摘要
本研究的目的是评价在活的有机体内环氧化酶-2在鼻息肉中的调控。
共65例鼻息肉患者随机(3:1)用(n = 51;33例(哮喘)或无(n = 14)口服强的松和鼻内布地奈德治疗2周,再加鼻内布地奈德治疗10周。分别在基线、治疗2周和12周后进行活检。对所有样本进行环氧化酶-1和环氧化酶-2 mRNA的分析。尝试检测环氧化酶-2蛋白。
基线时,非哮喘和哮喘患者的息肉中环氧合酶-1和环氧合酶-2的表达无差异。糖皮质激素治疗组Cyclooxygenase-1 mRNA表达无变化,糖皮质激素治疗组患者第2周cyclooxygenase-2 mRNA表达较基线升高,第12周下降。在亚组中,与基线相比,非哮喘患者和哮喘患者的息肉在第2周发现环氧化酶-2 mRNA水平升高。在第12周,环氧化酶-2的表达在非哮喘患者中保持高表达,而在哮喘患者中则下降。在任何情况下均未检测到环氧合酶-2蛋白。
糖皮质激素治疗增强环氧化酶-2的表达在活的有机体内在鼻息肉中,这一发现并不符合普遍接受的假设,即糖皮质激素抑制环氧化酶-2的表达。
前列腺素(Prostaglandin, PG)内过氧化物酶合酶(endoperoxidase synthase,又称环氧合酶(cyclooxygenase, COX))是生物合成PG的限速酶,存在COX-1和COX-2两种不同的酶。虽然COX-1在大多数细胞中是构成性表达,但在基础条件下COX-2的表达通常较低,但通常是由炎症介质、有丝分裂原和生长因子诱导的。许多观察表明COX-2的表达在炎症和肿瘤发生中起关键作用1。
COX-2在应激信号反应中的过表达已被证明是PG的主要来源。PG可对气道炎症反应产生相反的作用。肥大细胞释放PGD2,这是部分负责支气管收缩,通常发生在即时过敏反应。相比之下,铂族元素2既能产生有利的影响,也能产生不利的影响。吸入高PGE2剂量可引起支气管收缩,而低剂量可防止运动引起的支气管收缩、早期和晚期气道过敏反应以及阿司匹林引起的支气管收缩2- - - - - -4。总之,实验数据和临床结果表明,COX-2诱导可能是肺的朋友或敌人5,6。
尽管COX-2酶在炎症状态下被诱导,但在哮喘患者的鼻息肉中却不是这样,因为哮喘患者的鼻息肉中COX-2酶的表达没有增加7,8。这种COX-2在鼻息肉炎症组织中表达的缺乏在患有阿斯匹林不耐受的哮喘患者中更为明显,这些患者的COX-2表达水平甚至低于耐阿斯匹林哮喘患者8- - - - - -10。造成这种异常反应的机制尚不清楚。COX-2的下调是否参与了鼻息肉的形成,还是鼻炎症过程的附带结果,仍有待阐明。
糖皮质激素(GCs)是几种临床条件下最有效的治疗方法,在治疗鼻息肉时被用于抗炎作用11。GCs已被证明可以调节参与炎症反应的几个基因的表达。GC作用的靶基因之一似乎是COX-2基因,它通过转录和转录后机制被抑制12- - - - - -14。
然而,GC降低气道COX-2表达的能力尚不完全清楚。至少有一组研究发现,GC可以降低哮喘患者支气管粘膜COX-2的表达15但也有研究报道哮喘患者支气管粘膜中其表达无变化16或鼻息肉在胃癌治疗后10。同样的,在体外研究也显示了不同的结果,一些报告显示下降12- - - - - -14其他的则会增加17在表达COX-2后,各种细胞和组织暴露于GC。
GC对气道COX-2的真实影响尚不清楚在活的有机体内研究是在横断面研究中对不同组患者的比较研究10,15,16和在体外关于细胞类型、使用的方法和暴露于治疗的持续时间的研究差异很大10,12- - - - - -14。
明确GC是否增加或减少COX-2表达的唯一方法在活的有机体内是通过一项前瞻性研究,比较同一研究对象在胃癌治疗前后组织中酶的表达水平。考虑到这一目标,我们对接受GC治疗的患者进行了一系列鼻息肉活检,并评估了局部COX-2 mRNA和蛋白的表达。
对象和方法
研究对象
选择65例确诊为严重鼻息肉的患者(74%男性,年龄51±2岁),包括无哮喘患者和阿斯匹林耐受或阿斯匹林不耐受哮喘患者(分别为ATA和AIA)。严重的鼻息肉,特异反应性,哮喘和阿司匹林敏感性诊断的描述18,19(见补充材料)。所有受试者均同意参与研究,该研究由西班牙巴塞罗那医院诊所伦理委员会批准。表1⇓总结研究对象的人口学资料和临床特征。
研究设计
