抽象的
我们假设与人和小鼠之间的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白质混合物比较可能导致机械洞察,以在每种物种中进化的常见和发散的途径。
来自4个人和6只小鼠的BALF分别汇集,并进行相同的散弹蛋白质组学分析。功能和网络分析被用于识别在BALF中富集的重叠和不同的通路。对未合并BALF样本进行了Western分析的后续实验。
我们在小鼠BALF样品中鉴定了91名独特的蛋白质和117个独特的蛋白质。蛋白质的功能分析揭示了物种之间若干关键过程的保护,包括防御反应。然而,氧化应激反应仅在小鼠BALF中选择性地富集。在正常人和小鼠BALF和肺损伤模型之间证实了过氧化毒素-1的表达,防止氧化损伤的关键构件的差异。
小鼠和人类BALF的计算蛋白质组学方法证实了免疫和防御介导的途径的守恒,同时突出响应氧化应激的差异。这些观察结果表明,使用小鼠模型来研究人肺障碍,应欣赏分类的变异性。
小鼠是研究人类疾病的最常见的哺乳动物物种,包括肺病。然而,基于肺病的小鼠模型的有希望的发现通常不能转化为随访人类研究中的有效治疗靶标。由于小鼠和人类分歧超过9000万岁,因此,由于每个物种适应不同环境挑战和暴露的每种物种,他们的呼吸系统之间可能会积累显着的差异差异1-3..肺部中的功能和生理分歧可以部分地叙述使用鼠标时遇到的困难,作为人类呼吸系统障碍的模型。
哺乳动物肺泡的巨大表面积由薄的液体衬里,保持空位的结构完整性,参与气体交换,并作为保护宿主免受环境和传染性侮辱的关键障碍。肺泡上皮衬里流体是磷脂,中性脂质和蛋白质的复杂混合物,其衍生自驻留电池(包括1型和2型肺细胞,肺泡巨噬细胞,肺泡巨噬细胞),并通过从等离子体的主动和被动运输4..在许多人类肺紊乱中发生支气管肺泡液组分的深刻改变,促使对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行诊断和预后目的的广泛分析并阐明疾病机制。我们和其他人以前研究过各种肺病患者的人类Balf蛋白质组5.-9..最近,我们对正常人BALF进行了散弹蛋白质组学分析,发现尽管在检测特定蛋白的个体间存在差异,但在健康受试者中,这些蛋白的功能富集存在广泛的重叠10..
在这项研究中,我们通过最初评估人和小鼠之间的BALF中的复合蛋白混合物是否可以导致在每种物种中进化的常见和发散途径的机械洞察力的全球比较来扩展我们以前的工作。接下来,使用西方分析,我们证明小鼠BALF中富集途径的候选成员的表达水平相对于正常人类BALF水平增加,但在急性肺损后遵循物种特异性表达模式。
材料和方法
BALF样品收集和处理
正常人的BALF.
收集人类BALF的议定书由华盛顿大学,美国西雅图大学的机构审查委员会批准。在入学之前,从每项健康的非莫斯文主题获得书面知情同意书。合并来自四个男性受试者的样品并分析。如前所述进行支气管肺泡灌洗11..简而言之,将五个单独的30ml等分试样为0.89%无菌盐水滴入右侧叶或凌关。将BALF立即离心,并将无细胞上清液等分并储存在-80℃。
急性肺损伤BALF
本研究批准了华盛顿大学的机构审查委员会。BALF是从7名急性肺损伤患者获得的,定义为:1)动脉氧气张力(P.A,O.2/ /吸气氧气分数(F阿,我2<300 mmhg;2)弥漫性实质渗透;3)肺动脉楔形压力<18 mmHg或无临床证据具有充血性心力衰竭;4)对这些发现没有其他明显的解释12.在经支气管镜检查的患者中,基于FAGAN的方案评估临床疑似呼吸机相关肺炎的患者等等。13..患者特征包括:四个男性,三个女性,平均值±sd年龄55±10 YRS,支气管镜检查前的呼吸机上的天数10±8;P.A,O.2/F阿,我2183±59 mmhg。在支气管镜检查之后,将样品立即运输到微生物学实验室,其中除去5mL以进行微生物学分析,如上所述处理剩余的样品。
常规鼠标巴尔
所有的动物实验都是由华盛顿大学动物护理和使用委员会批准的。将正常成年雄性C57BL/6小鼠(n = 6)灌胃1ml含0.6 mM EDTA的PBS,加热至37℃。BALF收集后立即离心,无细胞上清液加入聚丙烯管中,在进行蛋白质组学分析前保存在-80°C。用Bradford测定法对所有样品的上清液等量进行总蛋白测定14..
