摘要
维生素D结合蛋白的群特异性成分(Gc)变体对调节抗细菌免疫的维生素D代谢物的亲和力不同。我们进行了研究,以确定Gc基因型是否与结核病(TB)易感性相关。
以下受试者被纳入病例对照研究:在英国,123名成年结核病患者和140名对照组,全部来自古吉拉特邦的亚洲族裔;在巴西,130名成年结核病患者和78名对照组;在南非,有281名结核病儿童和182名控制儿童。确定Gc基因型,并比较其发生频率与控制。回顾性获得139名古吉拉特邦亚洲人的血清25-羟维生素D (25(OH)D)浓度,并根据维生素D状况进行病例对照分析。对36例古吉拉特邦亚洲结核病接触者进行了干扰素(IFN)-γ释放检测。
与Gc1/1基因型相比,Gc2/2基因型与古吉拉特邦亚洲人的活动性结核病易感性密切相关(OR 2.81, 95% CI 1.19-6.66;p = 0.009)。当血清25(OH)D <20 nmol·L时,这种相关性仍存在−1(p = 0.01)但如果血清25(OH)D≥20nmol·L−1(p = 0.36)。
Gc2等位基因的携带与古吉拉特邦亚洲结核病接触者结核菌素刺激IFN-γ释放PPD的增加有关(p = 0.02)。在研究的其他民族中,没有发现Gc基因型与结核易感性之间的关联。
结核病是全球主要的死亡原因。在许多情况下,维生素D缺乏与活动性结核病的易感性有关1补充维生素D可增强抗细菌免疫力2.皮肤在紫外线(UV)照射下合成维生素D,并通过肝脏代谢形成25-羟基维生素D (25(OH)D),这是维生素D循环的主要代谢物,也是公认的维生素D状态指标。然后,25(OH) D进一步羟基化,形成1,25-二羟基维生素D (1,25(OH))2D)免疫调节代谢物,通过多种机制增强抗细菌活性,包括诱导具有抗结核活性的抗菌肽3.,4并且抑制基质金属蛋白酶酶意义于肺细胞外基质的降解5.
循环中的维生素D代谢产物与维生素D结合蛋白(DBP)结合,DBP是一种高表达的多功能58-kDa血清糖蛋白,编码于4号染色体上。DBP位点是已知的最具多态性的位点之一6.两个常见的416密码子多态性(手枪→插科打诨,Asp→Glu)和420年(ACG→亚美大陆煤层气有限公司,用力推→赖氨酸)的类似基因的外显子11(定义为限制性内切核酸酶的存在网站HaeIII StyI,分别)产生的三个主要电泳变体类似,称为类属特异性的组件1快(Gc1F) Gc1 (Gc1S)和Gc2缓慢。这些变异在功能特征上有所不同:据报道,Gc1F和Gc1S变异比Gc2变异对25(OH)D有更大的亲和力7,可能导致更有效地将25(OH)D传递到目标组织,而Gc2变体与25(OH)D、1,25(OH)循环浓度的降低相关。2D和菲律宾8,9.因此,我们推断拥有DBP的Gc2变体可能与结核病易感性有关,并在三个不同的环境下进行了病例对照研究,以检验这一假设。我们还进行了功能性研究,以确定健康结核病接触者全血中抗原刺激的干扰素(IFN)-γ释放是否因Gc基因型而异。
方法
人口研究
在三个地点招募病例对照研究参与者(表1)⇓).1)从1993年到2004年,在英国伦敦Northwick Park医院招募了123名成年结核病患者和140名健康的成年结核病接触者,他们都是古吉拉特邦的亚洲族裔。2) 2000年至2003年,在南非开普敦红十字儿童医院招募了281名结核病儿童(210名科萨人和71名开普敦有色人种)和182名健康的结核病接触儿童(163名科萨人和19名开普敦有色人种)。3) 130年成人结核病患者(55白色,31日黑色,44混合的少数民族)和78名健康成人控制(49个白人,11个黑人,18混合的少数民族)在学院招募了尽管我们Evandro恰加斯(IPEC) Fiocruz市政卫生中心,里约热内卢,巴西,从2004年到2007年。
