摘要
胃肠道反流频繁在慢性气道疾病中经常出现,被认为是症状的触发。在动物模型中,双侧阴道或毒蕈碱拮抗剂可以防止呼吸道抗性的增加和急性食管酸滴注诱导的微血管泄漏。
本研究研究慢性胃食管反流病(GORD)动物模型的肺炎症和重塑,以及噻托溴铵、阿托品和地塞米松预处理的有效性。
将小鼠暴露于每天两次内食管HCl滴注21天。暴露于HCl原因:通过气道的炎性细胞和泛刺地区的炎症细胞标记渗透;上皮厚度的增加;间质性肺炎的组织学特征;细胞数和白细胞介素-8的水平增加;在支气管肺泡灌洗液中溶于细胞间粘附分子,以及体外气管收缩性。每次注入盐酸前给予噻托溴铵或腹腔注射阿托品,可显著抑制所有这些变化。
这些结果表明乙酰胆碱在通风炎症中的主要作用在戈尔德模型中的重塑,并证明了噻托溴铵和阿托品可以预防肺炎,其有效性与腹腔内塞米松的有效性,提供额外的证据,即抗胆管能量可能导致炎症过程的控制气道疾病。
严重慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘的患者具有胃肠道反流疾病(GORD)的普及率高,这被认为是气道症状和恶化的潜在触发1- - - - - -4.反流的内科和外科治疗可改善哮喘患者~ 66%的喘息和咳嗽,减少一半以上按需吸入器的使用,并改善近25%的患者的肺功能1.然而,最近的研究对GORD作为哮喘控制不佳的原因的作用提出了挑战,至少在无症状GORD患者中是这样3.,4.
副交感神经系统提供从喉部到最小的气道和肺泡的主导自主神经支配。在迷走神经和气道副交感神经节突触中传播的传出胆碱能通路引起支气管收缩5.阿托品或吸入抗胆碱能药物阻断毒蕈碱受体M1和M3可改善气道阻塞,间接证据表明,COPD和哮喘患者的副交感神经活动增加5.
在哮喘的患者中,通过阿托品预处理消除了通过HCl灌注到食道诱导的50%的强制呼气流量的减少,从而消除了阿托品预处理6.在动物模型中,我们和其他人以前据报道,双侧阴道或阿托品预处理抑制了急性食管酸滴注诱导的气道阻力和微血管泄漏的增加7,8.我们还发现,豚鼠单次食管内盐酸灌注引起的气道微血管泄漏涉及M1和M3受体9.这些结果表明,通过激活毒蕈碱受体的乙酰胆碱的释放有助于用HCl引起的食管刺激引起的气道反应。
乙酰胆碱传统上涉及气道平滑肌收缩,微血管泄漏和粘液分泌。最近的证据表明乙酰胆碱可能有助于肺炎和气道重塑的各个方面5.乙酰胆碱通过激活毒蕈碱受体,刺激肺成纤维细胞和平滑肌细胞增殖,促进肺成纤维细胞胶原合成5,10..乙酰胆碱还可以促进上皮细胞,巨噬细胞和气道平滑肌中的趋化性活性5.柴油颗粒的滴注到麻醉大鼠气道中唤起肺中的嗜中性粒细胞,其通过阿托品预处理或双侧迷走术而成11..在过敏性哮喘的豚鼠模型中,在气道平滑肌肉增厚和收缩性的增加,以及通过反复接触过敏原诱导的粘液腺肥大,戈尔特细胞数和嗜酸性粒细胞瘤的突出作用也已经显示出致乙酰胆碱的突出作用12.,13..噻托溴铵是一种长效毒蕈碱受体拮抗剂,可防止过敏原诱导的气道重塑的这些不同方面12.,13..噻托溴铵的抗重塑作用与布地奈德相当13.据表明,除了其支气管扩张作用外,抗胆碱能器的治疗效果可能有助于减少气道重塑和肺炎。
在本研究中,我们通过每日食管内盐酸灌注小鼠建立慢性gord诱导的肺炎症的实验模型21天,比较阿托品、噻托溴铵和地塞米松在预防肺炎症的各个方面,包括气道重塑,细胞聚集成肺,并使气道平滑肌收缩。
材料和方法
动物
选用来自上海SLAC实验动物有限公司(中国上海)的BALB/c雄性小鼠,8周龄,体重18-24 g。所有实验均按照上海交通大学(中国上海)的实验动物护理和使用指南进行。
GORD诱导的慢性气道炎症小鼠模型
使用校准的进料管将小鼠暴露于酸性溶液(0.3ml; 0.1n HCl和0.5%胃蛋白酶)进入食道两次的远端部分。对照动物暴露于盐水的食管滴注中。在酸性溶液的每次灌注之前1小时,用地塞米松(1 mg·kg)处理小鼠−1)或阿托品(1 mg·kg)−1)腹膜内施用,或用噻托溴铵(5μg或25μg·kg−1使用超声波雾化器4021(上海宿舍医疗器械,中国上海),在腔室中掺入20分钟的雾化20分钟。根据先前测试的剂量选择偶像塞酮,阿托品和噻托吡钠的剂量10.,12.,14..