霰弹枪蛋白质组学分析
通过二维液相色谱法降低,烷基化,综指消化和分离,然后使用二维液相色谱分离,然后串联质谱分析(LC-MS / MS)(图1⇓).使用续集的搜索引擎鉴定BALF蛋白,然后鉴定肽前提和蛋白质分子。霰弹枪蛋白质组学方法的细节可用于补充材料。
![图。1-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/6/1388/F1.medium.gif)
小鼠和人支气管肺泡灌洗液(BALF)的散弹蛋白质组学分析概述。2D LC:二维液相色谱;MS:质谱分析。
样品制备
将每个细胞的BALF上清液样品的相同体积用8M尿素进行变性,并通过加入5mM Tris(2-羧乙基)盐酸盐而减少。使用1:20 w / w胰蛋白酶 - 蛋白质比例进行蛋白水解16小时,然后用微型旋转盒(Nest Group Inc.,Southborough,Ma,USA)脱盐,并使用速度vac完全干燥(热奉献,米尔福德,马,美国)。
LC-MS / MS分析
通过LC-MS / MS分析每个样品的等于样品浓度通过如前所述,电热喷雾器电离为线性离子阱四极(LTQ)傅里叶变换(FT)离子回旋谐振质谱仪15..LTQ-FT质谱仪以数据相关模式操作。在线性离子阱中依次分离出五种最强烈的离子,并使用动态排除的陷阱目标值为5,000和60秒,串联串联碰撞诱导的解离。在整个中选择前体离子m / z.范围(350-2,000)。然后,使用气相分数重复实验(例如在有限的有限内选择前体离子m / z.每次注射期间的范围)。以下六m / z.采用范围:350-550,500-700,650-850,800-1,000,950-1,500和1,450-2,000。
蛋白质识别
串联质谱RAW (ThermoFinnigan, Waltham, MA, USA)文件首先被转换为mzXML格式16..串联质谱与IPI人类和小鼠数据库(欧洲生物信息学研究所,Hinxton, UK;www.ebi.ac.uk/ipi.)使用续集。将肽串联质谱与肽序列匹配的标准是:Xcorr> 1.9,充电状态1+,Xcorr> 2.2,具有充电状态2+,或具有充电状态3+的Xcorr> 3.75,以及ΔCn> 0.1。通过这些标准的肽串联质谱用于蛋白质鉴定。仅当蛋白质分子概率> 0.8时才认为蛋白质17.如果针对每种蛋白质发现了多于一个独特的肽。
功能和网络分析
相对于其各自的全局蛋白质确定了每种物种的BALF蛋白质组中的生物模块的富集,其基于其已知的基因组定义并使用Entrez基因鉴定注释(www.ncbi.nlm.nih.gov /可以/)1那10..我们使用了基于web的注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)实现。18.和gotree机器19.基于基因本体(GO)数据库对BALF中已识别蛋白进行功能性注释(www.geneontology.org.)20..使用超尾Fisher的变体确定了功能类别的富集P值,该捕获的超距离的超细分布的精确概率。由于同时评估了许多GO类别,因此基于基于置换的假发现速率截止<0.05,函数被认为是“富集”的函数。
将所有蛋白质结合到催化和氧化应激功能基团上,并使用几个数据库来获得经过生物学验证的蛋白质相互作用,从而创建了一个蛋白质相互作用网络:1) intelligent System的知识库,由>20万篇全文、同行评议的科学文章手工整理而成,包含15000多个人类、小鼠和大鼠基因的蛋白质关系21;2)包含~ 35000种蛋白质相互作用的人类蛋白质参考数据库22;3)生物分子交互网络数据库,包括~200,000个交互23;4)包含~ 5.5万个相互作用蛋白的相互作用蛋白数据库24.
