摘要gydF4y2Ba
屋尘螨(HDM)是室内粉尘过敏原的主要来源,与哮喘的发生密切相关。HDM可引起直接的、非过敏性炎症反应gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。我们的目的是确定这种明显的非过敏性炎症反应是否可以在更复杂的疾病中观察到gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba设置。gydF4y2Ba
车,明矾gydF4y2BaTMgydF4y2Ba或HDM (gydF4y2BaDermatophagoides pteronyssinusgydF4y2Ba5μg,gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba敏化的Brown-Norway大鼠经气管内灌胃(盐水)、HDM (gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba10 μg)或热灭活HDM。评估肺功能改变及相关炎症反应。gydF4y2Ba
明矾组织和支气管肺泡灌洗gydF4y2BaTMgydF4y2Ba敏感gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba受到挑战的动物表现出强烈的嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞,这与促炎细胞因子(白细胞介素-13和1β, eotaxin和胸腺以及活化调节的趋化因子)的早期释放有关。这种反应不会因去除hdm相关蛋白酶活性而减弱。有趣的是,载体敏感组(没有明矾gydF4y2BaTMgydF4y2Ba)缺乏这种炎症反应。gydF4y2Ba
HDM过敏原引起非过敏性气道炎症,其炎症特征与哮喘气道相似。这种反应,独立于HDM提取物的蛋白酶活性,似乎与之前的辅助管理明矾有关gydF4y2BaTMgydF4y2Ba以及随后总免疫球蛋白e的增加。这一发现可能对未来哮喘疗法的发展具有重要意义。gydF4y2Ba
暴露于屋尘螨(HDM)过敏原与过敏性疾病的发展密切相关,如哮喘、鼻炎或特应性皮炎gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。属螨gydF4y2BaDermatophagoidesgydF4y2Ba,例如gydF4y2Bad . pteronyssinusgydF4y2Ba(gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba),gydF4y2Bad . farinaegydF4y2Ba(gydF4y2BaDer fgydF4y2Ba),被认为是与人类哮喘相关的室内过敏原的最重要来源gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba。产生超过30种蛋白质gydF4y2BaDermatophagoidesgydF4y2Ba螨类可诱导过敏患者免疫球蛋白(Ig)E,但存在显性抗原,尤其是1、2类过敏原,可占HDM提取物致敏性的大部分gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。在第一类过敏原中gydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba从gydF4y2Bad . pteronyssinusgydF4y2Ba。gydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba属于木瓜样半胱氨酸蛋白酶家族,具有半胱氨酸蛋白酶活性gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。这种蛋白水解活性已被认为参与了过敏的发病机制:增加上皮细胞的通透性,并允许自身和其他过敏原通过上皮细胞gydF4y2Ba5gydF4y2Ba–gydF4y2Ba7gydF4y2Ba;分裂和/或与细胞表面分子和内在蛋白酶抑制剂相互作用gydF4y2Ba8gydF4y2Ba–gydF4y2Ba11gydF4y2Ba;并调节一系列细胞的功能,如嗜碱性粒细胞、肥大细胞、肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞gydF4y2Ba12gydF4y2Ba–gydF4y2Ba15gydF4y2Ba。对气道上皮细胞的影响尤其有趣,因为它可能是第一个与过敏原相互作用的细胞类型。几位作者对此进行了报道gydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba和其他gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba抗原能够直接诱导原代人支气管上皮细胞和气道上皮细胞系释放促炎细胞因子和趋化因子gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba–gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba通过蛋白酶依赖和独立的机制gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
然而,据我们所知,HDM的这种促炎作用还没有在更复杂的疾病中表现出来gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba系统。因此,我们的目的是调查一种商业HDM提取物是否来自gydF4y2Bad . pteronyssinusgydF4y2Ba能够在Brown-Norway (BN)大鼠中引起直接的非过敏性促炎作用。选择BN大鼠是因为我们和其他人之前已经证明了对其他抗原的过敏反应,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba卵清蛋白(OVA)在该菌株中可获得gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