肺炎评价:支气管肺泡灌洗测量和肺组织学
用氨基甲酸乙烷使动物进行安乐死(100 mg·kg−1I.P.)在最后一次暴露于酸性溶液后24小时(第22天)。然后打开胸壁,用心脏穿刺放血。
心脏穿刺后立即灌注并提取1 mL PBS进行支气管肺泡灌洗(BAL)通过气管插管。重复两次,并将回收的BAL液(BALF)汇集。4℃,1,500×g离心5 min,上清-70℃保存,检测白细胞介素(IL)-8和可溶性细胞间粘附分子(ICAM)-1。IL-8和ICAM-1检测采用ELISA试剂盒(Rapidbio Lab, Langka Trade Co. Ltd, Shanghai, China)。用1ml PBS重悬细胞颗粒,用血球计计数细胞总数。在单个小鼠BAL样本的细胞旋涂片上测定巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的差异计数,计数400个细胞后用Wright-Giemsa染色。结果用细胞号×10表示6·L.−1巴尔夫。
在BALF回收后立即除去食管和右肺,用PBS冲洗,用10%磷酸盐缓冲的福尔马林灌输并用相同的溶液固定18-24小时。然后将通过肺的放射性部分切割,嵌入石蜡中,厚度为8μm。将载玻片用Haematoxylin和eosin(H&E)染色,并以两个组织学家以盲目的方式检查。使用image-pro加上6.0软件(奥林巴斯,中国),在10个随机的非重叠位置测量支气管上皮和平滑肌层的厚度在H&E染色的部分中测量。在七个中等大小的支气管(测量腔直径250-400μm)上计算平均厚度,最大和最小直径的比例<2,以确保气道没有倾斜切割。食道的区段如肺组织所述治疗。
气道功能:等距张力测量
在Balf恢复后立即,除去气管并没有浆膜结缔组织制备。安装单环制剂用于含有改性的克雷斯 - Henseleit(KH)溶液的器官浴中的等距记录(MM:NaCl 118.0的组成; KCl 4.7; CACL22.5;NaHCO3.25.0;MGSO41.2;kh.2阿宝41.2;葡萄糖11.0;EDTA·娜20.5),保持在37°C并用95%o连续加入2和5%的公司2.每个环制剂在0.5g的静止张力下垂直地连接到力 - 位移换能器。使得制备用于≥1h平衡,在此期间每15分钟更新缓冲溶液。将静止张力重新调整至0.5g,并用40mM KCl预生气探测气管环。使用PowerLab 8SP寿命分析系统(上海上海上海贸易有限公司,中国上海贸易有限公司)记录等距收缩。在透过≥30分钟的时间内彻底洗涤组织后,使用0.5对数增量构建累积浓度 - 响应曲线至乙酰胆碱(1nm-3mm)。气道等距张力的变化表示为生成的力(g)和pec50,即。-日志10.乙酰胆碱浓度的50%产生的最大力(EC50.).欧洲委员会50.根据每个浓度响应曲线的对数回归计算。
药物
Tiotropium购自电话化学有限公司(济南,中国),地塞米松购物从潼洋药业公司(上海,中国)购买,阿托品和乙酰胆碱由Sigma Chemical(圣路易斯,Mo,USA)购买。所有其他化学品都是分析级。
数据分析