急性肺损伤的动物模型
所有动物实验均使用同一供应商(杰克逊实验室,巴港,Me,USA)的成人,男性C57BL / 6小鼠进行。在线补充材料中提供了其他详细信息。
高氧
小鼠(n = 6)被容纳在位于生物安全罩中的有机玻璃室中。穿过笼子的氧气在5升·min保持-1,这足以在有机玻璃室内达到95%的氧比例。每天观察小鼠,每天检查氧级分。动物暴露于高氧或常氧(F阿,我20.21)处理72 h,收集BALF,离心处理,如上所述。在一些小鼠中,肺被膨胀并在25 cmH下用4%多聚甲醛固定2o压力,石蜡包埋和切片用血红素和嗜素染色,用于组织学。
isChaemia /再灌注
机械通气,异氟醚麻醉小鼠(n = 3)用潮量为10mL·kg通气-1,每分钟150次呼吸-1,终端呼气压力为3 cmh2o和F阿,我20.4。左肺温血缺血60min通过胸廓切开术和放置在左海拔左侧的血管夹。在左侧覆盖后,潮气量降至6毫升·kg-1根据需要,呼吸速率增加,以实现类似的潮汐CO2.随后,取下钳夹,潮气量和呼吸频率恢复到基线,允许左肺再灌注4小时,然后再进行安乐死和尸检。安乐死后钳住右肺门,灌洗左肺,经BALF处理。
金黄色葡萄球菌肺炎
金黄色葡萄球菌最初是从患者与导管相关败血症的患者分离并如前所述培养25.用2×10接种小鼠(n = 3)7. CFU of金黄色葡萄球菌在50 μL PBS中通过口咽渴望25.将小鼠安乐死24小时,感染后,右肺被灌输,并收集并如上所述加工BALF。
流感肺炎
用50μLPBS的4,000pFu接种小鼠(n = 3),用4,000pfu(小鼠适应的H1n1流感菌株)中的50μlPBS通过口咽渴望。在感染后120小时,如上所述,使小鼠安乐死并加工并加工。
西方分析
通过SDS-PAGE分离等量的BALF蛋白(20mg),并将电泳转移到聚偏二氟乙烯膜中。膜被5%的非酸性干乳/ 0.05%Tween-20 / PBS封闭2小时,与兔多克隆抗PRDX1抗体(1:10,000,Abcam,剑桥,MA,USA)在室温下孵育2小时,洗涤用0.05%Tween-20 / PBS,与辣根过氧化物酶 - 共轭二抗(1:5,000)孵育1小时,用0.05%Tween-20 / PBS洗涤,然后用增强的化学发光技术(Amersham,Buckinghamshire,英国)开发。
结果
人和小鼠的BALF蛋白质组
我们使用霰弹枪的方法定义了来自四名人类受试者和六只小鼠的BALF蛋白质组。我们在人类中鉴定了91个不同的蛋白质和小鼠中的117个不同的蛋白质(补充表1)。这些蛋白质中的21种是两种物种中同源基因的产物。由于我们应用严格的标准来提高我们对准确蛋白质识别的信心,因此我们可能没有产生详尽的BALF蛋白清单。因此,我们接近了射出的蛋白质组学比较通过以通路为中心的焦点。
BALF蛋白质组的功能和网络分析
我们基于其GO批注释和相对于其各自的全球蛋白质组的富集类别分类了小鼠和人类BALF中鉴定的蛋白质。尽管小鼠和人类BALF之间的实际蛋白质鉴定存在差异,但功能性分析显示出许多过程中重叠的显着性差异,包括炎症反应,防御反应,免疫和蛋白酶活性(图2⇓).通常,鼠标和人类共同的过度代表的类别是最丰富的,这表明这些途径被保存在这些物种上,并包括肺上皮屏障的关键功能。但是,将功能类别并排的富集(图3⇓)在这两种物种中以上的过程中揭示了相对差异。例如,人类BALF的免疫和防御途径高度富集(富集P值~10−10对于人和~10-4在小鼠),而蛋白酶和酶抑制在小鼠BALF中更具过度代表(富集P值~10−12对于鼠标和~10-8在人类)。有关更多详细信息,请参阅补充表2。
