摘要GydF4y2Ba
肺泡微石症是一种罕见的弥漫性肺部疾病,其特征是在肺泡内积聚磷酸钙微石。GydF4y2Ba
PAM的致病机制最近才被发现,涉及到一种由肺泡上皮细胞表达的磷酸钠共转运蛋白的基因突变。这种突变可能对临床表型产生不同的结果。然而,在家族性PAM中肺细胞免疫表型的研究尚未见报道。GydF4y2Ba
在本文中,通过对两个兄弟姐妹的支气管肺泡灌洗液进行PAM诊断分析,发现淋巴细胞性肺泡炎伴有CD8+ t细胞的积累。该淋巴细胞群体的克隆复杂性通过频谱分析显示,t细胞的寡克隆积累与限制性可变t细胞受体(TCR)基因的使用有关。外周血淋巴细胞TCR分析未见t淋巴细胞异常模式。GydF4y2Ba
在报道的肺泡微结石家族性病例中,cd8介导的不良免疫反应可能发生在支气管肺泡腔。这种免疫失调与肺泡微结石的遗传背景之间的关系值得进一步研究。GydF4y2Ba
肺泡微(PAM)是一种罕见的弥漫性肺疾病,其特征在于称为石器微小的,倒圆的小体的渐进肺泡内形成和积累GydF4y2Ba1GydF4y2Ba。对报告病例的分析显示,该病在家庭单位中普遍存在,在受感染个体的父母中有很高的血缘关系GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,GydF4y2Ba3GydF4y2Ba,提出了遗传因素在PAM发生过程中所起作用的假说GydF4y2Ba4GydF4y2Ba。近日,CorutGydF4y2Baet al。GydF4y2Ba五GydF4y2Ba已经确认导致这种疾病的基因突变为GydF4y2BaSLC34A2GydF4y2Ba(IIb型磷酸钠共转运基因),该基因参与了包括肺在内的多个器官的磷酸盐稳态。由于这一重要发现,现在很清楚肺泡内微石的形成是细胞外液中磷螯合钙的结果。这是由于由肺泡II型上皮细胞表达的基因产物的功能丧失,从而导致产生表面活性剂所需的磷酸盐细胞摄取减少。这种遗传背景对表型的影响是未知的。GydF4y2Ba
值得注意的是,尽管它在疾病诊断中的应用,目前仅有少数资料记载了PAM中支气管肺泡灌洗液(BALF)的表型成分;此外,t淋巴细胞抗原识别结构,t细胞受体(TCR),还没有在PAM中检测。细胞是由形成α/β、γ、δ链,每个编码在t细胞个体发生重排基因片段GydF4y2Ba6GydF4y2Ba。特别是β-chain多样性的能力是至关重要的t细胞识别和应对人口的大量不同的抗原,可能会遇到GydF4y2Ba7GydF4y2Ba。事实上,在其他弥漫性肺部疾病,包括肺鳞病、结节病和外源性变应性肺泡炎中,t细胞的积累表明TCR基因的使用受到限制GydF4y2Ba8GydF4y2Ba-GydF4y2Ba10GydF4y2Ba。本文报告了两个受家族性PAM影响的同胞的BALF和外周血淋巴细胞(PBL)分析。GydF4y2Ba
患者和方法GydF4y2Ba
病人GydF4y2Ba
本研究的受试者包括两名兄弟姐妹,一名24岁的男性和一名27岁的女性,他们在儿童时期通过观察典型的放射学特征和在BALF中发现的钙球蛋白被诊断为PAM。两名患者均无吸烟史。除了轻微的运动受限外,他们否认有明显的呼吸系统症状。放射学和高分辨率计算机断层扫描(HRCT)显示了PAM的典型表现(图1)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)GydF4y2Ba11GydF4y2Ba。患者给予书面的知情同意以参加研究,该研究得到了当地伦理委员会的批准。GydF4y2Ba
