摘要
弹性蛋白肽从受损的肺中释放可能是自身免疫性肺病的一个机制。吸烟者可形成瓜氨酸化和抗瓜氨酸蛋白抗体,但吸烟在与肺部疾病相关的自身抗体生成中的作用尚不清楚。
257名α受试者检测了抗弹性蛋白、抗环瓜氨酸肽(抗ccp)和抗突变瓜氨酸波形蛋白(抗mcv)抗体1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD), 113例慢性阻塞性肺病(COPD)患者和22例健康非吸烟者。根据表型特征和烟雾暴露进行组间水平比较。
抗弹性蛋白抗体在对照组中高于AATD (p = 0.008)和普通COPD (p<0.00001),在AATD中高于普通COPD (p<0.00001)。抗弹性蛋白水平在10包年出现阈值,吸烟较少的人的阈值更高(p = 0.004)。调整烟雾暴露后,没有发现抗体水平与临床表型之间的关系。抗ccp抗体在普通COPD中高于AATD (p = 0.002),但与吸烟暴露的关系不太清楚。
接触烟雾是抗弹性蛋白抗体水平的主要决定因素,在10包年后下降。局部抗体复合物可能是一个更好的衡量弹性蛋白定向自身免疫比循环水平。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制的蛋白酶-抗蛋白酶假说涉及消化肺实质中弹性蛋白和细胞外基质其他成分的蛋白酶与保护肺实质的抗蛋白酶之间的失衡1- - - - - -2.这一理论的起源来自于对α患者的观察1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)会导致早期肺气肿3..α1-抗胰蛋白酶(AAT)是一种抗蛋白酶,主要作用是阻断中性粒细胞弹性蛋白酶的作用,中性粒细胞释放的蛋白酶。中性粒细胞弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,是COPD中重要的三类蛋白酶中的第一种。其余两类是半胱氨酸蛋白酶,如组织蛋白酶- b和基质金属蛋白酶(MMPs)。4.一般来说,丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶能够降解弹性蛋白和某些形式的胶原蛋白4,而基质金属蛋白酶对胶原蛋白、明胶和层粘连蛋白的影响更大2,所有这些都是肺细胞外基质的组成部分。
肺中细胞外基质,特别是弹性蛋白的分解是COPD和AATD的一个关键特征,这可以通过存在高水平的弹性蛋白分解产物来证明。软氨酸交联是弹性蛋白所特有的,可用作其降解的标志5.COPD患者血浆、尿液和痰中脂氨酸和弹性蛋白肽升高6,而尿水平与用力呼气量在1 s内的年下降率(FEV)呈正相关1)吸烟的人7.一般来说,在一定吸烟水平下,弹性蛋白分解在AATD患者中更大,因为肺中中性粒细胞弹性蛋白酶活性相对过量8,与普通COPD患者相比,证实为桥氨酸水平升高6.弹性蛋白分解被认为是产生针对弹性蛋白的自身抗体的一种机制,这种抗体在理论上可以延续和/或加重肺破坏9.在AATD和COPD中,弹性蛋白分解的主要刺激因素是吸烟,但迄今为止对这些情况下抗弹性蛋白抗体流行率的研究还太小,无法充分评估吸烟对抗体水平的影响9- - - - - -11.尽管在COPD中循环抗弹性蛋白抗体的原始报告能够显示肺组织产生抗体,以及外周血对弹性蛋白肽的反应与计算机断层扫描(CT)肺气肿严重程度之间的相关性9,抗弹性蛋白抗体在肺中的作用仍不确定。
值得注意的是,正如最近的一篇综述所讨论的那样,吸烟本身是自身免疫的一个危险因素12.在一些自身免疫性疾病中,这已在流行病学水平上被注意到,现在有生物学证据表明,烟雾对类风湿关节炎诊断抗体的直接影响,称为抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)。瓜氨酸化是一种蛋白质的翻译后修饰,发生在炎症性疾病中13.它被认为发生在吸烟者的肺中,并被认为影响针对瓜氨酸蛋白的抗体的发生14.两种主要的acpa被识别,抗环瓜氨酸肽(抗ccp)和抗突变瓜氨酸波形蛋白(抗mcv)抗体。两者都是类风湿性关节炎疾病严重程度的标志15,16有迹象表明它们更多发生在关节外疾病中17特别是肺部疾病18.我们推测肺瓜氨酸化可能是COPD中产生自身抗体的相关过程,同时还有弹性蛋白释放。