基于基因本体论层次注释树的小鼠和人支气管肺泡灌洗液蛋白质组功能分析代表生物过程、分子功能和细胞成分的类别根据物种特异性富集进行颜色编码(误发现率<0.05)。粉红色:在小鼠和人体内富集的模块;绿色:小鼠体内富集的模块;蓝色:人体丰富的模块。高密度脂蛋白:高密度脂蛋白。
Heat-Indoped功能类别在支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白质组的热图表示,小鼠和人类。这种描绘了图2的相同数据⇑允许并排比较两种各种类别的相对富集。注意在小鼠BALF中涉及氧化应激响应的功能模块的选择性富集(由垂直黑条表示)。p值表示识别给定类别的概率,以单独的随机机会富集。
重要的是,我们还确定了在一个物种中显着富集但不是另一个物种的过程。涉及细胞代谢,催化活性和抗氧化剂活性的生物方法和分子函数仅在鼠BALF中差异过度表示,而许多涉及抗原,肝素和碳水化合物结合的分子功能仅富集人类BALF。
最引人注目的观察是持续和选择性富集在小鼠BALF中氧化应激的过程(〜20倍富集,P值~10-6到10.-7).为了更好地阐明映射到该模块的蛋白质之间的关系,我们基于先前公布的基因产物相互作用创建了一种蛋白质网络(图4⇓).这种“互乱”在细胞反应中映射到氧化攻击中的关键球员之间的关系,并包括谷胱甘肽途径(GSTM1,GSTM3和GSTM7),超氧化物歧化酶(SOD1)和热休克蛋白(HSPA1A和HSPA8)。此外,我们鉴定了由肽基脯氨酸异构酶A(PPIA;也称为环托氨酸A)的过洛伐克毒素家族(PRDX1,PRDX5和PRDX6)的几个亚网络组成的子网。
![图4-](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/6/1388/F4.medium.gif)
氧化应力模块的蛋白质相互作用网络。该蛋白酶包括与在小鼠支气管肺泡灌洗液中选择性富集的方法相关的蛋白质组成。包括一些未映射到该模块的蛋白质(以灰色显示)以最大化网络的跨越拓扑。包含其与肽基脯氨酰异构酶A的关系的过氧杂毒素家族标记为蓝色边界。
PRDX1在人和小鼠BALF中的表达
为了验证氧化应激模块的物种间差异,我们进行了Western分析,比较了来自正常小鼠和人类受试者(每组n = 4)的独立、未合并BALF样本中PRDX1的相对表达。我们在所有小鼠BALF样本中观察到明显的信号,而在人类样本中观察到微弱的信号(图5)⇓).接下来,我们使用独立的人类患者样本和四种不同肺损伤模型的小鼠样本,研究了急性肺损伤期间BALF中PRDX1水平的变化:1)暴露于高氧环境;2)流感肺炎;3)金黄色葡萄球菌肺炎;4)缺血/再灌注。在患有急性肺损伤的患者中,与健康对照相比,六名患者中有六个患者显着增加(图5B⇓).在小鼠中,肺损伤期间出现的相反模式,与正常对照相比,PRDX1水平显着减少,特别是在高氧暴露期间(图5C⇓).通过检查暴露于95%氧气的动物的肺组织学,我们进一步证实小鼠对高氧的深刻易感性。我们观察到弥漫性上皮损伤,血管内水肿和空位内的炎症细胞浸润(图5D⇓).