所有数据都显示为平均值±扫描电镜.各组之间的差异使用方差分析,然后在适当的情况下对选定的配对进行Dunnett t检验。在p值<0.05时,平均值之间的差异被认为是显著的。所有统计分析均使用Prism 5.0版本(Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA)进行。
结果
食管反复灌注盐酸引起食管炎和肺部炎症
暴露于HCl的小鼠表现出与肌肉粘膜中炎症细胞的令人印象深刻的炎症性渗透相关的食管分层鳞状上皮的一致侵蚀。肌肉粘膜的厚度没有显着改变(数据未显示)。
肺组织病理学显示HCl暴露导致多核吞噬细胞、淋巴浆细胞和巨噬细胞在气道壁、支气管周围和细支气管周围区域的显著浸润。在某些区域可以观察到含有生发中心的淋巴滤泡的形成(图1a)⇓和b相对C和D)。在呼吸道内部观察到含有多核吞噬细胞,淋巴基浆和巨噬细胞的炎症粘液渗出物的积累。此外,注意到间质肺炎的组织学特征,肺泡壁增厚,通过多核吞噬细胞和与拥挤毛细血管相关的淋巴网状细胞渗透。气道壁改造的形态学分析显示出与弱但显着平滑肌肉增厚相关的显着上皮增厚(图2⇓).通过BAL分析从气道中提取的细胞,发现细胞总数显著增加(1.8倍)。差异细胞计数也显示巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的数量显著增加,与生理盐水对照组相比,分别增加了1.7倍、2.0倍和3.1倍(图3)⇓).BALF嗜酸性粒细胞数量没有增加。此外,BALF中IL-8和ICAM-1的浓度显着升高(图4⇓).
减少噻托溴铵和阿托品治疗小鼠的肺部炎症
用雾化的噻托吡钠治疗小鼠(25μg·kg−1)或腹腔注射阿托品(1 mg·kg)−1)暴露于盐酸后,炎症细胞浸润明显减少,肺泡壁毛细血管充血(图1e)⇑和F,G和H分别)。在用5μg·kg处理的小鼠组中观察到上皮增稠的显着性降低−1tiotropium。然而,在三组服用抗胆碱能药物的小鼠中,平滑肌增厚没有显著降低,但平滑肌厚度与未接触HCl的对照组小鼠没有显著差异(图2)⇑).
用噻托溴铵或腹膜内阿托品治疗的小鼠,BALF中的细胞数量也减少(图3)⇑).以5 μg·kg噻托溴铵处理小鼠−1和25μg·公斤−1,HCl诱导的BALF细胞数的增加达到76%和89%(总细胞),79%和91%(巨噬细胞),83和89%(淋巴细胞),70%和77%(中性粒细胞).在用阿托品处理的小鼠中,HCl诱导的HCl诱导的BALF细胞数增加达到63%(总细胞),71%(巨噬细胞),65%(淋巴细胞)和54%(中性粒细胞)。用噻托溴铵和阿托品处理的小鼠之间的BALF细胞数没有显着差异。通过阿托品和最高剂量的Tiotropium降低了Balf中的IL-8和ICAM-1浓度(图4⇑).
用地塞米松处理的小鼠中的肺炎
小鼠给予地塞米松(1 mg·kg)−1I.P.)在暴露于HCl中表现出肺炎的降低(图1I⇑和j),上皮增厚明显减少,平滑肌增厚未见改变(图2)⇑).地塞米松也显著抑制支气管肺泡炎症细胞的募集(图3)⇑).BALF细胞数量的减少达到93%(总细胞),98%(巨噬细胞),95%(淋巴细胞)和81%(中性粒细胞)。地塞米松可降低BALF中IL-8和ICAM-1的浓度(图4)⇑).