The whole-body bone scintigraphic scan, by intravenous administration of 740 MBq of technetium 99m-methylene diphosphonate (99米GydF4y2Ba两例患者均表现出强烈的骨重建活动,并在胸段所有扫描平面表现出弥漫性和异常的肺摄取。实验室数据,包括尿分析、汗液氯、血糖、钙和磷酸盐血水平、肾功能和肝功能测试、甲状腺激素和尿酸血水平均在正常范围内。结核菌素曼图克斯皮肤试验阴性。对分枝杆菌、真菌和细菌种类的微生物检查未发现任何肺泡污染。对两例患者BALF标本进行PCR检测,检测疱疹病毒1型、2型、eb病毒、巨细胞病毒;所有结果均为阴性。GydF4y2Ba
系谱图GydF4y2Ba
PAM患者的系谱图如图2所示GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba。这些患者的父母之间有血缘关系,因为他们是两个表亲的儿子。在母亲的家族系中,报告了多例肾脏疾病,包括肾结石、多囊肾病和慢性肾衰竭。在父亲的家族中,有10位成员(II3、III2、III3、III18、III19、IV2、IV3、IV4、IV5和IV12)患有慢性肝病并发肝硬化的比例很高,另有3位成员患有肝癌。在目前的研究中,这两名患者的另一名女性同胞没有受到影响,并且报告没有呼吸道、肾脏或肝脏疾病。GydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗程序和细胞处理GydF4y2Ba
支气管肺泡灌洗(BAL)与局部麻醉利多卡因灵活支气管镜进行。支气管镜在中间叶和无菌磷酸盐缓冲盐水溶液支气管在37℃下楔入在三个50毫升的等分试样滴入。每次滴注之后,流体轻轻吸出,并在硅化塑料瓶通过数量的编码,并置于冰上收集。BALF通过无菌纱布去除粘液的两层过滤,然后在240×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba10分钟。首次入院(时间0),3个月后(时间1),临床状态及呼吸症状稳定时进行BALs检查。用光学显微镜和伯克氏腔计数肺泡细胞总数。用台盼蓝排除法检测,恢复的细胞显示>90%的存活率。用细胞离心法制备涂片进行鉴别计数,然后进行May-Grunwald-Giemsa染色。用ficol - hypaque梯度离心法(瑞典乌普萨拉法玛西亚)从肝素化血液中分离外周血单个核细胞(PBMC),洗涤两次,然后用RPMI-1640稀释(意大利米兰Sigma Aldrich公司)。GydF4y2Ba
免疫荧光和流式细胞仪GydF4y2Ba
CD45 PC5,CD3 FITC:;单克隆抗体(分化(CD簇)45 PC5,CD3 FITC,CD4 PE,CD8 PC5,CD19 PE,CD16 PE贝克曼库尔特公司,马赛,法国)根据下面的三重采样利用,CD19 PE(上以评价T-和B-淋巴细胞CD45阳性细胞免疫栅极);CD45 PC5,CD3 FITC,CD16 PE(以评价T-和自然杀伤淋巴细胞上CD45阳性细胞免疫栅极);和CD3 FITC,CD4 PE,CD8 PC5(为了评估CD4 +和CD8 + T淋巴细胞上的CD3阳性细胞免疫栅极)。BAL和PBMC细胞的等分试样在RPMI-1640(Sigma Aldrich公司,米兰,意大利),三重与文献报道的抗体染色,最后,在Coulter EPICS XL(贝克曼库尔特公司)分析用XL系统II软件洗涤两次版本3.0根据先前报道的方法GydF4y2Ba12GydF4y2Ba。GydF4y2Ba
使用频谱类型分析变量CDR3的以太相关长度GydF4y2Ba