这里使用的研究设计已经被报道过18。在没有使用鼻内或口服类固醇的情况下,经过4周的洗脱期后,患者被随机(3:1)分为两组。1)GC-treated 51组包括病人口服强的松(30毫克每日4天,后跟一个圆锥形的5毫克每2天)和鼻内布地奈德(400μgb.i.d。)2周(w2),紧随其后的是鼻内布地奈德(400μgb.i.d。)独自再坚持10周(w12)。2)非治疗组包括14例在2周内未接受任何类固醇治疗的患者(w2)。由于伦理方面的原因,未接受治疗组的患者在没有任何有效治疗的情况下,没有被保留超过6周。所有患者在基线、w2组(治疗组和未治疗组)和w12组(治疗组)进行鼻息肉活检。
组织学分析
活组织检查的炎症成分,即。单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞,特点是在4-μm粗石蜡切片苏木精和伊红染色。切片采用Olympus显微镜(400倍放大)进行盲计数。在1.6毫米到2毫米之间2细胞计数为阳性细胞数量·mm−2。由于在3个点(基线、w2和w12)获得的组织数量有限,以及优先使用组织进行RT-PCR和蛋白分析,仅能在29例患者中完成组织学分析。
逆转录和实时PCR
从标本中提取总RNA和逆转录步骤如前所述9,10。COX-1和COX-2转录本的定量是通过外推质粒双链DNA外部标准曲线来实现的。实时PCR检测的详细方案和验证已在其他地方报道(见补充资料)9。
COX-2的Western blot和ELISA检测
从鼻息肉活检中提取的总蛋白如别处所述20.并通过Western blot检测COX-2蛋白的表达20.酶联免疫试剂盒(ZYMED laboratories INC, San Francisco, CA, USA)。ELISA试剂盒检测范围为2.15 ~ 275ng·mL−1(见补充材料)。
统计分析
数据以中位数和四分位数范围表示。非参数统计分析采用组内比较的Friedman检验和Wilcoxon秩检验,组间比较的Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney u检验。在分析数据之间的关系时使用了Spearman秩相关。p值<0.05被认为是显著的。
本研究的样本量是基于实际考虑而确定的。估计的统计力量目前样本大小(51 GC-treated病人)检测的主要变量的值改变了1/2 (cox - 2 mRNA) 82%与非参数分析方法(Wilcoxon测试),双边的α误差5%。
结果
主题
如预期,GC治疗明显改善了临床症状,减少了鼻息肉的大小,缓解了鼻塞。关于临床结果的详细描述已经在其他地方报道过18。
组织学研究
除嗜中性粒细胞外,在基线时,经gc处理组和未处理组的炎症细胞数量没有显著差异(表2)⇓)。
未治疗组的炎症细胞计数在基线和w2之间没有显著变化(表2)⇑)。相比之下,在w2时,经gc处理的患者的嗜酸性粒细胞数量明显下降,在w12时仍保持较低水平,与基线相比中性粒细胞数量增加(表2)⇑)。非哮喘患者w2嗜酸性粒细胞减少(中位数20(四分位差15-38);n = 8;哮喘患者(18例(3-55例);n = 12;与基线比较(无哮喘:199 (96-339);n = 9;哮喘:285 (126 - 808);n = 13)。然而,在w12时嗜酸性粒细胞的减少在非哮喘患者中更为明显(13 (3-71); n = 8; p<0.05 compared with baseline) than in the asthmatic patients (41 (3–283); n = 10; nonsignificant compared with baseline). No differences in the response to GC treatment were apparently found between ATA and AIA patients. However, given the low number of patients available for histological analysis, caution has to be taken when comparing subgroup differences.