噻托溴铵、阿托品和地塞米松对乙酰胆碱增强小鼠气管收缩的抑制作用
在食道远端连续3周每日两次的盐酸灌注增强了小鼠气管环收缩对乙酰胆碱累积的响应(图5)⇓).对乙酰胆碱的最大收缩响应从盐水暴露的小鼠中的0.35±0.02g增加到0.55±0.06g的HCl暴露小鼠(P <0.001)。然而,对乙酰胆碱的敏感性不受影响(PEC50.对于盐水和HCl暴露的小鼠,分别为5.7±0.3g和6.0±0.7g)。含有噻托溴铵的治疗(25μg·kg−1)和阿托品完全阻止了HCl暴露诱导的最大收缩的增加(25μg·kg−1噻托溴铵0.32±0.04 g和阿托品0.41±0.02 g(图5)⇓)))。对乙酰胆碱的敏感性也没有改变(25μg·kg−1tiotropium压电陶瓷50.5.4±0.4 g和阿托品pEC50.5.4±0.2g)。同样,用地塞米松预处理完全阻止了HCl曝光(最大响应0.37±0.23g)引起的收缩性增加,没有对乙酰胆碱的敏感性的改变(PEC50.5.5±0.3 g)。
讨论
本研究的主要发现是,气道重塑,炎性细胞浸润的肺部和气道反应性的增加乙酰胆碱引起的每天的滴剂,盐酸为21天,老鼠的食管可以部分甚至大大防止毒蕈碱的受体拮抗剂,包括噻托溴铵,一种广泛用于慢性阻塞性肺病患者的长效抗胆碱能药物。我们之前在豚鼠实验中发现,急性食管内盐酸灌注引起的气道血管泄漏包括迷走神经末段的乙酰胆碱释放,可被阿托品阻断,并通过激活M1和M3受体介导9.在之前的研究中,结扎了食管的上部,以防止HCl刺激喉,并确保胆碱能反射诱导的气道渗漏来自食管9.然而,在之前的实验条件下,我们使用浓度远高于生理范围的HCL (1n)来触发胆碱能反射。在本研究中,由于每天两次灌注HCl,持续21天,因此无法结扎食管上部,但我们使用生理范围内的HCl浓度(0.1 N)15..Oesophago-Laryngeal回流以及HCl的微量散,在该慢性模型以及胃含量的微痉挛中,如一些HCl暴露未经处理的小鼠的气道中的微观食物碎片的观察所提出的(数据未显示)。胃含量的肺部微痉挛也已在慢性呼吸症状的儿童中证明16.,17..用盐酸刺激喉或气管比食管刺激造成更大的支气管收缩18.- - - - - -20.暗示Oesophago-Laryngeal回流是一种更可能的支气管混凝土和气道炎症的机制,与GORD相关的支气管混凝土和气道炎症而不是食管 - 支气管反射。动物的研究结果表明,气管刺激性激活引起的支气管间涉及恶化介导的反射21..因此,除微吸入外,乙酰胆碱似乎通过起源于食道或上呼吸道的胆碱能反射参与了与GORD相关的肺改变。此外,非神经元乙酰胆碱释放从炎症和上皮细胞5也可能有助于慢性GORD模型中气道炎症和高反应性的发展。
目前的结果表明,两者的效力I.P.雾化给药阿托品或噻托溴铵在防止气道重塑和肺部炎症细胞浸润方面与I.P.注射地塞米松。在我们的GORD模型中,气道上皮和平滑肌厚度的增加与之前报道的小鼠慢性暴露于过敏原后的增加相比相当微弱22..高剂量的噻托溴铵,阿托嘌呤和地塞米松完全阻止了这种上皮增厚的适度增加。乙酰胆碱通过激活M1毒蕈碱受体和烟碱受体刺激大鼠气道上皮细胞的增殖4,可能有助于解释阿托嘌呤和噻托铵对上皮增稠的抑制作用的观察。在用抗胆碱或地塞米松治疗的小鼠中观察到平滑肌厚度的不显着增加,但未经处理的小鼠的弱增加阻止了任何关于这些药物的预防效果的任何坚决结论。