我们假设,抗弹性蛋白和ACPAs在吸烟较多的受试者中更高,并且由于过度的弹性蛋白分解,抗弹性蛋白抗体在AATD中高于COPD。
方法
受试者和临床表型
AATD
研究了257名来自英国国家AATD登记处的PiZZ受试者,这是研究时可用的基线血清样本的数量。该项目经当地研究伦理委员会批准,所有受试者均知情同意。所有AATD受试者均有完整的临床病史(包括烟雾暴露),血清AAT水平<11 μM,特异性PCR确认PiZZ基因型(遗传性实验室,盐湖城,UT,美国),并进行了完整的肺功能测试,如前文所述19.没有人接受过AAT替代治疗。
慢性阻塞性肺病
西米德兰兹COPD收集(WMCC)包括COPD患者,不包括AATD患者,定义为FEV1/用力肺活量(FVC) <0.7和支气管扩张后FEV1低于80%的预测,在英国中部地区招募。WMCC的临床表型和遗传风险研究已获得当地伦理委员会的批准。WMCC的所有受试者均以与AATD组相同的方式进行肺功能检测和临床病史收集。在数据收集时,有116名受试者在WMCC注册,他们都给予了知情同意。
健康不吸烟
对照组由22名肺功能测试正常的健康非吸烟者组成,其中排除了AATD,有一个储存的血清样本,并同意参与研究。
抗体水平
使用Lee发表的方法测定血清中的抗弹性蛋白抗体et al。9所有AATD和COPD患者。原始出版物测量血浆中的抗体;因此,通过测定10个人在同一时间点的血清和血浆样本中的抗体,证实了血清中测定方法的有效性;两种样本类型间滴度无差异(p = 0.841)。连续稀释汇集的血清样本,以制作标准曲线和IU·mL−1对于由此计算出的受试者样本。在工作范围内的分析间变异系数为8.30%(单个受试者n = 20次重复)。spike回收率为87.34%,当使用对照抗体时,抗人免疫球蛋白(Ig)G检测的特异性为零。
使用商用ELISA试剂盒(适用于两种样本类型)检测血清或血浆中的ACPA抗体,用于抗ccp和抗mcv抗体(Phadia UniCAP系统;Phadia Ltd, Milton Keynes,英国和Orgentec Diagnostika GmbH,美因茨,德国)。这些是临床验证的测试,阳性阈值为10 IU·mL−120 IU·mL−1,分别。
统计分析
数据分析使用SPSS 16.0版(SPSS公司,芝加哥,伊利诺伊州,美国)。采用Mann-Whitney和Kruskal-Wallis试验比较各组间抗体水平。各组内抗体水平的比较首先作为单变量模型进行分析,根据数据的分布,对连续变量使用皮尔逊和斯皮尔曼的秩相关,对二元结果使用未配对t检验和曼-惠特尼检验,对频率变量使用卡方检验。使用疾病组回归模型的系数进行烟雾暴露的调整,以寻求抗体水平的预测因素。
结果
受试者特点
这三个群体的特征显示在表1.COPD患者通常比AATD患者年龄更大,吸烟更多(均p<0.001),这与已知的疾病特征一致。与AATD组相比,常规COPD组当前吸烟者更多(p<0.001),气体转移更低(p = 0.02),慢性支气管炎更常见(p<0.001)。鉴于扫描比例的差异,AATD和COPD肺气肿频率差异的显著性检验被认为无效。
抗弹性蛋白抗体水平及其关联
257例AATD患者、22例健康患者和116例COPD患者中113例均检测到抗弹性蛋白抗体。健康受试者的平均水平显著高于COPD (p = 0.00001)和AATD患者(p = 0.008)。AATD水平高于正常COPD (p<0.00001)图1.在该组未患COPD的患者中,AATD水平较高(p = 0.032;图2).
