文摘
肺泡弹性纤维的关键目标蛋白酶在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制。在当前的研究中,我们提出,应对受伤导致增强肺泡弹性蛋白基因表达在非常严重的慢性阻塞性肺病。
肺样本来自43例,其中包括11个非常严重的慢性阻塞性肺病(阶段4),10个捐助者、10和中度/重度慢性阻塞性肺病(2 - 3阶段)和12 non-COPD主题,分析了供实时rt - pcr和弹性蛋白mRNA表达原位杂交。肺泡弹性纤维的视觉使用哈特染色的部分冻结的COPD肺膨胀获得11 4期患者和三个供体肺。
与捐助者、non-COPD和阶段2 - 3慢性阻塞性肺病,弹性蛋白mRNA表达显著增加非常严重COPD肺(12改变),和本地化原位杂交诱导肺泡壁弹性蛋白的表达。与捐赠者相比,肺泡弹性纤维也组成一个更大的总肺组织的体积分数非常严重COPD肺(p < 0.01),但弹性纤维内容不是每个肺容积增加,锁链素内容并没有增加。
目前的研究表明增强肺泡弹性蛋白表达在非常严重的慢性阻塞性肺病。这种潜在的修复机制及其监管的效率仍有待证明。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制涉及小气道重构和肺气肿。互相连接的弹性纤维电缆促进协调扩张过程中肺泡呼吸和放松。肺气肿发展密不可分的破坏这些肺泡弹性纤维elastolytic蛋白酶与烟草烟雾诱发慢性炎症过程和/或与α的anti-protease不足等有关1抗胰蛋白酶缺乏症1。目前,尚未进行研究以确定是否损害肺泡弹性纤维在慢性阻塞性肺病的发展引发反应损伤弹性蛋白的表达。肺弹性蛋白表达通常在肺泡发展高峰,之后下降,几乎检测不到健康成人的肺。动物研究表明,肺胶原蛋白和弹性蛋白合成快速重新启动后滴注法的弹性蛋白酶,可以限制肺泡破坏的程度2。本研究的目的是确定是否有弹性蛋白表达的重启在严重的肺气肿,肺泡壁和肺泡弹性纤维密度量化严重肺气肿。
一旦形成,弹性纤维仍然非常耐用的正常、健康的肺3,但尿锁链素的浓度,使交联独有的弹性蛋白,增加COPD患者与控制。弹性蛋白降解的生化证据支持的发现改变了弹性纤维内容和形式的肺气肿4- - - - - -6。值得注意的是,弹性纤维密度从未被调查在非常严重的慢性阻塞性肺病,和潜在的尝试修复弹性纤维在非常严重的慢性阻塞性肺病却没有得到足够关注。
我们的分析非常严重的肺组织(阶段4)慢性阻塞性肺病证实一个健壮的感应在肺泡壁弹性蛋白的表达。这些数据表明,从非常严重COPD患者肺组织保留能力表达弹性蛋白损伤位点的精确弹性纤维。
材料和方法
研究对象
病人安排在肺移植后参与了这一研究机构审查委员会批准的标准建立和巴恩斯医院(圣路易斯,密苏里州,美国)。所有COPD肺移植患者没有相关的肺纤维化是合格的。肺从11个患有非常严重的慢性阻塞性肺病(阶段4)。移植供体肺不习惯(主要是因为最后的手术变化;n = 3)的供体肺切除来调整一个适当大小的肺移植(n = 7)被用于比较。肺样本也获得12 non-COPD和10中度/重度慢性阻塞性肺病(2 - 3阶段)对肺癌患者肺切除术。人口和肺功能数据收集了所有的病人。慢性阻塞性肺病诊断的基础上,建立了慢性阻塞性肺疾病的全球倡议共识声明7。个人获得了知情同意的患者。
研究设计
本研究的目的是探讨弹性蛋白基因表达和弹性纤维密度非常严重COPD肺。弹性蛋白基因表达了43例包括那些非常严重的慢性阻塞性肺病(n = 11)和中度/重度慢性阻塞性肺病(n = 10),连同non-COPD病人(n = 12)和捐助者通过实时rt - pcr和(n = 10)原位杂交。弹性纤维密度调查14夸大整个肺从11非常严重的慢性阻塞性肺病患者进行肺移植和三个供肺不用于移植。弹性纤维染色使用哈特的染色和量化的肺泡壁。肺泡弹性纤维密度之间的关系和地区性的肺气肿的组织学评估水平,计算机断层扫描(CT)扫描和3他扩散磁共振成像(MRI)进行调查。