使用先前报道的频谱分析方法研究了TCR的beta变量(BV)区域GydF4y2Ba13GydF4y2Ba。(; Dynal公司,奥斯陆,挪威的Dynabeads)的T细胞是从BALF和从PBL成CD8 +和CD8-通过与包被的珠粒磁性分选细胞分离。RNA根据制造商的说明书,使用Trizol(Invitrogen公司,米兰,意大利)中制备。为26个不同的BV TCR家庭逆转录和PCR扩增在与所述的SuperScript™III一步法RT-PCR系统用的Platinum®单步反应进行的GydF4y2BaTaqGydF4y2BaDNA聚合酶(Invitrogen)中。简言之,无论是反转录和扩增使用相同的引物。一个常见的反向引物(引物CB3)中的溶液一起使用的24个不同的正向引物(TCRBV基因家族的引物),其序列对应于那些由Gorski的描述GydF4y2Baet al。GydF4y2Ba14GydF4y2Ba。为了确定每个BV TCR家族的组成,PCR产物在荧光型DNA测序仪(ABI 377;应用生物系统,英国沃林顿)。通常情况下,每个TCR族被分解成一系列高斯分布的频带。每一个变化,无论是在分布或强度的单一波段,代表了一个扰动,在给定的BV TCR家族反映该家族的参与,在一个免疫反应对一个或多个抗原。GydF4y2Ba
结果GydF4y2Ba
临床参数GydF4y2Ba
肺容积在正常范围内,而肺对一氧化碳的扩散能力(GydF4y2BadGydF4y2BaL,有限公司GydF4y2Ba)显示在两个受试者轻度至中度降低(GydF4y2BadGydF4y2BaL,有限公司GydF4y2Ba8.72(74%)和6.47 (66.5%),GydF4y2BadGydF4y2BaL,有限公司GydF4y2Ba每患者1和2,肺泡体积1.32(77.5%)和1.55(84%)的单元分别地)。Resting blood gases revealed mild hypoxaemia compared with age (8.49 and 9.25 kPa, respectively).
BALF和PBMCGydF4y2Ba
表1报告了BALF在0时和1时回收的细胞总数、BALF中淋巴细胞的百分比以及PAM患者BALF和PBL淋巴细胞中主要淋巴细胞亚群的相对出现情况GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba。提高BALF细胞总数(3.0/7.0×10)GydF4y2Ba五GydF4y2Ba和5.0 / 4.0×10GydF4y2Ba五GydF4y2Ba细胞·毫升GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba在时间0和时间1,分别地)与正常数值进行比较对于一个人同年龄的(0.5-1×10GydF4y2Ba五GydF4y2Ba细胞·毫升GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba,如前所述GydF4y2Ba12GydF4y2Ba)。淋巴细胞的百分比,通过细胞的差分计数使用五月-的Grunwald-Giemsa染色涂片肺泡细胞直方图确定的,主要是在这两个病人在不同的时间增加,并且总是包括了> 30%的BALF的T细胞亚群,如流动分析流式细胞仪。这揭示,在这两个患者中,CD8 + / CD3 +子集的增加量的存在,与CD4 + / CD8 +之比后续反转。PBL的蜂窝模式并没有表现出与同年龄的受试者的参考值相比任何淋巴细胞异常。GydF4y2Ba
TCR BV基因使用情况GydF4y2Ba
