熔解分析(a和c)和突变富集PCR检测(b和d)表皮生长因子受体外显子19 DEL(H1650)和外显子21 L858R(H1975)与汇集的基因组DNA混合(表皮生长因子受体稀释50%,10%,5%,2.5%,0.5%和0%(野生型)稀释。a)高分辨率熔融分析获得的差异图中,50%和10%稀释样品中均含有DEL突变。b) 88 bp为外显子19 DEL突变等位基因,100 bp为野生型等位基因。在50%、10%、5%、2.5%和0.5%稀释剂中均能检测到19外显子DEL等位基因。c)高分辨率熔化分析得到的差异图中,50%、10%、5%和2.5%稀释样品中含有L858R突变。d) 99 bp条带为21外显子L858R突变等位基因,130 bp条带为野生型等位基因。在50%、10%、5%、2.5%和0.5%稀释剂中均可检测到21外显子L858R等位基因。
检测表皮生长因子受体肿瘤样本中的突变
在522个样本中,表皮生长因子受体27份(5%)样本经ME-PCR和HRM检测,其中23份为阳性表皮生长因子受体两种方法的突变均为阳性。此外,两种方法在基因突变方面是一致的表皮生长因子受体491个肿瘤样本中的野生型。
ME-PCR
ME-PCR检测到11个DEL突变和16个L858R突变(表2).在DEL突变样本中,DNA测序发现5份样本中有c.2235-2249 (p.E746-A750del), 2份样本中有p.L747-S752del, 1份样本中有p.L747-E749del, 3份样本中未检测到DEL突变。在16份L858R突变阳性的样本中,DNA测序鉴定出15份样本中的L858R,其中1份样本未检测到突变。
人力资源管理
HRM在9个样本中发现了外显子19 DEL突变,在18个样本中发现了外显子21突变(表2).在DEL阳性的样本中,DNA测序发现5份样本中有c.2235-2249 (p.E746-A750del), 2份样本中有p.L747-S752del, 1份样本中有p.L747-E749del, 1份样本中未检测到DEL突变。在21外显子突变阳性的样本中,DNA测序发现14个样本中有L858R, 1个样本中有L861Q, 1个样本中有R486K, 1个样本中有P848L, 1个样本中没有21外显子突变。
ME-PCR与HRM的比较
ME-PCR和HRM的诊断准确性是通过与97个样本的DNA测序结果进行比较来确定的表皮生长因子受体突变检出率为9%(97例中有9例)。ME-PCR的敏感性为100%,特异性为99%,HRM的敏感性和特异性为100%。
检测表皮生长因子受体血清中突变
在64名受试者中,表皮生长因子受体对匹配的肿瘤组织和血清进行突变检测。表皮生长因子受体在6个肿瘤样本中检测到突变(2个样本中检测到DEL, 4个样本中检测到L858R)表皮生长因子受体58份肿瘤样本中发现野生型。在两份DEL突变肿瘤样本的配对血清样本中,ME-PCR和HRM仅在其中一份样本中识别出DEL突变。在4份l858r阳性肿瘤样本中,ME-PCR在两份匹配的血清样本中检测到相应的突变,HRM仅在一份匹配的血清样本中检测到相应的突变(表3).
临床病理参数与生存分析
我们评估了肿瘤之间的关系表皮生长因子受体通过ME-PCR和HRM结合临床病理参数确定突变状态。表皮生长因子受体突变在不吸烟者中检测得更频繁与吸烟者(27%与3.5%;p < 0.001),女性与男性(10%与2.3%(p<0.001),腺癌组织学与non-adenocarcinoma组织学(7%与2.5%;p=0.039)和亚洲与非亚洲种族(33%与5%;p = 0.031)。
我们还检查了临床病理参数之间的关系,表皮生长因子受体术后5年的突变状态和总生存率。随访时间从手术切除日期开始计算。与生存率差异相关的两个变量是肿瘤分期(p<0.001)和分化(p=0.005)而腺癌和鳞状细胞癌组织学亚型之间(p=0.272)或<65岁和>65岁年龄组之间(p=0.837)的生存率没有差异(图1,在线补充材料)。与一直吸烟的人相比,从不吸烟的人有更好的生存趋势,但这种差异没有达到统计学意义(44个月)与39个月;p = 0.158)。中位生存时间表皮生长因子受体-突变的肿瘤是34个月,而与之相比的是45个月表皮生长因子受体野生型肿瘤;但差异无统计学意义(p=0.966) (图2).不,表皮生长因子受体与野生型状态(30个月)相比,突变状态与更差的生存有关与49个月;P =0.017)表皮生长因子受体突变型和野生型肿瘤(43个月)与39个月;p = 0.400) (图2).