在AATD范围内,抗弹性蛋白抗体与吸烟pack-yrs呈负相关(r = -0.199, p = 0.001),尽管从视觉上看,这种关系并不呈线性(图3).因此,我们根据吸烟包年进行了分类,并在10包年显示了一个明确的阈值,超过这个阈值抗体就会降低(图3, p = 0.004)。与此相一致的是,从不吸烟者的平均水平显著高于吸烟人群(51.14±13.05)与27.04±5.21;P = 0.04)。与FEV呈正相关1可见(r = 0.189, p = 0.005),而对pack-yrs烟熏进行校正后(r = 0.084, p = 0.251)消失。无肺气肿者有升高趋势(51.12±17.33)与29.30±6.06;P = 0.074)也在类似的调整后丢失(P = 0.622)。AATD中未调整的相关性似乎是由从不吸烟者驱动的,实际上,在所有个体都吸烟的普通COPD中,抗体水平与包年或FEV之间没有关系1可见(均p>0.25)。由于CT扫描比例低,通常COPD患者不进行肺气肿分析。
然后比较各组间抗弹性蛋白抗体水平调整后的吸烟时间;AATD与普通COPD的差异消失(p = 0.258)。当只包括呼吸计诊断为COPD的AATD患者时,这种关系仍然缺乏(p = 0.131)。所有其他组间抗体水平比较在调整烟雾暴露后变得不显著(所有p>0.6)。然后将患有AATD且无COPD证据的从不吸烟者(n = 24)与没有AATD的健康从不吸烟者(n = 22)进行比较,以确定AATD本身是否是吸烟暴露和COPD对照后抗体水平的显著决定因素;两组抗弹性蛋白抗体水平无差异(p = 0.295)。
当前的与既往吸烟史两组抗体水平无显著差异(均p>0.5)。最后一次接触香烟的时间与抗体水平无关,开始吸烟时的年龄也与抗体水平无关(两者均为p>0.5)。在AATD或普通COPD中,抗体水平与性别或年龄无关,性别分层与pack-yrs的关系未见改变(男性r = -0.208, p = 0.014,女性r = -0.255, p = 0.018)。
ACPA协会
抗ccp抗体在正常COPD中高于AATD (p = 0.002,图4),并且在8名AATD受试者和6名普通COPD患者中超过了常规临界值。34例AATD患者抗mcv抗体阳性,20例正常COPD患者抗mcv抗体阳性;两组间无差异(p = 0.876,图4).AATD组与对照组的ACPA均无差异(p = 0.412)。在AATD中,ACPA与FEV均无相关性1(抗ccp:高水平p = 0.608,连续变量p = 0.868;anti-MCV: p = 0.710, p = 0.864)。同样,在通常的COPD中,两种ACPA都与FEV无关1(反ccp: p = 0.424和0.969;抗mcv: p = 0.957和0.406)。两组中均未见年龄或性别相关性(均p>0.5)。在性别亚分层分析中,与FEV关系不大1坚持(所有p>0.6)。
在AATD中,从不吸烟的人和接触过烟雾的人的抗ccp抗体和抗mcv抗体都没有差异(p = 0.903),因为所有受试者都吸烟,所以在普通COPD中不能进行这项测试。无线性剂量-反应关系(pack-yrs与AATD中存在ACPA (anti-CCP: r = 0.002, p = 0.979;抗mcv: r = -0.069, p = 0.301)或普通COPD(抗ccp: r = -0.158, p = 0.161;anti-MCV: r = -0.024, p = 0.864)。然而,在AATD中,与之前一样,将其划分为包年类别时,阈值在10包年是明显的,尽管没有抗弹性蛋白抗体的阈值明显(图5).然而,10包-年阈值两侧的滴度差异不显著(抗ccp, p = 0.661;抗mcv, p = 0.110), ACPA阳性发生率在此阈值上下无差异(p = 0.761和0.503)。由于没有观察到与烟雾的关系,在调整烟雾暴露后,没有进行进一步的组间比较。