方法
抽样方案和图像分析
移植非常严重COPD肺和移植的供体肺不习惯放在冰立即然后插管。完整的肺被冻结而膨胀与空气(13而言不啻在恒定压力2O)在循环77 K氮蒸汽移除在8小时内的移植,如前所述8。5非常严重的慢性阻塞性肺病两供体肺,肺和成像3他扩散磁共振成像进行冷冻过程之前,如前所述9。肺部CT成像的冻结膨胀了,在横向平面重建。冷冻的肺被切成2厘米厚的横向片(9到13片,取决于肺的大小)在同一个平面上的CT扫描,然后多核组织测量直径1.3厘米从每个片使用一个系统的统一的随机抽样系统。冷冻组织核心随后被分为形态分析和隔离的RNA和基因表达研究。四到六核每个病人被随机选择和研究。
取样的照片肺片是用来匹配样本CT和MRI图像;每个样本的位置仔细注意解剖标志。平均肺密度,表示Hounsfield单位(胡),确定地区的兴趣CT部分对应于每个核心使用ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/;美国马里兰州贝塞斯达)。的3他表观扩散系数(ADC)是由核磁共振为每个核心9。
肺样本来自供体肺切除(部分调整一个适当大小的肺移植),和non-COPD中度/重度COPD患者采用手术治疗,切除肺癌(避免地区受到肿瘤)保持冷冻和分为随后的组织学分析和隔离的RNA基因表达研究以同样的方式作为核心从肺移植。随着这些肺样本不是冰冻的,弹性纤维密度和形态测定分析没有进行这些样品;他们只用于实时rt - pcr和弹性蛋白原位杂交。
RNA分离和定量rt - pcr对弹性蛋白表达
从每个肺组织总RNA分离样品使用商业套装(RNAqueous;美国Ambion、奥斯汀、TX)。RNA的质量评估是一个安捷伦bioanalyser(美国安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。互补脱氧核糖核酸制备使用上标+(美国Carlsbard表达载体,CA) RT和随机六聚体启动。互补脱氧核糖核酸是然后进行PCR扩增弹性蛋白(外显子2 - 4)和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。使用引物5′-GGCCATTCCTGGTGGAGTTCC-3′的弹性蛋白正向引物5′-AACTGGCTTAAGAGGTTTGCCTCCA-3′的弹性蛋白反向引物,产生106个基点的产品,和5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′GAPDH向前底漆和5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′GAPDH反向引物,产生87个基点Stratagene MX 3000仪器(美国Stratagene拉霍亚,CA)。标准和离解曲线生成和结果使用Sybr绿色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)检测是使用ΔΔCt方法标准化。简单地说,一个ΔCt值计算为每个示例使用周期阈值(Ct)值GAPDH和弹性蛋白。弹性蛋白的折叠变化/ GAPDH是表示相对于供体肺的中值。ΔΔCt值的计算是通过减去中间ΔCt donor group的ΔCt non-COPD, 2 - 3阶段和第4阶段慢性阻塞性肺病患者。 The ΔΔCt values were converted to fold differences与捐赠者通过提高2的次方ΔΔCt (2-ΔΔCt)。