原发性非小细胞肺癌手术切除后随访5年的Kaplan-Meier生存曲线(总n=522)。截尾值表示手术切除后仍活着的受试者最后一次已知的随访时间。a)野生型表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)肿瘤与突变体表皮生长因子受体肿瘤。b)不吸烟者与吸烟者。c)从不抽烟的突变体表皮生长因子受体肿瘤与不吸烟者与野生型表皮生长因子受体肿瘤。d)突变型吸烟者表皮生长因子受体和吸烟者与野生型表皮生长因子受体肿瘤。表皮生长因子受体不吸烟者的突变状态与显著的生存差异相关。p值来自log-rank检验。
讨论
目前,一个临床病理模型,即。肿瘤淋巴结转移(TNM)系统仍然是手术切除的NSCLC最可靠的预后预测指标[23].最近的分子NSCLC基因组研究为TNM预后模型提供了改进[24].然而,这些方法还没有被证明可以预测治疗反应性,也没有在前瞻性研究中得到验证。相反,确定表皮生长因子受体晚期NSCLC肿瘤突变状态可用于预测TKIs和标准化疗的反应,这一策略最近已在前瞻性临床研究中得到验证[4,5].而当代的临床实践包括筛查晚期非小细胞肺癌表皮生长因子受体突变后,采用类似做法处理手术切除的NSCLC患者的好处仍有待确定。
在手术切除的非小细胞肺癌患者和当前TKIs时代的管理中,一种方法可能是筛查表皮生长因子受体突变仅在原发恶性肿瘤复发的受试者。然而,这种策略意味着TKIs不会被用作辅助治疗,以防止原发性恶性肿瘤的复发。因此,它可能是更有益的筛查表皮生长因子受体在手术切除的肿瘤组织中的突变,以确定预后,并在那些有不良风险的受试者中使用辅助TKI或化疗,以改善他们的结果。在本研究中,我们发现当考虑所有手术切除的NSCLC患者时,表皮生长因子受体突变状态与总生存期无关。这与先前报告的数据一致[10,11,13].有趣的是,研究表明,在表皮生长因子受体手术切除后的突变受试者有相互矛盾的结果[6,14].而标志et al。[6]指出,在单因素和多因素分析中,术后5年的生存获益et al。[14]能够在术后3年而不是5年发现中位生存获益,在多变量分析而不是单变量分析中。在马克斯的研究中et al。[6]刘呢?et al。[14可能部分原因是,在患有慢性阻塞性肺疾病的人群中,从不吸烟的人所占比例更高表皮生长因子受体突变率分别为90%和47%,而在我们的研究中为35%。然而,我们也发现表皮生长因子受体突变状态与不吸烟者的预后差有关,但在吸烟者中没有。这一有趣的发现需要在一个更大的不吸烟者样本量的前瞻性研究中进行进一步的调查。如果验证有效,这一观察表明,这组受试者可能是辅助治疗的候选人表皮生长因子受体我们的发现与越来越多的证据相一致,即从不吸烟的肺癌患者的分子变化与吸烟的肺癌患者的分子变化特征不同[25]这在全球范围内具有重要的临床意义,因为全球25%的肺癌病例发生在从不吸烟的人群中[25].因此,筛选手术切除的非小细胞肺癌的不吸烟者表皮生长因子受体突变不仅可能影响预后,还可能有助于计划辅助治疗。
目前有几种执行方法表皮生长因子受体对非小细胞肺癌受试者样本进行突变测试,其中DNA测序是目前的金标准测试[16].然而,DNA测序的成本和技术挑战要求临床表皮生长因子受体突变检测只在一小部分非小细胞肺癌患者中进行。我们的研究表明ME-PCR和HRM是准确的,可以被认为是DNA测序检测的可行替代品表皮生长因子受体肿瘤组织的突变。这两种相对便宜的方法都可以用于常规临床检测表皮生长因子受体突变适用于所有NSCLC患者,特别是在资源匮乏的社区,那里的肺癌发病率正在增加[1].