所有患者w2中性粒细胞数量的增加(表2⇑)未达到统计学意义,当他们被细分为非哮喘患者(w2: 17 (1-47))与w0: 2 (1-13);p = 0.07)和哮喘(w2: 20 (1-40)与w0: 4 (2 - 30);(p = 0.07), ATA和AIA患者也没有。
COX-1和COX-2 mRNA的基础表达
在对所有患者进行基线分析时,非哮喘患者与ATA或AIA患者的鼻息肉中COX-1或COX-2 mRNA表达均无显著差异(表3)⇓)。
经GCs处理后,COX-1和COX-2 mRNA表达
基线时,治疗组和未治疗组COX-1 mRNA表达无显著差异(图1a)⇓)。未处理组的COX-1 mRNA水平在基线和w2之间没有显著变化,而处理组的COX-1 mRNA水平在基线和w2或w12之间也没有显著变化(图1a)⇓)。在接受治疗的患者中,与基线相比,非哮喘患者和哮喘患者的鼻息肉w2和w12处COX-1表达均未见明显变化(图1b)⇓)。
a)未治疗组(14例)和糖皮质激素(GC)治疗组(51例)和b)中环氧化酶(COX)-1 mRNA的调节。数据以第25位、第50位(中位数)和第75位百分位值的箱形图表示。胡须代表第10百分位和第90百分位。□:基线;░:2周;▓:第12周。COX-1 mRNA的表达在任何组中随时间变化均未见明显差异(Friedman检验和Wilcoxon检验)。
未治疗组在基线和w2之间COX-2 mRNA表达无明显变化,而与基线相比,治疗组在w2时COX-2 mRNA表达增加。与w2相比,COX-2 mRNA表达在w12时显著降低(图2a)⇓和表4⇓)。有趣的是,非哮喘患者和哮喘患者对GC治疗的反应不同(图2b)⇓和表4⇓)。因此,在非哮喘患者中,COX-2在w2和w12的表达较基线升高。然而,在哮喘患者中,COX-2表达在w2较基线升高,在w12降低至基础水平。同样明显的监管模式,即。在ATA和AIA患者中,w2时COX-2 mRNA水平升高,w12时恢复到基础水平,但变化没有达到统计学意义(表4)⇓)。
![图2 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/3/502/F2.medium.gif)
a)未治疗组(14例)和糖皮质激素(GC)治疗组(51例)和b)中环氧化酶(COX)-2 mRNA的调控。数据以第25位、第50位(中位数)和第75位百分位值的箱形图表示。胡须代表第10百分位和第90百分位。□:基线;░:2周;▓:第12周。*:p < 0.05;**: p<0.01 (Wilcoxon test)。
COX-2 mRNA水平与嗜酸性粒细胞计数呈微弱但统计上显著的负相关(r = -0.307;n = 73;p < 0.01)。然而,COX-2 mRNA水平的变化与GC处理后嗜酸性粒细胞数量的变化不相关。COX-2 mRNA的变化也与w2处中性粒细胞数量的增加无关。
cox - 2蛋白表达
COX-2蛋白在任何组织或任何时间点均未检测到。Western blot分析显示基线时COX-2蛋白缺失,少数组织在GC处理后偶见COX-2蛋白的微弱条带,难以定量(图3)⇓)。
![图3 -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/33/3/502/F3.medium.gif)
a)糖皮质激素(GC)治疗2周(w2)和12周(w12)后,通过Western blot检测鼻息肉中环氧合酶(COX)-2蛋白的代表性图像。1、2和3表示COX-2标准的连续稀释(分别为11、5.5和2.75 ng)。注意基线、w2和w12没有COX-2。b)免疫印迹β-actin,展示类似的蛋白质加载所有车道。
讨论
人们普遍认为COX-2在炎症条件下上调,而COX-2衍生的类二十烷酸主要是促炎的。由于二十烷酸类化合物通常被认为是有效的促炎介质,它们被GC和非甾体抗炎药物(NSAIDs)抑制被认为是一个理想的治疗目标。然而,许多最近的观察对这些假设提出了质疑,尤其是当它们应用于哮喘和特发性肺间质纤维化时5,6,21。
在哮喘和鼻息肉中,最明显的是那些对阿司匹林敏感的患者,有有趣的数据支持COX-2通路的大量失调。cox - 2和/或铂族元素2据报道,鼻息肉的水平有所下降7- - - - - -10,22以及支气管成纤维细胞23支气管平滑肌24哮喘病人。COX-2的表达在ATA和AIA患者中未发现明显差异,这与之前的报道一致,即有时需要动力学研究来证明COX-2在ATA和AIA哮喘患者中的表达差异9,以及健康的鼻粘膜和鼻息肉之间7。铂族元素2似乎是气道炎症反应的调制器,而不是作为促炎症物质2- - - - - -6。非甾体抗炎药对哮喘患者COX通路的抑制作用一般无益处。事实上,非甾体抗炎药会导致某些患者出现严重的哮喘反应,这可以通过PGE的预处理来预防23.。