由于ACPA是类风湿关节炎的诊断,因此在所有ACPA阳性的患者中确定了类风湿关节炎和其他自身免疫性疾病的发病率。在36名至少有一项ACPA阳性的AATD受试者中,没有人在基线或随访期间患有类风湿关节炎(自血清采集以来的平均随访时间为9年)。然而,4例在基线时患有自身免疫性甲状腺疾病,1例在基线时患有溃疡性结肠炎,另有1例在随访期间出现溃疡性结肠炎。在22例ACPA阳性COPD患者中,3例患有类风湿性关节炎。到目前为止,没有人完成了1年的随访。
讨论
本文提供的数据表明,循环抗弹性蛋白抗体水平与吸烟暴露之间存在明确的关系,而考虑吸烟后这些抗体与临床表型之间没有关系。相反,ACPA在理论上是在接触烟雾后产生的,在我们的队列中没有显示出任何显著的关系,组间差异也不太明显。
此前有一项研究报道COPD患者抗弹性蛋白抗体水平较高9我们无法证实这一说法。本研究涉及一组肺气肿患者,因此,如果我们希望证实他们的发现,我们的分析应该仅限于ct证实的肺气肿患者。我们没有排除没有扫描或没有肺气肿的受试者,因为我们的主要目标是比较弹性蛋白分解可能有所不同的组之间的水平6,并反对烟雾暴露,不复制李的作品et al。9.然而,比较有和没有肺气肿的AATD患者之间抗体滴度的二次分析没有显示出显著差异。值得注意的是,李所看到的滴度差异et al。9这一观察结果只是他们研究的一小部分,他们更具体地检查了抗弹性蛋白自身免疫,使用肺组织评估抗弹性蛋白抗体复合物,以及t细胞对弹性蛋白肽的反应。我们的结果与他们的结果直接相反,显示抗弹性蛋白抗体在肺功能较好的人和健康的个体中更高。这意味着循环抗弹性蛋白抗体的存在和水平不是COPD的关键特征,最近在另一项研究中报道了一项观察结果11,甚至可能随着疾病的发展而下降。我们假设,这可能是由于持续或增加的抗体消耗结合在肺部。这与Lee在肺组织中发现的抗体增加是一致的et al。9,尽管需要对肺组织和循环样本进行纵向研究才能明确回答这个问题。抗体水平不会随着吸烟的停止而上升,这与在此之后看到的COPD炎症和肺损伤的持续一致,在许多受试者中,疾病进展是可测量的20..
迄今为止,在有关抗体水平的分析中,没有一项抗弹性蛋白抗体的研究将吸烟的影响考虑在内,尽管有理论认为,抗弹性蛋白抗体的产生是继发于吸烟诱导的肺部弹性蛋白释放9.这里提供的数据表明,在AATD中,吸烟者和从未吸烟的人抗弹性蛋白抗体水平存在明显差异,吸烟包年与抗体水平之间存在关系。还有一个明显的烟雾暴露阈值水平,这是最近在另一个大型AATD受试者队列中发现的特征,这有助于他们对FEV的预测模型121.吸烟暴露在AATD中很常见,在普通COPD中较高,而在对照组中不存在,因此组间抗体水平的比较(最初看起来非常显著)需要对这种暴露进行调整。经过这样的调整,不仅是与FEV的关系1在AATD中丢失,但所有组间比较也不再显著。再加上最近的研究表明,吸烟可能是自身免疫的一个危险因素12在未来对COPD和对照人群中其他自身抗体患病率的研究中,值得注意的是。患有AATD的受试者可能对其他环境对肺功能的影响更敏感,如该组室外空气污染与肺功能之间的关系所示22.我们推测,由于这个原因,在患有和不患有AATD的非吸烟者之间,弹性蛋白分解和随后的抗弹性蛋白生成可能仍然存在差异。这一结论尚未得到证实,可能是因为在两组中,除香烟烟雾外,其他因素的影响都较小22,23.