原位弹性蛋白mRNA的杂交
Digoxygenin-labelled反义或感觉riboprobes来自人类弹性蛋白原cDNA pHDE-1使直线化在体外转录(WI Promega,麦迪逊,美国)10。患者肺组织的固定部分和蛋白酶K消化,封锁与三乙醇胺和乙酸酐然后用变性杂交digoxygenin-labelled riboprobe隔夜60°C。杂交后,组织部分受到一系列洗包括与核糖核酸酶消化,治疗阻止代理和孵化与碱性磷酸酶抗体结合。色彩发展幻灯片与发色体基质1 - 3天然后孵化与核快红复染色。至少10个随机肺每核心领域进行分析。阳性细胞的数量原位杂交相对于肺泡壁细胞的总数是手动计算而蒙蔽样本的身份。
的形态学分析
肺泡大小的测量(平均线性拦截(L米)),在膨胀的组织获得11级4慢性阻塞性肺病和三个供体肺。组织学部分选择从每个核心建立stereological原则与苏木精和伊红染色11,12。至少10随机肺字段/核心使用计算机辅助分析数字图像分析项目,以前在我们实验室开发和测试9。膨胀的肺组织的细胞单位面积的数量也是手动计算而蒙蔽组织身份。
哈特的弹性蛋白染色和量化的弹性纤维密度
弹性纤维染色进行膨胀肺样本来自11级4 COPD肺和三个供体肺。患者肺组织部分(5μm) 0.25%高锰酸钾溶液中浸泡5分钟,清除5%草酸和浸泡在resorcin-fuchsin解决方案(保利科学湾海岸,纽约,美国)。洗后,部分与柠檬黄复染色。至少10个随机从每个肺组织肺哈特了染色的部分领域核心与数码相机捕捉20×放大并导入到图像专业+软件(MediaCybernetics、圣地亚哥、钙、美国)。量化每个组织的弹性纤维密度是通过确定组织的面积的比例在每个图像黑色(弹性纤维)和黄色(剩余组织)使用图像专业+软件。弹性纤维和组织单位面积的百分比的肺也计算。所有图片都被暴露在相同的控制信号强度。
量化锁链素含量肺核心,肺样本水解一夜之间在110°C使用常数在6 N HCl沸腾。玉米胚芽蛋白酶解物中锁链素含量测定等13总蛋白和正常化。锁链素剂量是由b淀粉(生物化学部门,德克萨斯大学健康中心在泰勒,泰勒,TX,美国)。
数据分析
数据表示为中位数(四分位范围)。组决定使用Kruskall-Wallis测试之间的差异和个体差异变量从两组分析Mann-Whitney紫外线测试。使用斯皮尔曼等级相关变量之间的相关性进行了分析测试。一个假定值< 0.05被认为是重要的。
结果
病人的特点
研究对象的特点,提出了在表格1中⇓。如预期的选择病人,非常严重的慢性阻塞性肺病之间有显著差异(阶段4),中度/重度慢性阻塞性肺病(阶段2 - 3)和non-COPD组织气流限制和静态的恶性通货膨胀。供体组显著年吸烟量越年轻,有一个低得多的人,比non-COPD吸烟和慢性阻塞性肺病组。肺功能测试没有获得捐助者。
本地化的弹性蛋白基因的表达
肺弹性纤维中存在多个隔间,包括气管和血管壁,胸膜,肺泡壁。因此,弹性蛋白mRNA表达决心的本地化原位杂交与意义和反义digoxygenin-labelled探针弹性蛋白mRNA。小信号弹性蛋白mRNA在肺泡壁non-COPD,中度/重度慢性阻塞性肺病和供体肺标本(图2⇓)。偶尔的阳性细胞被发现在intralobar肺动脉平滑肌层墙(图2 b⇓),进行航空(图2摄氏度⇓在所有组)。弹性蛋白mRNA本地化,单个细胞在肺的肺泡壁非常严重的慢性阻塞性肺病,温和的地区(图2 d⇓)和严重(图。2 e⇓)肺泡扩张。量化的原位杂交显示,阳性细胞数量显著增加在肺泡壁非常严重的慢性阻塞性肺病与中度/重度慢性阻塞性肺病相比,non-COPD和供体肺(图。2 f⇓)。