动物gydF4y2Ba
雄性BN大鼠(200-225克)取自Charles River Laboratories Inc. (Lyon, France),在开始实验前放置1周。gydF4y2Ba
HDM提取gydF4y2Ba
纯化的HDM提取物gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba(GREER laboratories, Lenoir, NC, USA),已知含量为gydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba(39.77μg·毫克gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在这些实验中使用干重)。本手稿中使用的HDM剂量为gydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
提取物中蛋白酶活性的测定gydF4y2Ba
利用荧光肽底物Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (AMC, 7-氨基-4-甲基香豆素;Boc, n -叔丁基羰基)gydF4y2Ba23gydF4y2Ba。简而言之,已知量的HDM提取物(最终浓度gydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba10 nM)添加到底物标准曲线(0-1 mM)中,在25°C下,加入含有1mm EDTA和1mm二硫苏糖醇的50mm磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中。使用Synergy™HT Multi-Mode Microplate Reader (Biotek UK, Potton, UK)监测与底物水解相关的荧光,λex = 380nm, λem = 460nm。数据拟合为Michaelis-Menten方程,y = V × x/(Km+x),动力学常数Km (Michaelis-Menten常数)和最大转化率(gydF4y2BaVgydF4y2Ba”gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba)进行计算。HDM提取液中蛋白酶活性呈阳性gydF4y2BaVgydF4y2Ba”gydF4y2Ba马克斯gydF4y2Ba76,636 μmol·mingydF4y2Ba−1gydF4y2BaKm为304.9 μM。作为对照,如前所述,相似数量的HDM提取物通过加热到65°C 30分钟灭活gydF4y2Ba19gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
给药路线选择gydF4y2Ba
我们以前对过敏性气道炎症的大部分工作都涉及到抗原的雾化挑战。不幸的是,由于成本问题,我们无法使用这种方法。因此,我们最初的目的是通过比较鼻内和气管内给药途径来确定过敏原的最佳局部给药途径。这是通过使用脂多糖(LPS)诱导的肿瘤坏死因子(TNF)-α在肺中的释放作为适当递送的生物标志物来进行的。雄性BN大鼠(200 ~ 225 g)麻醉(4%氟烷氧麻醉3 min),对照物(生理盐水)或LPS (100 μg·大鼠)麻醉gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba两种情况下剂量相同),以不同的量鼻内(每个鼻孔5、10、20、50或100 μL)使用移液器滴入,或气管内(250 μL)。90分钟后采集血液、灌洗和肺组织样本。如Birrell的研究所述,使用ELISA (R&D systems Inc., Minneapolis, MN, USA)检测TNF-αgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
HDM增敏剂量选择gydF4y2Ba
致敏挑战的时间由我们在BN大鼠的OVA过敏性炎症模型推断gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。进行了过敏原剂量反应研究,通过测量14天后血浆中hdm特异性IgE水平来评估最佳致敏剂量gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba剂量。雄性BN大鼠(200-225 g)于第0天用生理盐水、明矾致敏gydF4y2BaTMgydF4y2Ba(Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough, UK)或HDM提取物(0.5-500 μg·ratgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba;格里尔实验室)管理明矾gydF4y2BaTMgydF4y2Ba。第14天采集血液样本,分离血浆。gydF4y2Ba
ELISA板(Nunc MAXsorb;Fisher Scientific)用50 μL或5μg·mL包被gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba将HDM蛋白放入PBS中,置于室温下过夜。然后用洗涤缓冲液(Invitrogen, Paisley, UK)清洗盘子,并用4%牛血清白蛋白(BSA;西格玛奥尔德里奇,普尔,英国)在PBS。然后将血浆样本加入含有4% BSA和0.05% Tween 20的PBS中,稀释为1:10。然后在室温下孵育过夜,然后加入生物素化抗ige (1:10;Serotec, Kidlington, UK) 2μg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(在含有4% BSA和0.05% Tween 20的PBS中),并在室温下进一步孵育1小时。洗净后,用辣根过氧化物酶链霉亲和素(1:4000;Amersham Biosciences,乌普萨拉,瑞典)。在最后一次清洗后,将四甲基联苯胺衬底(Sigma Aldrich)添加到平板上,在室温下孵育,直到出现颜色。用0.25 M硫酸停止反应,在450 nM下读取平板(Biotek Powerwave XS平板阅读器;Biotek英国)。总IgE使用商业大鼠IgE定量ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)按照制造商的方案进行测量,并以μg·mg表示gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba肺组织总蛋白。gydF4y2Ba