虽然ACPA滴度在COPD、AATD和对照组之间存在差异,但差异不如抗弹性蛋白抗体明显,与吸烟暴露的关系也不明显。据我们所知,这是这些抗体在肺部疾病中的首次研究,我们的发现还需要进一步验证;然而,考虑它们的意义是有趣的。ACPA在类风湿关节炎中的致病作用被认为与补体活化有关24以及关节内t细胞的变化25,从而产生对自我的反应。我们的数据表明,这可能是器官特异性的,只发生在关节,尽管任何含有瓜氨酸的蛋白质都可能是ACPA的靶点。另外,对滑膜的影响可能取决于进一步的遗传或环境影响,考虑到ACPA阳性个体并不总是表现出类风湿关节炎(或其他自身免疫性疾病)。共享的表位等位基因,包含在人类白细胞抗原系统的第II类(HLA-DRB1*04, *01和*10)对于确定类风湿关节炎的风险很重要26和ACPA状态27.最近的数据表明,在这些等位基因存在的情况下,吸烟是决定acpa阳性疾病风险的关键特征27,28,与这一假设相一致。ACPA可在类风湿性关节炎临床特征出现前10年发生29,滴度与诊断前时间成反比30.这样,高阳性的人很可能很快就会被诊断出来。因此,随访队列中阳性个体很重要,特别是因为抗ccp抗体阳性的发生率超过了健康对照组的报告29AATD是5倍,COPD是8倍。然而,大多数AATD受试者自基线评估和采血以来已随访>8年,因此不太可能在该组中发现许多新病例。在通常的COPD队列中,高ACPA水平比AATD更常见,在两组中都比一般人群更常见。直观地,吸烟在确定肺瓜氨酸化中的作用14,以及随后形成的抗体,可能被认为是罪魁祸首。然而,我们的数据再次表明,在AATD中,重度吸烟者的ACPA水平较低,尽管在统计学上没有差异。由于ACPA水平在终生缺乏烟雾暴露时没有显著的剂量-反应效应调整,因此无法进行分析以确定在调整这一特征后AATD、COPD和健康个体之间的差异是否仍然存在。为了进一步澄清这一问题,可能需要进行更大规模的研究。还需要进一步研究吸烟者瓜氨酸化,以阐明抗体产生的机制及其与ACPA的关系。
自身免疫是当前COPD发病机制中争论的一个话题,因为存在一些自身免疫的特征。首先,肺部发生淋巴细胞浸润,肺部CD4+和CD8+ t细胞数量增加与疾病恶化相关31,32.肺上皮自身抗体也已证实33.此外,肺中的寡克隆t细胞群已被证实,这表明由于抗原刺激而积累34.来自动物模型的证据也支持自身免疫在COPD中的作用。具体来说,来自肺气肿大鼠的致病性CD4+ t细胞和抗内皮细胞抗体的转移导致健康动物肺气肿的发展35注射了弹性蛋白肽的小鼠产生了抗弹性蛋白抗体和支气管肺泡灌洗液,与COPD中看到的情况类似36,37.Lee首次报告抗弹性蛋白抗体升高et al。9现在已经被两个小型研究(除了这里提供的数据)驳斥了,这是混合疾病队列中的第一个研究10第二种是纯疾病队列,但两种队列的数量都很少11.事实上,在后一项研究中,作者注意到健康受试者的抗体水平更高,这与我们在这里报告的数据一致。自身免疫过程通常被认为在女性受试者中更常见,因此我们进行了一些性别特异性分析,但同样没有发现差异。综上所述,这些结果表明抗弹性蛋白抗体不太可能是COPD中有用的疾病标志物,如果存在针对弹性蛋白的自身免疫,那么循环抗弹性蛋白抗体滴度可能不如肺组织中的局部水平重要。
我们的研究由于缺乏健康吸烟组与通常的COPD组进行比较而被削弱,尽管在AATD中对健康个体和肺部疾病患者(控制吸烟)的比较可以作为这方面的合适替代。我们也没有测试抗弹性蛋白的IgM, IgA和其他抗体亚型。之前的一个小组研究了这个特征,他们的发现与我们的组间比较一致,因此我们认为没有必要重复他们的实验11.
综上所述,我们的数据显示,吸烟暴露与抗弹性蛋白抗体水平之间存在明显的关系,在对这一特征进行调整后,AATD、COPD与健康个体之间没有差异。这表明循环抗弹性蛋白水平不能用作疾病标志物,未来对自身免疫假说的研究可能需要针对肺组织中的抗体复合物,而不是循环抗体。
致谢
我们要感谢英国的所有成员1-抗胰蛋白酶缺乏症登记和西米德兰兹COPD收集调查小组收集临床数据和生物样本,以及D. DeMeo (Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, USA)在统计分析方面的建议。
脚注
支持声明
我们要感谢Talecris Biotherapeutics,他们对R.A. Stockley的无限制资助资助了这项工作。
权益声明书
R.A.斯托克利和研究本身的兴趣声明可以在www.ers.ersjournals.com/site/misc/statements.xhtml
- 收到了2010年3月3日。
- 接受2010年5月4日。
- ©2011人队