结核病的诊断建立在抗酸杆菌涂片阳性和/或抗酸杆菌培养阳性的基础上结核分枝杆菌在所有成人病例和33%的儿科病例中;其余儿科病例的诊断依据是世界卫生组织(世卫组织)的儿童结核病诊断标准10,42%的分类为可能的TB和25%分类为具有可能的TB。不包括已知艾滋病毒感染的患者和服用免疫抑制药物的患者。在伦敦和里约热内卢的参与的TB诊所和保健中心招募成人结核病联系:与TB患者的家庭接触的历史;没有活跃结核病的症状;并与在研究中作为结核病案件的任何患者进行遗传无关。儿童结核病联系人是通过定位邻近童年TB案件的家庭毗邻的儿童居住的儿童招聘。在可能的情况下,确保儿童控制与儿童结核病案件无关。所有成年参与者都提供了知情同意,就像儿童参与者的父母一样。允许进行案例对照研究的允许从英国(Harrow Rec Ref.1646),南非(开普敦大学REF.013/2000)和巴西(IPEC REF.00.00.009.000-04和里约热内卢市政健康中心REC参考。S / CRH / DRH / DIC3)。
从2002年到2005年,在英国伦敦Northwick Park医院(n = 28)和Newham胸科诊所(n = 8)招募了36名健康结核病接触者参加维生素D补充临床试验,并对他们进行了功能研究。整个研究人群的特征在其他地方也有报道11.36名参与者的亚组,其结果在这里显示,是根据自分配的古吉拉特邦亚洲族裔和全血IFN-γ释放试验(IGRA)的可用性在随机化之前进行的。该研究得到了东北伦敦和哈罗研究伦理委员会的批准(REC参考。P/02/146和EC 2759),并获得所有参与者的书面知情同意。
基因分型
使用DNA MIDI KIT(QIAGEN,LEWES,UK)从外周血样品中提取基因组DNA。通过PCR扩增GC基因的483-BP片段11的外显子11。包括:50μl·ml的2μlDNA−1;11.1μL H2O;2 μL 10× PCR缓冲液;0.4 μL 25mm氯化镁2;0.4 μL 10 mM脱氧核苷酸三磷酸;0.1 μL HotStar Taq聚合酶(Qiagen);20 μM引物各2 μL。引物序列为5 ' - aaataatgagcaaatgaaagaac -3 '(正向)和5 ' - CAATAACAGCAAAGAAATGAGTAGA-3 '(反向)。循环条件为95°C 15 min, 94°C 45 s, 51°C 45 s, 72°C 45 s, 35个循环,72°C 7 min。PCR产物分别用限制性内切酶HaeIII(37°C下4小时)和StyI(37°C下过夜)(New England Biolabs, Mississauga, OT, USA)进行消化。HaeIII酶切产生297-和186-bp的h等位基因片段,而StyI酶切产生305-和178-bp的s等位基因片段。消化产物在2%琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色可见。限制位点的存在用小写字母表示(h代表HaeIII, s代表StyI),缺失用大写字母表示(h代表HaeIII, s代表StyI)。 Gc genotype was assigned as seen in table 2⇓.
测定25(OH)D浓度
在参与国际维生素D外部质量评估项目的临床生物化学实验室(www.deqas.org).对于活动性结核病参与者,在诊断时测定血清25(OH)D浓度。维生素D缺乏定义为血清25(OH)D <20 nmol·L−112.
IGRA.