支气管肺泡灌洗液(BALF)中过洛昔洛蛋白1(PRDX1)的Western印迹分析。a)来自三个单独的正常人和三个单独的小鼠样品的BALF确认PRDX1在鼠标中的差异表达。b)与正常受试者(n)相比,急性肺损伤患者(n = 7)增加BALF PRDX1。c)与对照小鼠(n)相比,肺损伤的四种小鼠模型中降低了BALF PRDX1水平:高氧(n = 6);流感肺炎(n = 3);金黄色葡萄球菌肺炎(n = 3);和缺血/再灌注(I / R; n = 3)。d)高氧(吸气氧馏分(吸气)小鼠肺的代表性组织学F阿,我2)0.95,72h)与常氧相比,显示弥漫性肺损伤(F阿,我20.21)。
讨论
我们对小鼠和人类的支气管肺泡液进行了比较霰弹枪蛋白质组学分析,以评估常见和发散的功能途径(图1⇑).我们发现许多对敌对环境的宿主防御至关重要的过程,包括免疫力,防御反应和蛋白酶抑制剂活性,在这两种物种的BALF中高度富集。然而,我们还观察到显着的差异差异,特别是在氧化应激途径中,这意味着在独特的外部和遗传压力下的进化导致小鼠和人类的支气管肺泡蛋白质组中不同的功能性曲线。我们通过通过在正常人和小鼠BALF和肺损伤期间证明PRDX1,代表性氧化应激蛋白质的PRDX1,代表性氧化应激蛋白质的表达模式明显不同的样本来确认我们的发现的相关性。
虽然在这两个物种中很高富集了许多关键功能类别,但相对富集存在差异(图3⇑).例如,与小鼠相比,蛋白质映射到防御反应和免疫的抗辩性和免疫的蛋白质更加过于代表。简单的解释可以是,由于小鼠在无特异性的无病原体条件下提高,并且不暴露于致病微生物的全部光谱,因此其上皮衬液的蛋白质形象较少富含免疫相关功能。
BALF蛋白质组中最突出的间隙差异是选择性富集在小鼠中氧化胁迫下的细胞防御涉及的过程。我们通过创建由功能映射到这些过程的蛋白质组成的交互网络进一步探索了这一发现。这种蛋白酶的成员包括良好建立的细胞防御介质对反应性氧物种,例如谷胱甘肽途径和超氧化物歧化酶。在小鼠中,超氧化物歧化酶的同质酶在保护肺部免受高氧诱导的损伤中起着关键作用26那27.
在该富集的氧化应激模块中,我们鉴定了一种相互作用的过氧毒素(PRDX1,PRDX5和PRDX6)的子网络。这些蛋白质属于非联苯甲酯 - 过氧化物酶的家族,其通过来自硫氧化丝或环氧丝的电子转移来催化宽光谱的过氧化物。过氧化毒素被涌现为因反应性氧代谢物引起的肺部肺部的关键保护剂。例如,缺乏PRDX6的转基因小鼠更容易来自高氧的肺部损伤,而PRDX6的过度表达保护来自高氧诱导的肺损伤的小鼠28那29.我们证实了PRDX1在小鼠BALF样本中相对于人类的差异表达。由于尚未报道PRDX1在肺损伤中的作用,我们分析了几种与显著氧化应激相关的小鼠肺损伤模型中的PRDX1表达。我们发现,PRDX1虽然在对照组小鼠的BALF中大量表达,但在高氧、缺血/再灌注和肺炎导致的肺损伤期间显著降低。有趣的是,PRDX1在人BALF中遵循相反的表达模式,在急性肺损伤后变得更加丰富。这些观察表明,虽然PRDX1可能在肺防御氧化损伤中作为一种重要的过氧化物酶,但其表达谱在物种间存在明显差异。
将我们的蛋白质组学方法与网络分析集成的一个优点是其能够为分子机制提供新的洞察力。例如,小鼠BALF中的所有鉴定的过氧氧基毒素与PPIA相互作用(也称为环托胺A)。越来越多的证据表明,生物网络内高连接的集线器对于其功能稳定性很重要30.-32.因此,根据我们的计算分析,我们预测PPIA是调制肺的抗氧化防御计划的推定目标。支持这个命题,以前体外实验证明,PPIA直接与过氧化物酶结合,大大提高其酶活性33.有趣的是,环孢菌素A可以与PPIA结合并改变其活性,并且用这种药物治疗的小鼠在暴露于高氧时在肺损伤中表现出显着的衰减34.