然而,在暴露于过敏原的敏感的豚鼠中,噻托吡钠先前被证明可以显着防止气道平滑肌增厚的增加,但比水果苷效果较小13..在本研究中,噻托溴铵、阿托品和地塞米松明显抑制了未处理小鼠暴露于盐酸的离体气管收缩力的显著增加。tiotropium的抑制效应不太可能因为残余的封锁造成的毒蕈碱的受体持久性的长效毒蕈碱的拮抗剂气管(上届政府> 24小时后),因为没有残余影响methacholine-induced豚鼠气管收缩之前一直显示后24 h在活的有机体内曝光12.,并且由于与阿托品观察到类似的抑制作用,因此是一种短代抗胆碱能23..我们没有研究气管平滑肌厚度,但周围气道厚度的微弱增加并不支持收缩力的增加与平滑肌质量的增加之间的关系。在Bos之前的一项研究中et al。13.,与外周气道相比,大气道对methacholine的收缩性增加,而气道平滑肌含量没有随之改变,提示中央气道在反复过敏原刺激后获得了高收缩表型。正如在本研究中观察到的,噻托溴铵完全阻止了该变应原驱动的肺炎症模型中收缩力的增加。
噻托溴铵、阿托品和地塞米松对小鼠食管反复灌注盐酸可明显抑制多核吞噬细胞、淋巴浆细胞和巨噬细胞对气道壁及支气管周围和细支气管周围区域的浸润。肺组织的细胞浸润与BALF中巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量的增加以及BALF中IL-8和ICAM-1水平的增加有关。活化的中性粒细胞在肺部炎症和氧化损伤中起着关键作用。IL-8(各种肺细胞,包括巨噬细胞和上皮细胞产生的中性粒细胞的主要趋化剂,以及sICAM-1,主要由肺泡内壁液中的肺泡上皮细胞产生)可以激活白细胞24.,25..在患有GORD和哮喘的症状的儿童中,中性粒细胞症先前已被证明与BALF中的IL-8水平正相关26.,中性粒细胞和IL-8水平被证实与近端反流事件的数量相关16..体外研究表明,毒蕈碱受体刺激,特别是M3受体亚型,触发了参与中性粒细胞募集的促炎介质的释放,例如IL-8和白硫代(LT)B.4,来自气道平滑肌、上皮细胞和肺泡巨噬细胞27.- - - - - -29..引发和LTB4也参与单核细胞的趋化作用24.,30..在最近的三项研究中27.- - - - - -29.,噻托溴铵抑制IL-8和LTB的释放4,至少部分解释了噻托溴铵或阿托品阻断毒蕈碱受体对我们本研究模型气道中性粒细胞和巨噬细胞数量增加的预防效果。
总之,本研究结果表明,阿托品或噻托尼亚毒素受体阻断通过慢性巨核的动物模型中的气道炎症和重塑。两种毒蕈碱拮抗剂的预防疗效与地塞米松的预防效果类似。本研究延伸了噻托诺硫醇诱导的气道炎症和改造对不同模型的肺炎症的有益作用,提供了进一步的证据表明抗胆碱能器可能超过哮喘和COPD中的支气管扩张的有益效果,特别是在患者患者中来自GORD。
支持声明
基金资助:国家自然科学基金项目(no. 30600269, no. 30873109);上海市科委重点项目(no. 30600269, no. 30873109);基金资助:国家重点基础研究发展计划资助项目(no. 09JC1408800);2010 cb529806)。
感兴趣的语句
P. Devillier的利益声明可在www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
- 收到了2009年9月4日。
- 接受2009年11月3日。
- ©人队