本研究中使用的IGRA在其他地方也有描述13.用rmi -1640 (Life Technologies, Paisley, UK)稀释1:10的静脉血3个重复样本,1000 U·mL培养−1PPD (Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark), 2.5 μg·mL−1重组ESAT-6或5 μg·mL−1培养滤液蛋白(CFP)-10 (Lionex, Braunschweig,德国),37°C, 5% CO2.96 h抽吸上清,ELISA法测定IFN-γ浓度。
统计分析
由于相似的功能特性7将Gc1F和Gc1S等位基因载体结合,共产生3个基因型:Gc1/1、Gc2/1和Gc2/2。列联表使用卡方检验进行分析,除非>表中20%的细胞预期频率小于5,否则使用Fisher精确检验。通过计算HaeIII和StyI等位基因随机组合的预测单倍型频率,并与观察频率进行卡方检验,评估连锁不平衡;D '是用列万廷方程计算出来的14.组间平均年龄比较采用未配对t检验和单因素方差分析,血清中值25(OH)D浓度比较采用Kruskal-Wallis检验。采用卡方检验检验基因型与结核易感性之间的相关性,并采用二元logistic回归分析调整年龄和性别的OR。数据使用SPSS(16.0版本;SPSS。芝加哥,IL,美国)和GraphPad Prism(版本4.03;GraphPad Software Inc.,圣地亚哥,CA, USA)软件包。
结果
参与者特征:案例控制研究
病例对照研究参与者的特征见表3⇓.古吉拉特邦亚洲人的病例和控制在年龄或性别分布方面没有差异。在病例中男性的比例过高与在开普敦招募的参与者(科萨:55.2与41.1%男性,p = 0.007;开普有色:47.9与21.1%男性,p = 0.04)和里约热内卢de Janeiro(黑色:61.3与男性27.3%,p = 0.01;民族混合血统:63.6与38.9%的男性,p = 0.02)。在开普敦科萨族参与者中,病例的平均年龄低于对照组(5.2岁)与(6.1岁,p = 0.002),并高于对照组(38.7岁)与29.6 YRS,P <0.001)。
DBP等位基因频率因种族而异
DBP等位基因频率在不同种族间差异显著(p<0.0001;表4⇓).Gc2等位基因频率在伦敦的亚洲古吉拉特邦参与者和里约热内卢的白人参与者中最高(分别为35.9和33.2%),而在里约热内卢的里约热内卢和开普敦的科萨人参与者中最低(分别为11.9和4.6%)。Gc1S等位基因的种族分布也类似(伦敦的古吉拉特邦亚洲人47.9%,里约热内卢de Janeiro白人参与者41.8%,里约热内卢de Janeiro黑人参与者19%,开普敦科萨人参与者7.9%)。相反的民族分布观察Gc1F等位基因,这是最常见的科萨人参与者在开普敦和黑人参与者在里约热内卢里约热内卢(分别为69.0%和87.5),和最常见的白人参与者里约热内卢里约热内卢和古吉拉特语亚洲参与者在伦敦(分别为16.2%和25.0)。在里约热内卢和开普敦招募的种族混合参与者中发现了所有三种等位基因的中间频率。在所有被研究群体中,这两个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。该位点在古吉拉特邦亚裔参与者(D ' = 0.52, p<0.0001)、里约热内卢白人参与者(D ' = 0.36, p<0.0001)、里约热内卢de Janeiro (D ' = 0.15, p<0.0001)和开普敦(D ' = 0.06, p = 0.0002)的种族混合人群中存在连锁不平衡。但在开普敦的科萨人(p = 0.08)或里约热内卢里约热内卢的黑人参与者(p = 0.10)中没有。
Gc2等位基因的携带与古吉拉特邦亚洲人对结核病的易感性有关