为了评估本研究中PAM患者支气管肺泡腔内积累的淋巴细胞群的克隆复杂性,在研究的第1个时间点,采用频谱分析方法测量从BALF分离的t淋巴细胞表达的26个BV基因的CDR3异质性长度。由于CD8+ t细胞在两例患者中都占了t淋巴细胞的绝大部分,为了明确分析细胞毒性CD8+ t细胞表达的TCR表达谱,我们使用磁性标记抗体将其分离。目前的作者发现两例患者BV基因的使用都受到限制。在患者1中,26个BV家族中有14个在CD8+淋巴细胞中表达(图3)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)。在CD8+细胞中,只有4个家族呈高斯分布,仅BV25就占了CD8+中全部BV表达的31%。频谱分析显示在BV的使用和从患者2的BALF中分离的淋巴细胞中有明显的限制。26个BV家族中有13个在CD8+ t细胞中表达。他们都没有表现出正常的轮廓。值得注意的是,BV2在CD8+淋巴细胞中表达的整个BV家族中占36%(图3)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)。值得注意的是,在这两例患者中,BV6.2和BV7表现出相似的模式和相似的表达频率。此外,BV2、5.1、7、8、13、17、18、20和21分别存在于两例患者的CD8淋巴细胞中。相反,对PBLs的频谱分析显示,PAM患者和相同年龄的健康志愿者之间没有差异(图3)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba数据未显示)。GydF4y2Ba
讨论GydF4y2Ba
在研究的两个兄弟姐妹中,PAM的诊断是基于临床病史、典型的胸部x线表现(x线和HRCT)以及BALF中是否存在calcosperites,后者被认为是PAM的诊断依据(图4)GydF4y2Ba⇓GydF4y2Ba)。此外,目前的病人没有表现出远端或当前的肺泡感染的迹象,这可能会导致pamlike改变。因此,RatjenGydF4y2Baet al。GydF4y2Ba15GydF4y2Ba报告了一个不寻常的情况下,PAM,这是与强烈的淋巴细胞肺泡炎造成的淋巴细胞间质肺炎(唇)。从临床和放射学特征上看,唇瓣在本研究中被认为是不可能的。此外,没有任何潜在的系统性或自身免疫性疾病的迹象,这些疾病通常与嘴唇有关,而且所有的系统性自身抗体检测结果均为阴性。此外,受试者没有出现HIV或eb病毒感染,也没有其他病毒感染的证据。GydF4y2Ba
为了评估数据的可靠性和再现性,在不同的时间(3个月后)对两例患者重复进行BALF和血液分析。GydF4y2Ba
目前的结果表明,受家族PAM本强烈的淋巴细胞肺泡炎两个兄妹的BALF,其特征在于由CD8 + T细胞的患病率和在其TCR图案异常。在所有的BALF,流式细胞术揭示,在谱型分析在研究时间1进行CD8 + T细胞的一个意想不到的积累,所表示的受限制的BV基因的使用。一些在支气管肺泡灌洗液T淋巴细胞TCR剧目中发现的克隆性扩张的表现在两个PAM患者(家属6.2和7)相似的轮廓。为了本作者的知识,在家族PAM灌洗液正式免疫分析不是文献中获得。TCR库可以被定义为正常时,所有的BV家庭都以相当的频率表达,并表现出钟形“高斯”的个人资料。改变的轮廓,如在本研究的病人的BALF的淋巴细胞发现,可能反映任一种抗原驱动的克隆选择或免疫失调发生在肺泡腔的固有程序;确实,大多数表达的BV家庭被改变,并且只有一个BV家族(BV25和BV2分别在患者1和2)表示>的TCR的30%由CD8 + T细胞群中表达。不存在的PBLs中相同的改变的指示该扰动是不固有的CD8 + T淋巴细胞,但特异于BALF T淋巴细胞。GydF4y2Ba
也有在本研究中PAM所示的支气管肺泡灌洗液模式,据报道,在过敏性肺炎的亚急性期有什么之间有一些相似之处(HP)GydF4y2Ba16GydF4y2Ba。实际上,在使用BV基因有限数目的T细胞中积累的CD8 + T淋巴细胞肺泡炎已被记录在HPGydF4y2Ba10GydF4y2Ba,GydF4y2Ba17GydF4y2Ba,GydF4y2Ba18GydF4y2Ba。然而,本案件的病史和临床过程中没有提示的HP。此外,本作者无法检测相同的T细胞克隆在肺和在PAM受试者的血液中,如最近在患者HP报道。GydF4y2Ba