与预期相反的是,目前的研究显示,GC增加了鼻息肉中COX-2 mRNA的表达,这是一个有趣的新发现,增加了发炎的鼻组织中COX-2调节的改变。在非哮喘和哮喘患者中,系统和鼻内GC的初始高强度治疗导致COX-2 mRNA显著升高,导致后者在强的松停药和仅鼻内GC治疗10周后恢复到基线表达水平。与此同时,口服和鼻内GC治疗2周后,嗜酸性粒细胞数量显著减少,中性粒细胞增多。GC对炎症细胞的这些不同作用之前已经被报道过,并归因于GC对嗜酸性粒细胞(细胞凋亡增加)和中性粒细胞(细胞凋亡减少)凋亡调节的相反作用。25。当患者接受效力较低的鼻内GC治疗时,哮喘患者鼻息肉中的嗜酸性粒细胞数量较口服GCs增加,而非哮喘患者嗜酸性粒细胞浸润仍较低。这些发现表明,哮喘患者的鼻息肉存在较大的炎症活动,导致强的松停药后嗜酸性浸润的较早复发。有趣的是,COX-2 mRNA的表达似乎与炎性细胞浸润的变化并行。因此,COX-2 mRNA水平与嗜酸性粒细胞计数呈微弱但显著的负相关,尽管COX-2 mRNA的变化与GC处理后嗜酸性粒细胞的变化不相关。因此,GC处理引起的COX-2 mRNA的变化可能涉及GC对COX-2基因调控的直接影响,但也可能,至少部分,是组织细胞成分变化的结果。
COX-2蛋白在基线和gc后均未检测到。这并不是一个意外的结果,因为COX-2蛋白通常不会在鼻粘膜或双侧鼻息肉的基线处被Western blot检测到7,14。强效的炎症刺激通常需要诱导COX-2蛋白的可检测水平的产生在体外研究7。也可以找到COX-2蛋白在活的有机体内在某些疾病中,如囊性纤维化等,PGs的产量较高20.。由于COX-2蛋白在任何情况下都未被检测到,目前尚不清楚本研究中发现的轻微的gc诱导的COX-2 mRNA的增加是否导致了COX-2蛋白翻译量的增加。目前还不清楚GC治疗是否对前列腺素的产生有影响。
目前还不清楚GC对COX-2 mRNA表达的影响是否只发生在发炎的鼻组织中,或者是否也会发生在健康的鼻黏膜中。由于伦理原因,无法获得健康受试者在GC治疗前后的鼻活组织检查。
有趣的是,目前的观察结果与Dworski之前报道的另一项一致et al。26, who还意外发现30 mg强的松治疗7天的特应性哮喘患者肺泡巨噬细胞和血液单核细胞COX-2 mRNA表达显著升高,而同样的治疗导致健康受试者相同细胞COX-2 mRNA表达降低。与所得到的结果相反在活的有机体内,当异位性哮喘患者和健康受试者暴露于地塞米松时,COX-2 mRNA的表达明显受到抑制体外26。
因此,尽管本研究中GC诱导的COX-2 mRNA的增加可能部分归因于GC对炎性浸润的影响,但本研究结果与Dworski报道的结果一致et al。26,支持GC治疗上调COX-2表达的假设在活的有机体内在哮喘和鼻息肉患者的细胞和气道组织中。
目前作者无法解释GC治疗哮喘/鼻息肉时COX-2表达增加的原因。基于GC效应的二分法在活的有机体内关于体外Dworski发现的情况et al。26目前,作者假设哮喘和鼻息肉的炎症过程可能是COX-2基因表达受限的原因。GC治疗可能会降低这些成分中的一个或多个的活性,这将允许COX-2基因表达的部分释放。
综上所述,本研究证明糖皮质激素治疗可提高鼻息肉环氧化酶-2 mRNA的表达。这些结果,加上先前的观察,支持了这样一种观点,即鼻息肉中环氧合酶-2的调节既不符合普遍接受的观点,即该酶在炎症条件下上调,也不符合糖皮质激素抑制环氧合酶-2表达的假设。识别这些不同反应的机制可能有助于更好地了解前列腺素在气道疾病炎症调控中的作用。
支持声明
本研究由卫生调查基金会(PI 050108)和toracacia (SEPAR)提供支持。
感兴趣的语句
J. Mullol和C. Picado感兴趣的声明可在以下网址找到www.www.qdcxjkg.com/misc/statements.shtml
致谢
作者要感谢F. Torres(巴塞罗那自治大学-临床药理学服务,IDIBAPS,医院诊所,巴塞罗那,西班牙)在统计分析方面提供的帮助。
脚注
这篇文章有补充材料可从www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2008年2月5日。
- 接受2008年10月27日。
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