考虑到等位基因频率因民族而异,将DBP变异频率按民族分层进行病例对照分析。在古吉拉特邦亚洲参与者中,Gc基因型与活动性结核病相关(p = 0.04;表5⇓).与Gc1/1相比,Gc2/2未调整的OR为2.81 (95% CI 1.19-6.66;p = 0.009),而Gc2/1与Gc1/1未经调整的OR为1.69 (0.96-2.96;p = 0.052)。基因型Gc2/1和Gc2/2的未调整OR合并与GC1 / 1为1.89(1.11-3.22; p = 0.012)。这些协会通过调整年龄和性别(调整或GC2 / 2)来禁止与GC1 / 1为2.83(1.27-611),P = 0.01;调整或GC2 / 1与Gc1/1为1.73 (1.01-2.96),p = 0.045;调整或为Gc2/1和Gc2/2合并与Gc1/1为1.94 (1.17-3.23),p = 0.01)。在开普敦(Cape Town)或里约热内卢(里约热内卢de Janeiro)研究的任何人群中,无论在调整年龄和性别之前或之后,DBP基因型频率在病例和对照组之间均未观察到具有统计学意义的变化。
在古吉拉特邦的亚洲人中,维生素D的状态并不随DBP的变异而变化
在之前的一项研究中,我们发现古吉拉特邦亚洲人的维生素D缺乏与结核病易感性有关15.此后,其他研究报道血清25(OH)D浓度随Gc基因型而变化,最低的是Gc2等位基因携带者8,9.我们对古吉拉特邦亚洲人血清25(OH)D浓度是否因Gc基因型而异感兴趣。由于没有为此目的前瞻性地收集血清样本,我们对所有古吉拉特邦亚洲参与者的常规血清25(OH)D浓度检测结果进行了回顾性研究。123例中有84例和140例对照中有55例得到了结果。维生素D缺乏(血清25(OH)D <20 nmol·L)−1)在结核病病例中更为常见与管制(影响84人中的60人与31中的55个)但这种差异没有达到统计学意义(P = 0.07)。在具有不同基因型的个体之间观察到中位血清25(OH)D血清浓度或维生素D缺乏患病率没有显着差异(中位血清25(OH)D:17.0与12.0与10.0 nmol·L−1Gc1/1、Gc1/2和Gc2/2基因型,p = 0.28;维生素D缺乏症患病率:35 / 58与63分之43与对于GC1 / 1,GC1 / 2和GC2 / 2基因型中的18个中13分,P = 0.53)。
在古吉拉特邦亚洲参与者中,Gc基因型和结核病易感性之间的关联因维生素D状态而不同
接下来,我们通过对维生素D缺乏参与者和非缺乏参与者进行单独的应急分析,研究了古吉拉特邦亚洲人的Gc基因型和结核病易感性之间是否因维生素D状况而不同(表6)⇓).在缺乏维生素d的古吉拉特邦亚洲人中,我们发现Gc基因型与结核病易感性密切相关,60例维生素d缺乏病例中有13例存在Gc2/2与在31个缺乏维生素d的对照组中为零(p = 0.01)。相反,在血清25(OH)D≥20 nmol·L的古吉拉特邦亚洲人中,Gc基因型与结核易感性没有相关性−1(p = 0.36)。确定Gc基因型和维生素D状态是否相互作用影响TB易感性的统计分析尚不确定,因为列联表中维生素D缺乏对照Gc2/2基因型的零值(表6)⇓)导致未定义或。
Gc2等位基因的携带与ppd刺激的古吉拉特邦亚洲结核病接触者全血IFN-γ释放增加有关
最后,我们在36名古吉拉特邦亚洲结核接触者中研究了IFN-γ对分枝杆菌抗原的应答是否因Gc基因型而异,其特征如表7所示⇓.不同Gc基因型的受试者性别比例、卡介苗(BCG)状态、结核菌素皮肤试验反应性、暴露部位或维生素D状态无显著差异,但不同Gc基因型受试者的平均年龄差异有统计学意义(55.3)与41.3与基因型GC2 / 2,GC2 / 1和GC1 / 1的34.9 YRS,P = 0.03)。在GC2 / 2和GC2 / 1基因型的Tb触点中,中位PPD刺激的IFN-γ浓度较高与Gc1/1基因型(790.8 .与663.5与60.5 pg·毫升−1分别,p = 0.02;图1⇓);不同基因型结核接触者间ESAT-6或cfp -10刺激的IFN-γ浓度无差异(表7)⇓).