虽然我们的研究提供了对C57BL / 6小鼠的易感性机制到高氧诱导的肺损伤的洞察力,但在这种反应中存在显着的应变依赖性变化35.我们选择C57BL / 6只小鼠,因为它们是生物医学研究中最常用的菌株,对高氧诱导的肺损伤具有“中间”易感性35.基于类似蛋白质组学方法的未来工作可能有助于阐明在表型不同菌株的途径特异性机制。
其他调查员还报道了对小鼠和人类Balf的蛋白质组学分析。例如,郭等等。36结合凝胶法和散弹枪法来定义小鼠BALF蛋白组,共鉴定了297个独特的蛋白。虽然这个数字远远大于我们发现的117种独特蛋白质,但从样品制备到仪器和数据库搜索标准,许多因素都可能导致散弹枪蛋白质组实验的显著差异。然而,如果郭鉴定的蛋白质数量等等。36仅限于那些使用散弹枪方法获得的,并且基于识别不止一个独特的肽,独特蛋白质的数量减少到126,与我们的报告相当。进一步将他们的研究与我们的研究进行比较,发现两组小鼠BALF蛋白组中存在许多常见的功能类别,包括氧化应激、补体激活、蛋白质水解和炎症反应。有趣的是,和我们的发现一致,郭等等。36还报道了PPIA和几种过氧化嗪蛋白的存在,包括小鼠BALF中的PRDX1,PRDX5和PRDX6。
这项研究有许多局限性。由于这项工作的主要目的是了解人类和小鼠BALF的共同和不同的途径,我们决定汇集每个物种的灌洗样本。尽管汇集可能会增加一个异常样本可能导致结果偏差的可能性,但我们之前已经证明,尽管个体间存在差异,但人类BALF蛋白组中的大多数高度富集过程在受试者之间是紧密保存的10..我们的(未发表的)数据表明甚至小鼠的BALF蛋白质组的更严格的均匀性。我们没有直接比较小鼠和人类BALF样品之间的蛋白质的相对丰富。我们没有执行定量比较,例如使用光谱计数37,因为大多数已鉴定的蛋白质在物种之间没有重叠,因此不可能进行直接比较。然而,我们使用Western分析验证了PRDX1在小鼠中的相对于人类的差异表达。最后,虽然对BALF蛋白的检测不能表明它们的细胞来源,但有充分的证据表明,BALF蛋白的差异表达与疾病的表型和严重程度相关。此外,对空气空间进行取样以寻找肺疾病介质的相对容易,确保了其在研究和临床环境中的广泛应用。
总之,我们的工作为人和小鼠BALF蛋白质组的比较分析提供了框架。尽管鉴定了相对较少的常见同源蛋白,但在两种物种中保留了涉及免疫力,防御反应和蛋白酶抑制的关键功能类别。然而,我们还确定了BALF蛋白质组的显着泛函差异,最突出地在小鼠中选择性富集氧化应激途径。因此,虽然鼠模型的利用研究人肺障碍已经成功地将板凳研究带入床边实践,但这种方法应该欣赏固有的间隙差异。
支持声明
This work was supported by National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (Bethesda, MD, USA) HLBI HL074223 (S.A. Gharib), HL083481 (L.M. Schnapp), HL086796 (L.M. Schnapp), and UL1RR025014 (S.A. Gharib).
兴趣表
可以在C.e. Doneanu的利益声明www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl.
致谢
作者要感谢Y-A。Goo(医药化学,华盛顿大学,西雅图,WA,美国),协助蛋白质组学分析,D. And T. Lozon(华盛顿大学肺生物学中心),协助动物实验和F.。Turocer和M.旺(肺生物中心)用于进行西方分析。
脚注
本文提供了补充材料www.www.qdcxjkg.com.
- 已收到2009年6月5日。
- 公认2009年11月18日。
- ©ers.