HDM具有挑战性的剂量选择gydF4y2Ba
在确定最佳致敏剂量后,我们的目标是确定一个适当的HDM剂量来挑战先前致敏的动物。HDM (5 μg·大鼠)对雄性BN大鼠(200 ~ 225 g)在第0、14天致敏gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)用明矾管理gydF4y2BaTMgydF4y2Ba。大鼠灌胃盐水或HDM (0.1 ~ 100 μg·大鼠)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba250 μL生理盐水),第21天。gydF4y2Ba
HDM攻毒48小时后,灌洗大鼠(2×3 mL RPMI)。使用Sysmex细胞计数器(Sysmex UK Ltd, Milton Keynes, UK)定量从气道管腔中恢复的总细胞计数。使用标准形态学标准进行Wright-Giemsa染色后,在光镜下对气道腔内恢复的细胞进行差异细胞计数(以绝对细胞计数表示的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴单核细胞)。gydF4y2Ba
BN模型中HDM致敏/挑战后细胞招募的时间过程gydF4y2Ba
为了确定HDM急性暴露对哮喘样终点的影响,雄性BN大鼠(150-180 g)在第0天和第14天分别用载体物(生理盐水)或HDM提取物(5 μg·大鼠)致敏gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)用明矾管理gydF4y2BaTMgydF4y2Ba。第21天给予大鼠气管灌胃液(生理盐水)或HDM提取物(10 μg气管灌胃)刺激。gydF4y2Ba
6、24或48小时后灌洗动物,按上述方法进行白细胞计数。类似地,白细胞的数量和类型在肺组织被确定如前所述gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。剩余的肺被快速冷冻或固定在福尔马林进行组织学评估。炎症mRNA/蛋白表达通过实时PCR评估,使用完全验证的引物和探针,详见McCluskiegydF4y2Baet al。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba或通过特异性ELISA (R&D Systems Inc.)。细胞因子在肺中的位置用免疫组化观察。gydF4y2Ba
简而言之,处理充注福尔马林固定肺组织并进行蜡包埋。石蜡包埋组织4 μm切片脱蜡复水。用3%的过氧化氢(白细胞介素(IL)-13;25分钟)或2%双氧水(eotaxin和IL-1β;20分钟)。IL-13和IL-1β载玻片在柠檬酸钠缓冲液(10 mM;pH值6.0)。用10%正常兔血清(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)在含有0.1% BSA和0.025% Tween 80的PBS中减少非特异性结合,用于IL-13免疫组化20分钟,1%正常兔血清(Dako UK Ltd, Ely, UK)在含有0.1% BSA和0.025% Tween 80的PBS中减少非特异性结合,用于eotaxin和IL-1β免疫组化20分钟。然后冲洗切片和一抗(山羊多克隆抗小鼠IL-13抗体,1:250稀释(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA);山羊多克隆抗小鼠eotaxin/CCL11, 1:50稀释(R&D Systems Inc); or goat polyclonal anti-rat IL-1β, 1:200 dilution (Santa Cruz Biotechnology)) diluted in PBS containing 0.1% BSA and 0.025% Tween 80 was applied for 1 h at room temperature. Sections were then incubated with a secondary biotinylated rabbit anti-goat IgG (IL-13: 1:150 dilution for 30 min; eotaxin: 1:100 for 60 min; IL-1β: 1:120 for 60 min; Vector Laboratories) followed by detection with a Vectastain Elite ABC kit for mouse IgG (PK6102; Vector Laboratories). The staining was revealed using the diaminobenzidine (Sigma Aldrich) procedure counterstaining with Mayer's haematoxylin. Tissues incubated with a blocking peptide instead of the primary peptide were used as negative controls.