近日,CorutGydF4y2Baet al。GydF4y2Ba五GydF4y2Ba在一个大的家族中鉴定了负责PAM的基因,在一个大的家族中鉴定了纯合突变GydF4y2BaSLC34A2GydF4y2Ba(类型IIB磷酸钠协同转运蛋白基因)。在这一发现的光,可以肯定的是PAM是一种隐性遗传疾病呈现出完整的基因渗透,与扮演一个次要角色的环境因素。然而,与该基因或基因表达蛋白质产物的鉴定的突变的预测严重的影响相反,研究了Corut患者PAMGydF4y2Baet al。GydF4y2Ba五GydF4y2Ba有轻微的临床表型,吸烟者除外。这种缺乏基因型-表型相关性的情况也得到了大家族中受影响成员发病年龄差异的支持。GydF4y2Ba
由于对PAM相关基因突变的识别是最近才出现的,因此在本文完成后,作者没有对受试者的DNA进行检测GydF4y2BaSLC34A2GydF4y2Ba突变;然而,Corut记录了这种基因异常GydF4y2Baet al。GydF4y2Ba五GydF4y2Ba与PAM诊断和本作者的所有科目无关认为,这可能在他们的数据的解释意义。的IIb型磷酸钠协同转运起着无机磷酸盐的稳态关键作用,它只能在肺泡II型细胞,这是负责生产的表面活性剂,包括磷脂和表面活性蛋白(SP)表示在肺中,最其丰富的是SP-A和SP-dGydF4y2Ba19GydF4y2Ba。值得注意的是,肺泡淋巴细胞暴露在表面活性剂中,而表面活性剂反过来又可能抑制丝裂原诱导的淋巴细胞增殖GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba21GydF4y2Ba。此外,SP-d和SP-A可以提供先天免疫和适应性免疫之间的一个重要环节,通过树突状细胞和T细胞功能的调节GydF4y2Ba22GydF4y2Ba。SP-A和SP-D均可抑制肺泡内t细胞的活化,如果t细胞活化,则可导致炎症级联,可能导致肺损伤和气体交换受损GydF4y2Ba23GydF4y2Ba。因此,目前的作者推测,在PAM中,通过基因突变影响产生表面活性剂的上皮细胞中磷酸钠共转运蛋白,从而改变肺泡环境,可能决定了免疫效应反应的局部失衡。GydF4y2Ba
另外,PAM是一种隐性遗传疾病,同时具有家族性和散发性两种类型GydF4y2Ba五GydF4y2Ba,GydF4y2Ba24GydF4y2Ba,GydF4y2Ba25GydF4y2Ba在土耳其和意大利病例中,家族性病例的比例很高。有趣的是,在本PAM病例中对系谱树的检查显示,在父系克隆t细胞异常已被报道的地方,一个重要的血亲等级与慢性肝病和肝硬化的高频率有关GydF4y2Ba26GydF4y2Ba,GydF4y2Ba27GydF4y2Ba。GydF4y2Ba
综上所述,在本研究的家族性肺泡微结石病例中,在支气管肺泡灌洗液中发现了一种严重的淋巴细胞性肺泡炎,并伴有CD8+ t细胞的流行,同时伴有t细胞受体模式的异常。从目前的研究来看,问题仍然是:这是迄今为止尚未被认识的肺泡微结石的组成部分,还是一种特殊的(或其他)反应,仅局限于这一特定的谱系。需要进行更多的研究来检查支气管肺泡灌洗细胞的异常与肺泡微结石最近被描述的遗传背景之间的关系,以了解这种罕见的、目前无法治疗的弥漫性肺病组织损伤的细胞和分子机制GydF4y2Ba28GydF4y2Ba。GydF4y2Ba
致谢GydF4y2Ba
作者要感谢C. Calabrese对显微成像的支持。GydF4y2Ba
- 收到GydF4y2Ba2006年11月6日。GydF4y2Ba
- 公认GydF4y2Ba2007年1月8日。GydF4y2Ba
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