![图1 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/35/5/1106/F1.medium.gif)
通过基团特异性组分(GC)基因型在功能性研究参与者中纯化的蛋白刺激干扰素(IFN)-γ释放的纯化蛋白质衍生物。
讨论
我们已经展示了在伦敦生活在古吉拉特亚洲人的DBP和TB的GC基因型之间的关联。通过维生素D地位分析该分析的地位揭示了这种关联仅限于具有深远的维生素D缺乏的参与者。
在里约热内卢和开普敦研究的人群中,没有观察到Gc2等位基因携带与结核病易感性之间的关联。这些群体的Gc2等位基因频率低于古吉拉特邦亚洲人,因此Gc2携带者的绝对数量较少(表4)⇑);我们的研究可能还不足以在这些人群中发现相关性。另一种解释是,在里约热内卢里约热内卢和开普敦里约热内卢(纬度22°S)和开普敦(纬度33°S)的人口可能比在伦敦(纬度51°N)生活的人暴露于UVB的更多。因此,在这些环境中,严重缺乏维生素D的情况可能要少得多。如果像我们假设的那样,Gc2等位基因和TB易感性之间的关联仅限于严重缺乏维生素D的个体,那么里约热内卢和开普敦的维生素D缺乏患病率低可能可以解释这种关联在这些环境中没有复制。这一解释也可以解释先前在科威特研究的其他人群中Gc基因型与结核易感性之间缺乏关联的原因16和印度17.
先前有报道称,携带Gc2等位基因的个体具有较低的DBP和25(OH)D循环浓度8,9,18,已经归因于GC2等位基因的基因产物的速度比GC1等位基因的基因产物代谢的事实19.因此,缺乏维生素d的Gc2等位基因携带者可能具有特别低的循环浓度的25(OH) D-DBP复合物。受体介导的25(OH) D-DBP复合物内吞作用此前已被证明是诱导肾脏和乳腺细胞中维生素d介导的生物活性所必需的20.,21.如果25(OH) D-DBP复合物同样是启动维生素d诱导的抗细菌反应所必需的,那么在缺乏维生素d的Gc2等位基因携带者中降低该复合物的循环浓度可以解释我们所报道的相关性。还需要进一步的研究来确定25(OH) D-DBP复合物的循环浓度是否根据Gc等位基因而变化,以及研究受体介导的25(OH) D-DBP复合物的内吞噬是否对诱导维生素d诱导的抗细菌反应至关重要。
我们发现Gc等位基因频率的一个惊人的种族差异,这与已发表的文献报道一致,即肤色深的人群具有更高的Gc1F等位基因频率22.报告说,UVB的皮肤渗透在具有色素皮肤的个体中减少23并且,DBP的GC1变体对25(OH)D具有更大的亲和力,而不是GC2变体24这提高了Gc1变异在有色皮肤患者中具有生存优势的可能性,因为它们能将25(OH)D更好地传递到目标组织。如果是这样的话,那么在白种人群体中观察到的Gc2等位基因频率的增加意味着在太阳辐射有限的条件下,拥有这种等位基因会带来生存优势。与这一假设一致的是,拥有Gc2等位基因与其他几种疾病的风险降低有关,包括乳腺癌9,慢性阻塞性肺疾病25和骨折26.我们还观察到,在古吉拉特邦亚洲参与者、白人参与者和种族混合人群中,密码子416和420位点的等位基因存在连锁不平衡,但在科萨族或黑人参与者中没有。这一现象已经在其他编码单核苷酸多态性的多种族人群中得到证实,并可能归因于大约800 - 1600代以前从非洲迁移过来的亚洲和欧洲人群所经历的“瓶颈”27.