图像使用奥林巴斯BX-51显微镜(奥林巴斯英国有限公司,绍森德,英国)和Qicam数码相机(Qimaging,萨里,BC省,加拿大)进行拍摄。gydF4y2Ba
对HDM挑战晚期支气管收缩反应的无创测定gydF4y2Ba
HDM刺激后,将清醒且不受约束的车辆大鼠或HDM敏感大鼠置于全身容积描记仪(Buxco Research Systems, UK)中,并由Buxco xa分析仪(Buxco Research Systems)连续记录压力变化。记录≤5小时的增强暂停(Penh),每隔10分钟取平均值。在攻毒24小时前记录10min Penh得到基线值,并使用基线校正值进行分析。gydF4y2Ba
有创性测定应对HDM挑战时气道阻力的变化gydF4y2Ba
因为使用全身容积描记仪(Penh)作为肺功能测量相关的争议gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,我们使用常规的侵入性肺力学证实了我们的结果。对照或HDM致敏雄性BN大鼠麻醉(氯胺酮和甲苯嗪144和10 mg·kg)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba分别gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)并在攻毒48小时后检测。简单地说,气管插管,动物人工呼吸,潮气量为2 mL·kggydF4y2Ba−1gydF4y2Ba频率为90次呼吸·分钟gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba。一个充满水的食管插管被插入,这样就可以记录估计的跨肺压力。肺阻力(cmHgydF4y2Ba2gydF4y2BaO·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba·年代gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和动态顺应性(mL·cmH .gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)在Buxco xa分析仪(Buxco Electronics)上连续计算。雾化致痉剂的管理gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba与呼吸机连接的喷雾器(Buxco Electronics)。气道反应性通过雾化增加浓度的乙酰胆碱(100 μL对照(生理盐水)2、4、8、16和32 mg·mL来评估gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)。每次注射甲胆碱后监测平均气道阻力变化2分钟。gydF4y2Ba
召回致敏动物脾细胞的挑战gydF4y2Ba
雄性BN大鼠(150-180 g)在第0天和第14天用生理盐水“致敏”(gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)或明矾gydF4y2BaTMgydF4y2Ba(20 mg·老鼠gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba氢氧化铝和20毫克·大鼠gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba氢氧化镁,gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba)。与此同时,作为回忆挑战的对照,如前所述,动物对OVA敏感gydF4y2Ba22gydF4y2Ba。用药过量戊巴比妥(200mg·kg)后第21天取脾gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,gydF4y2Bai.p。gydF4y2Ba),然后转入冷PBS。然后用针和注射器用PBS冲洗它们(不含钙和镁;Sigma Aldrich),以获得脾细胞悬浮液。混合后的细胞悬液经70 μm细胞筛,250×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C低温旋转5分钟(Mistral 3000i;MSE,英国伦敦)。丢弃上清液,细胞球团在PBS中重悬,然后离心。脾细胞重悬于RPMI 1640中,添加10%胎牛血清(FCS)和1%抗生素和抗真菌液(青霉素/链霉素;Sigma Aldrich),计数,台盼蓝测定细胞活力。脾细胞用RPMI 1640稀释,加入10% FCS和1%抗生素抗真菌液,225 μL细胞(8×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)在24孔板中培养。每孔加入RPMI 1640 250 μL,添加10% FCS和1%抗生素抗菌液,含0.1%(体积/体积)二甲基亚砜。25 μL不同浓度的HDM (gydF4y2Bader pgydF4y2Ba0.01μg·-50毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba), OVA (1 mg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)或生理盐水被添加到相应的井中。在载玻片中加入200 μL细胞。板和载玻片在37°C的潮湿气氛(95%空气,5% (v/v) CO)中孵育72小时gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。收集上清液,特异性ELISA检测细胞因子释放(R&D Systems Inc.)。gydF4y2Ba
数据分析gydF4y2Ba
图中及文字中所有数值均以均数±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ban个观测值。比较两组时采用非配对t检验,比较多组时采用单因素方差分析。当发现数据不是正态分布时,在比较两组时使用Mann-Whitney检验,在比较多组时使用Kruskal-Wallis检验。所有处理均与相关车辆对照组比较,p<0.05为差异显著。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