弹性纤维染色和密度
肺泡弹性纤维研究的组织捐赠(图3模拟⇓慢性阻塞性肺病)和第四阶段(图3的情况⇓肺)。肺泡弹性纤维更密集的和紧密的主要供体肺和本地化的提示肺泡导管(图3 b⇓和c)。相比之下,弹性纤维在阶段4 COPD肺不太好组织和分布在肺泡壁瓦解和宽松的外观(图3 f-h⇓)。量化肺泡弹性纤维染色的部分表明,弹性纤维占总量的比例更高阶段4 COPD肺标本的肺泡组织比供体肺(p < 0.01;图4⇓)。接下来,我们研究了弹性纤维密度之间的关系和空域扩大的组织学评估(L米),CT扫描(胡)和3他通过核磁共振成像ADC测量。领域与衰减值低于-950胡锦涛CT肺气肿14。基于我们之前的数据,L米> 0.5毫米和ADC > 0.5厘米2·年代−1代表重要的肺气肿吗9。总肺泡弹性纤维组织的比例明显高于在大空域的地区扩大的组织学评估(L米> 0.5毫米;p < 0.05;图4 b⇓),CT扫描(< -950胡;p < 0.05;图4摄氏度⇓),3他ADC(> 0.5厘米2·年代−1;p < 0.05;图4 d⇓)。如前所述,我们组9,3他ADC显示显著异质性肺肺泡大小在慢性阻塞性肺病阶段4(图4 e⇓和f)。不存在相关性,然而,弹力素水平之间的表达式和弹性纤维密度或严重肺气肿的破坏非常严重的慢性阻塞性肺病患者(没有显示)。
正如所料,组织(图5的百分比⇓)和细胞的数量(未显示)单位面积(毫米2)的膨胀阶段4 COPD肺的肺低比供体肺。肺弹性纤维密度每卷(图5 b⇓)和锁链素内容(图5度⇓)不是在舞台上增加4慢性阻塞性肺病。
讨论
我们的研究的最重要的结果是,弹性蛋白mRNA表达明显增加,在非常严重的慢性阻塞性肺病而显著中度/重度慢性阻塞性肺病,non-COPD和捐助标本。这upregulation弹性蛋白基因表达与呼吸道的严重程度限制。原位杂交证明基因弹性蛋白表达局部肺泡壁,弹性纤维降解的网站肺气肿,表明,企图修复机制发生在严重COPD肺。很大比例的肺泡壁细胞阳性弹性蛋白mRNA在严重COPD肺。这一结果表明,很大比例的肺泡壁成纤维细胞可能切换到合成,损伤修复表型严重慢性阻塞性肺病。此外,我们表明,弹性纤维总量的一小部分肺泡组织是非常严重的慢性阻塞性肺病而增加供体肺。等体积的基础上扩大领空在慢性阻塞性肺病,锁链素内容和弹性纤维密度单位面积的肺膨胀并没有增加。
慢性阻塞性肺病的病理学的研究都集中在一个失衡能够降解的elastin-rich架构肺的蛋白酶及其抑制剂,和最近,损伤机制,导致细胞表型发生变化和细胞死亡的肺15。大多数组织应对损伤与修复机制,一旦成功,限制组织功能的丧失和恢复体内平衡。立筋et al。16最近提出,在个人气性肺组织破坏的异质性普遍从当地损伤和变量可能导致修复反应的效果。任何潜在的修复肺泡壁弹性纤维在肺泡失去完整性是感兴趣的。除了报道原发性肺动脉高压引起的弹性蛋白的表达17、弹性蛋白表达在成人的肺没有以前的特征。发现诱导肺泡壁弹性蛋白表达的非常严重的慢性阻塞性肺病可能意想不到,但库恩和淀粉2发现肺弹性蛋白和胶原蛋白合成后被诱导elastolytic受伤和有限的仓鼠肺肺泡扩张的程度。有趣的是,我们发现一个重要upregulation只在非常严重的慢性阻塞性肺病的弹性蛋白表达,而中度/重度COPD并没有表现出高弹性蛋白表达。弹性蛋白表达的机制参与upregulation非常严重的慢性阻塞性肺病仍有待理解。
考虑到弹性蛋白表达强烈诱导的肺已经经历了巨大的肺泡扩张,可能弹性蛋白表达发挥何种作用在COPD的发病机制?在这个时候,是不可能推断出这样的表达是否肺气肿的发展放缓,或者是否在慢性阻塞性肺病的患者发展最严重的形式,新的弹性蛋白表达发生太晚,肺泡完整性后丢失。最近,Shifren Mecham18表明,弹性蛋白基因剂量决定对香烟烟雾诱发肺气肿在老鼠身上。城市等。19也表明,弹性蛋白基因的突变导致皮肤laxa在皮肤上也与支气管扩张和肺气肿。