我们的功能研究显示,携带Gc2等位基因的TB接触者比Gc1纯合子具有更高的PPD刺激IFN-γ反应,后者对PPD的IFN-γ反应低或检测不到;所有结核接触者对差异1编码抗原区域的IFN-γ反应低或检测不到。ESAT-6和CFP-10在感染早期分泌,此前在结核接触者的纵向研究中曾报道IFN-γ对这些抗原的应答逆转并持续结核菌素反应,这可能代表潜伏的结核感染28.因此,我们的数据可能表明,Gc1纯合子对潜在结核病感染的获得相对耐药,而Gc2等位基因携带者更容易感染。
我们的研究有一些限制。古吉拉蒂亚洲种族是自我分配的,虽然社区是遗传均匀的15,不能排除民族混合的可能性。在亚洲古吉拉特邦病例中,血清25(OH)D浓度仅为68%与39%的古吉拉特邦亚洲人控制。产生这种差异的原因可能是,临床医生在结核病病例中检测维生素D水平的门槛低于结核病接触者。由于Gc2/2基因型在对照组中比病例中更少见,已知维生素D状态的Gc2/2对照组的绝对数量很小(n = 2)。然而,可获得25(OH)D的参与者的比例没有因Gc基因型而不同,因此该分析的结果不能归因于选择偏差。应在维生素D缺乏风险人群中进行更大规模的前瞻性评估25(OH)D循环浓度的研究,以确定严重维生素D缺乏和Gc2基因型是否相互作用增加对TB的易感性。
支持声明
这项工作得到了以下机构的支持:授予A.R. Martineau的Scadding-Morriston Davies联合呼吸道医学研究奖学金;授予st . t . Anderson的贝特奖学金;惠康信托基金(参考066321和072070);以及菲奥克鲁兹/巴西卫生部。资助机构没有参与:研究的设计或进行;数据的收集、管理、分析和解释;或手稿的准备、审查或批准。A.R. Martineau完全可以访问研究中的所有数据,并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。
感兴趣的语句
没有宣布。
致谢
作者的隶属关系如下。A.R.马丁内斯:康斯临床热带医学研究中心,伦敦伦敦帝国学院科学研究中心;保健科学中心,玛丽女王的医学和牙科,伦敦,伦敦,英国伦敦;美国医学研究所,英国矿山矿山研究所分枝杆菌研究。A.C.S.Leandro,M.A. Rocha和M.G.Bonecini-Almeida:LableatóriodemunologiaeImunogenética,Instituto de PesquisaClínicaevandroChagas,Fiocruz,Rio de Janeiro,巴西。英石。安德森,三。 Newton and M. Levin: Academic Dept of Paediatrics, Division of Medicine, Imperial College London, London, UK. K.A. Wilkinson: Division of Mycobacterial Research, National Institute of Medical Research, Mill Hill, UK; Institute of Infectious Diseases and Molecular Medicine, Faculty of Health Sciences, University of Cape Town, Cape Town, South Africa. M.P. Nicol: Institute of Infectious Diseases and Molecular Medicine, Faculty of Health Sciences, University of Cape Town, Cape Town, South Africa; Division of Medical Microbiology, Faculty of Health Sciences, and National Health Laboratory Services, University of Cape Town, Cape Town, South Africa. S.M. Pienaar and B.S. Eley: Paediatric Infectious Diseases Unit, Red Cross Children's Hospital, School of Child and Adolescent Health, University of Cape Town, Cape Town, South Africa. K.H. Skolimowska: Institute of Infectious Diseases and Molecular Medicine, Faculty of Health Sciences, University of Cape Town, Cape Town, South Africa. V.C. Rolla: Laboratório Clínico em Tuberculose e Micobacterias, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil. R.N. Davidson: Tuberculosis Clinic, North West London Hospitals NHS Trust, Northwick Park Hospital, Harrow, UK. S.A. Bremner and C.J. Griffiths: Centre for Health Sciences, Queen Mary's School of Medicine and Dentistry, Barts and The London, London, UK. R.J. Wilkinson: Wellcome Trust Centre for Research in Clinical Tropical Medicine, London, UK; Division of Mycobacterial Research, National Institute of Medical Research, Mill Hill, UK; Institute of Infectious Diseases and Molecular Medicine, Faculty of Health Sciences, University of Cape Town, Cape Town, South Africa.
作者要感谢:D. Shah(英国哈罗市诺斯威克公园医院感染和热带医学系),感谢她在查找本研究的患者记录方面的帮助;S. Rainbow和临床生物化学系(诺威克公园医院)的同事进行25(OH)D分析;巴兹和伦敦医学院(伦敦,英国)的R. Walton和B. Boucher对手稿进行了有益的讨论和审查。
- 收到了2009年6月2日。
- 接受2009年9月8日。
- ©ers Journals Ltd