给药路线选择gydF4y2Ba
我们发现,在大鼠中,使用lps诱导的TNF-α作为成功肺输送的标志,鼻内给药产生了不同的结果(数据未显示)。然而,气管内LPS在所有动物中产生了更大、更强的信号(图1)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。当我们分析肺组织时获得了类似的数据(未显示),有趣的是,我们没有检测到血浆TNF-α的任何增加,尽管如果腹腔注射该剂量会导致循环TNF-α的大量增加(数据未显示)。gydF4y2Ba
由于鼻内给药的可变性,我们选择气管内给药。gydF4y2Ba
HDM增敏剂量选择gydF4y2Ba
明矾给药后14天血浆总IgE水平明显升高gydF4y2BaTMgydF4y2Ba与对照组(生理盐水)相比,但与HDM提取物共给药后没有进一步增加(图2agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。然而,与明矾相比,HDM提取物联合给药确实导致HDM特异性IgE血浆水平显著升高gydF4y2BaTMgydF4y2Ba单独(图2bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
5 μggydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba诱导特异性IgE的强劲增长,我们采用这一剂量进行进一步研究。gydF4y2Ba
HDM具有挑战性的剂量选择gydF4y2Ba
在前两剂量试验中,HDM气管内刺激引起显著的支气管肺泡(BAL)液嗜酸性粒细胞增多(图2c)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。在最高剂量下,嗜酸性粒细胞数量显著增加(图2d)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
As 10 μggydF4y2BaDer p 1gydF4y2Ba诱导嗜酸性粒细胞增多,中性粒细胞减少,我们采用该剂量进一步研究。gydF4y2Ba
HDM致敏/挑战对BAL液和肺组织细胞募集的影响gydF4y2Ba
用HDM提取物刺激6小时和48小时后,我们分别在BAL液和肺组织中检测到气道中性粒细胞增多和嗜酸性粒细胞增多(图3)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。有趣的是,我们在明矾中观察到类似程度的炎症gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-只在对HDM敏感的大鼠身上看到的敏感动物。仅用载体(生理盐水)致敏的动物在BAL或组织中均无炎症迹象(数据未显示)。这一观察结果表明明矾gydF4y2BaTMgydF4y2Ba在HDM的直接炎症反应中是重要的。gydF4y2Ba
HDM致敏/挑战对气道功能测量的影响gydF4y2Ba
攻毒后气道功能无变化。HDM/车辆挑战后对晚期哮喘反应(LAR)的监测未显示各组间有任何显著差异(图4agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba),而使用我们的标准OVA驱动模型,我们可以测量该品系大鼠的显著LAR(图4bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)gydF4y2Ba24gydF4y2Ba。同样,在刺激48小时后测量气道对吸入乙酰胆碱的反应性时,也没有明显变化(图4cgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
HDM致敏/挑战对细胞因子/趋化因子基因表达和释放的影响gydF4y2Ba
为了试图研究所观察到的非过敏性炎症的机制,我们在mRNA和蛋白质水平上测量了一系列哮喘相关炎症细胞因子。结果显示炎症mRNA表达增加,如IL-13, IL-1β, eotaxin,胸腺和活化调节趋化因子(TARC),单核细胞趋化蛋白(MCP)-3和大鼠等量生长调节癌基因(GRO)-α,细胞因子诱导的中性粒细胞趋化剂(CINC)-1,挑战后6小时(图5)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。我们发现可以使用现有的大鼠elisa检测的介质蛋白表达的平行增加(图6gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。随着细胞炎症的增加,HDM在HDM致敏和明矾中诱导炎症细胞因子的增加gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-只有敏感的大鼠。我们在这些样本中没有检测到IL-4和干扰素-γ的任何增加。gydF4y2Ba
盐水致敏/盐水刺激肺组织的组织学评估显示48小时肺实质无炎症浸润(图7a)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba);而时间匹配的铝敏化/gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba攻毒48小时后,感染动物出现炎症浸润(图7b)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
免疫组化染色显示,纯铝致敏/gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba挑战动物IL-13染色呈阳性(图7cgydF4y2Ba⇑gydF4y2Bad)攻毒6小时后气道上皮细胞和类似肺泡巨噬细胞的炎症细胞。与这些发现一致的是,尽管IL-13通常与t细胞有关,有时与肥大细胞或嗜酸性粒细胞有关,但最近有报道称它也可能与气道巨噬细胞有关gydF4y2Ba27gydF4y2Ba以及气道上皮细胞gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29gydF4y2Ba。Eotaxin也高表达,但主要在大小气道上皮中(图7e和f)gydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba),而IL-1β染色在上皮细胞中很低,似乎主要与炎症细胞浸润有关(图7g和hgydF4y2Ba⇑gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