它不仅是令人惊讶的发现在肺泡壁弹性蛋白基因表达强烈诱导严重的肺气肿,但目前研究发现肺泡壁弹性纤维密度增加严重的慢性阻塞性肺病。这些额外的新发现可能不同于先前的报道有几个原因。必须指出,在我们的研究中,两组的人口学特征分析的弹性纤维密度的组织明显不同年龄和吸烟史捐赠国和第四阶段COPD肺。尽管如此,我们可能期望找到更高的弹性纤维密度在年轻和健康的肺。一个因素,可能导致本研究之间的差异和其他人是我们使用inflation-fixed肺标本,而许多先前的研究利用未加压的肺切除标本从癌症患者。此外,我们研究了肺和非常严重的慢性阻塞性肺病和许多以前的研究集中于轻度到中度慢性阻塞性肺病4。我们研究的一个限制是,我们分析了只有三个供体肺膨胀。然而,我们的研究显示显著差异在弹性纤维密度和形态之间的核心来自捐赠者和COPD肺第四阶段。接下来,我们的结果应该被在极端的肺泡扩张,随之而来的肺泡壁组织的损失。当弹性纤维密度是表示相对于肺的体积膨胀,存在很严重的慢性阻塞性肺病和捐助者之间没有区别。这些结果表明,组织的损失非常严重的慢性阻塞性肺病超过弹性纤维的破坏。支持这种推理,是良好的细胞凋亡和损失发生在肺泡壁毛细血管密度在慢性阻塞性肺病15,20.- - - - - -22。肺泡弹性纤维形态的变化在严重肺气肿也会影响明显的弹性纤维密度和总肺泡组织的体积分数。Vlahovicet al。6显示增加弹性蛋白/在肺泡基底膜轻度到中度肺气肿,并暗示的肺泡纤维隔膜消失,只有厚弹性纤维留在interacinar / intersegmentar墙壁肺气肿。弹性纤维在肺气肿经常被报道为瓦解的外表。如果这些变化发生时,我们的研究表明,相同质量的弹性蛋白很可能占领更大的明显的体积。不管变化的弹性纤维,我们并没有发现显著差异在锁链素内容之间的供体肺和非常严重COPD肺,表明充分交联弹性蛋白的总质量(包括导气管和血管弹性蛋白)没有显著增加非常严重的慢性阻塞性肺病的肺部组织。有趣的是,我们并没有发现任何的弹性蛋白表达水平之间的相关性和肺泡弹性纤维的密度非常严重的慢性阻塞性肺病,这表明upregulation弹性蛋白的表达可能不导致有效的修复弹性纤维在那些患有非常严重的肺气肿。
总之,目前的研究表明,弹性蛋白表达是非常严重的慢性阻塞性肺病高度调节,提高的可能性非常严重的慢性阻塞性肺病的修复过程。这种潜在的修复机制及其监管的效率仍有待证明了非常严重的慢性阻塞性肺病的上下文中。
支持声明
奖助金是来自美国国立卫生研究院(贝塞斯达,医学博士,美国;P50 HL084922) R.A.皮尔斯和J.C.森林,巴恩斯医院基金会(圣路易斯,密苏里州,美国;6158 - 01)J.C.森林,和加拿大健康研究所(渥太华,加拿大;7246)J.C.豪格。g . Deslee收到资助大学博士后训练和兰斯的楚,L 'Association Regionale倒L 'Aide辅助Insuffisants Respiratoire de香槟Ardenne(兰斯、法国),学院des离Pneumologie和阿斯利康(法国巴黎)。
感兴趣的语句
一份声明中对g . Deslee可以发现www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.dtl
- 收到了2008年8月8日。
- 接受2009年3月31日。
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