的表皮生长因子受体我们研究队列中97例受试者的突变状态已有报道[11,其中9名(9.3%)被试为表皮生长因子受体突变阳性。频率上的差异表皮生长因子受体本次研究中97名受试者和522名受试者之间的突变率可以用早期研究中丰富的从不吸烟人群来解释(34%)与7%)。目前的研究更准确地反映了我们机构的一般非小细胞肺癌患者人群。在我们的澳大利亚中心,通过筛查现有的NSCLC切除病例,我们发现突变患病率为5%。这比早期研究报告的10-16%的突变略低[7,26,每一种都有不同的纳入标准。然而,我们的数据与这些其他研究一致,在不吸烟者(33%)、亚裔受试者(33%)、女性(10%)和腺癌组织学患者(7%)中观察到较高的突变频率。因此,相对较低的突变频率可能只是反映了我们研究对象中白人男性吸烟者的优势,他们占研究队列的64%,突变频率为2%。
在现实的临床情况下,用于分子检测的原发肿瘤组织的数量通常是有限的,因此,临床适用的检测应该也能够检测血液样本中的突变。血液中含有的游离DNA很可能是从坏死的肿瘤细胞和/或循环的肿瘤细胞中释放出来的。最近的研究发现表皮生长因子受体NSCLC受试者血清中的突变也可预测TKIs的反应性[27].在我们的研究中,六分之二的受试者HRM也能够在血清和肿瘤组织中检测到相同的突变。ME-PCR证实了两份血清样本的结果。这一发现表明,类似于ME-PCR [19]人力资源管理也可能是一个有用的筛选测试表皮生长因子受体血清样本突变。筛选血清的作用表皮生长因子受体手术切除的NSCLC受试者通常有足够的肿瘤组织可用于突变检测,其突变可能用于检测复发或残留疾病,并监测患者对TKIs辅助治疗的反应表皮生长因子受体mutation-positive肿瘤。
在我们的研究中,我们只筛选了最常见的激活表皮生长因子受体突变,即。德尔和L858R。有越来越多的表皮生长因子受体与DEL和L858R突变相比,NSCLC突变的频率要低得多[28].筛选试验的目的是只检测已知的突变,而DNA测序可以检测已知和未知的突变。由于我们只筛查了最常见的激活突变,可以想象,我们忽略了其他突变,尽管不太常见,但这些突变可能对手术切除的NSCLC有预后影响。我们研究的另一个缺点是血清和肿瘤组织匹配的受试者比例太小(12%)。这限制了我们对ME-PCR和HRM检测的可靠性和准确性做出明确结论的能力表皮生长因子受体血清样本突变。我们正在通过修改我们的生物库收集协议来克服这一限制,以确保从所有接受手术切除的NSCLC患者中收集匹配的血清。
总之,我们的研究表明,虽然激活的存在表皮生长因子受体突变在吸烟者中不具有预后,它与手术切除的非小细胞肺癌患者中不吸烟者的生存更差有关。还需要进行验证性研究,特别是在一大批从不吸烟的受试者中。因此,我们计划进行大规模的前瞻性筛选表皮生长因子受体突变在手术切除的NSCLC中,包括从不吸烟者和吸烟者,以验证我们目前的研究结果。我们也证明ME-PCR和HRM是可靠的替代DNA测序检测激活表皮生长因子受体肿瘤组织的突变。此外,HRM可以与ME-PCR相媲美,ME-PCR是一种高灵敏度的检测方法表皮生长因子受体组织和血清突变。由于ME-PCR和HRM都是技术简单、高通量的方法,因此可以方便地在大多数病理实验室建立,从而使表皮生长因子受体突变检测比DNA测序更容易应用于临床实践。这种策略将使廉价的常规检测成为可能表皮生长因子受体在手术切除和晚期NSCLC患者中均存在突变,并将有助于提供个性化的癌症预后和治疗计划。
致谢
作者要感谢A. Dobrovic和H. Do(澳大利亚墨尔本Peter MacCallum癌症研究所)提供了H1650和H1975细胞系DNA,感谢澳大利亚布里斯班查尔斯王子医院的患者参与了这项研究,感谢查尔斯王子医院的外科医生、病理学家,科学家和胸科研究实验室人员协助标本采集。
脚注
这篇文章有在线补充材料可从www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项研究得到了以下支持:NH&MRC和昆士兰智能州项目拨款;NH&MRC医学研究生奖学金(K.B. Sriram), NH&MRC执业医师奖学金(K.M. Fong), NH&MRC职业发展奖(I.A. Yang), NH&MRC生物医学奖学金(S.M. Savarimuthu和C.M. Wright),昆士兰癌症委员会高级研究奖学金(K.M. Fong),昆士兰临床研究奖学金(方国明和杨思安)和查尔斯王子医院基金会。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2010年12月9日。
- 接受2011年2月8日。
- ©2011人队