HDM蛋白酶活性对BAL液和肺组织细胞募集的影响gydF4y2Ba
为了确定HDM提取物的蛋白酶活性是否与之前观察到的明显直接炎症反应有关,用载体(生理盐水)或明矾“致敏”动物gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-然后在气管内用蛋白水解活性或热灭活的HDM提取物挑战(图8agydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。盐水致敏动物,不像明矾致敏动物gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-仅,未表现出气道炎症(图8bgydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。热灭活的HDM提取物也能引起明矾的炎症反应gydF4y2BaTMgydF4y2Ba致敏动物,而非盐水致敏动物(图8b)gydF4y2Ba⇓gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
召回致敏动物脾细胞的挑战gydF4y2Ba
对明矾中观察到的反应进行折现gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-只有致敏动物可能是由于一种未定义的蛋白质,然后在气管内刺激期间再次注入,来自明矾致敏动物的脾细胞用HDM提取物刺激,如方法部分所述。这种在脾细胞中的召回挑战方法先前通过使用从过敏性炎症的OVA模型中获得的脾细胞进行了验证。OVA致敏动物脾细胞中的OVA挑战导致t -辅助性(Th)2细胞因子的释放,如IL-4(7±1.1 pg·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba对照组盐水处理1.2±0.3 pg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;p<0.01)或IL-13(27.9±6.5 pg·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba与gydF4y2Ba对照组盐水灌提3.5±2.4 pg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba;p < 0.01)。然而,HDM即使在最高浓度为50 μg·mL时也具有挑战性gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,未能导致明矾释放任何显著的Th2细胞因子gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-仅致敏的脾细胞。这些结果将支持在明矾中观察到的反应的非过敏性性质gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-只有敏感动物gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们已经证明了从gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba能够引起BN大鼠肺部的直接炎症反应。炎症的特征是嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润,并与促炎细胞因子的早期表达和释放有关,如IL-13、IL-1β、eotaxin、MCP-3、TARC和CINC-1。这项研究首次证明了HDM的直接促炎作用,正如在其他研究中观察到的那样gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba–gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,也可以表现在更复杂的生物学上gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba在BN大鼠中设置。然而,与之前的研究不同,炎症似乎与HDM的蛋白酶活性无关,而是与动物是否接受了明矾有关gydF4y2BaTMgydF4y2Ba在挑战之前。这表明吸入HDM的直接炎症反应依赖于明矾的功能gydF4y2BaTMgydF4y2Ba,如增加总IgE。gydF4y2Ba
由过敏原诱导的早期免疫事件的研究目前正在接受大量的审查,因为它们很可能与过敏原驱动的炎症性疾病(如哮喘)的发病机制有巨大的相关性。迄今为止,这些事件的研究很少,它们可能在过敏性炎症的发展和我们对哮喘病理的理解中非常重要。目前认为,HDM变应原与支气管上皮相互作用时,通过蛋白酶活性引起直接损伤,破坏上皮紧密连接,从而增加支气管上皮通透性,促进变应原跨上皮传递和与抗原提呈细胞相互作用gydF4y2Ba5gydF4y2Ba–gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。我们已经证明HDM过敏原可以与肺相互作用,特别是气道上皮,并诱导哮喘样炎症,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba嗜酸性粒细胞增多和Th2型细胞因子增高。非常有趣的是,HDM可以在以前没有接触过相同抗原的动物身上引起这些反应。最近有报道称,某些具有蛋白酶活性的真菌过敏原能够在缺乏适应性免疫细胞的小鼠中诱导嗜酸性气道炎症。据报道,这种直接炎症与趋化因子的诱导有关,如MCP-3 (CCL7)和TARC。我们观察到这两种细胞因子相似的增加,这可能表明类似的机制可能是本研究中观察到的早期嗜酸性粒细胞增多的原因。此外,HeijinkgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba显示gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba这种TARC表达可能是炎症中Th2细胞募集的关键,可以直接被诱导gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba在人支气管上皮细胞中。然而,尽管这可能是对我们的结果的一个合适的解释,但事实上,提取物中蛋白酶活性的失活并不能阻止炎症反应的发展,这表明了一种不同的机制。相反,最近也有报道称,非蛋白水解性HDM过敏原可能存在于提取物中,如gydF4y2BaDer pgydF4y2Ba2、均能诱导核因子-κB和丝裂原活化蛋白激酶活化gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
所有接受明矾的动物gydF4y2BaTMgydF4y2Ba在致敏期间,无论有无HDM,均显示血清IgE显著升高。这种现象并非其他无机盐所独有,如HgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba,在过去已被证明会引起BN大鼠总IgE的升高gydF4y2Ba31gydF4y2Ba。正如预期的那样,只有在致敏期间也接受HDM的大鼠显示出显著的血清HDM特异性IgE水平。没有摄入明矾的老鼠gydF4y2BaTMgydF4y2Ba,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba对于总IgE水平较低的患者,未观察到吸入HDM后的直接炎症反应。血清IgE水平与哮喘的可能联系,独立于特异性过敏致敏之前已经有报道gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。非特应性哮喘占所有哮喘患者的10-33%gydF4y2Ba34gydF4y2Ba。在细胞和分子水平上,非特应性哮喘和特应性哮喘非常相似,其临床差异的原因尚不完全清楚gydF4y2Ba35gydF4y2Ba。有确凿的证据表明,IgE介导的机制不仅参与了特应性哮喘的发病,而且也参与了非特应性哮喘的发病,并且在非过敏个体中,血清总IgE的升高与哮喘有关gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba。有人认为,在这些个体中,总IgE可能只是哮喘的一个后果,哮喘是过敏性炎症的一个标志gydF4y2Ba32gydF4y2Ba。然而,我们的研究结果表明存在实际的联系,并且我们提出,在我们的模型中看到的炎症反应的发展可能与血清中总IgE的高水平有关。如果我们的数据确实适用于人类的情况,它可能会解释为什么这种混杂的抗原不会让每个人的呼吸道发炎。事实上,我们的断言是,暴露于HDM的人也需要有较高的IgE水平,以引起肺部的炎症反应。事实上,最近的一项研究表明,对常见过敏原有IgE致敏的个体可能会对特定的不同过敏原产生哮喘反应,即使血清特异性IgE水平表明他们对这种过敏原不敏感gydF4y2Ba36gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
有趣的是,尽管表现出哮喘样炎症反应和HDM特异性IgE,但在HDM刺激后,没有任何研究组表现出气道功能的任何变化,无论是早期哮喘反应还是LAR。然而,如之前的研究所示gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba在大鼠中,单一的HDM挑战可能不足以实现可靠的肺功能改变,事实上,在小鼠模型中,多次HDM挑战可能是必要的gydF4y2Ba39gydF4y2Ba–gydF4y2Ba41gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
对于HDM直接导致炎症的说法,一个可能的警告是HDM混合物中的其他物质是罪魁祸首,gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba少量内毒素。此外,最近的一项研究提出Toll样受体-4受体激活可能在HDM诱导反应中起关键作用gydF4y2Ba41gydF4y2Ba。虽然内毒素可以引起研究中观察到的一些炎症,但我们认为内毒素不太可能是罪魁祸首。含量很低(36 EU·mL)gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba用热根5000 LAL内毒素测定法测定;Cambrex Bioscience Ltd, Wokingham, UK),细胞流入的时间比LPS后预期的要晚得多,一些测量到的介质被认为没有被内毒素上调(gydF4y2Ba即。gydF4y2BaTARC),可能最令人信服的是,HDM中没有炎症,但非明矾gydF4y2BaTMgydF4y2Ba敏感的动物。另一种可能的解释是明矾gydF4y2BaTMgydF4y2Ba-只有敏感的动物暴露于一种未定义的蛋白质,然后在气管内挑战期间再次传递该蛋白质,导致Th2过敏反应。然而,回忆挑战实验的负面结果似乎排除了这种可能性。尽管如此,我们不能完全放弃观察到的一些炎症是通过非hdm机制。gydF4y2Ba
总之,这些数据表明,HDM暴露于增加血清总IgE的辅助剂后,可以在气道中引起直接炎症,这在许多方面是哮喘气道的特征。我们认为这是一个非常有趣的发现,因为它可能有助于解开高IgE水平、特异反应和哮喘表型发展之间的复杂联系。事实上,这些数据可能会显著改变我们对IgE在哮喘发病机制中的作用的理解。gydF4y2Ba
支持声明gydF4y2Ba
这项研究的资金由葛兰素史克公司提供。gydF4y2Ba
权益声明书gydF4y2Ba
R.G.诺尔斯和M.G.贝尔维西的兴趣声明,以及研究本身,可以在gydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtlgydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们要感谢C. Dean(呼吸药理学,药理学和毒理学,伦敦帝国理工学院,医学院,国家心肺研究所,伦敦,英国)帮助准备这篇手稿。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2008年2月13日gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2009年9月29日。gydF4y2Ba
- ©人队gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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