文摘
本研究调查的影响增加通风在信使核糖核酸(mRNA)的表达水平的血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)和转换factor-β增长1(TGF-β1隔膜)的完整,清醒,自发呼吸老鼠,而反应瘫痪,机械通风动物相似的血气和通气水平。
四组的完整,老鼠研究于一体的盒子,每组四个气体之一:呼吸室内空气,12%的氧气(O2),5%二氧化碳(有限公司2O),或12%2+ 5%股份有限公司21 h。另外4组瘫痪,机械通风动物匹配对动脉血气和通气水平。
结果表明,VEGF mRNA丰富bFGF 1.5倍的增加了三倍,12% O2+ 5%股份有限公司2呼吸,但TGF-β吗1没有改变。显著线性关系的VEGF和bFGF mRNA在清醒动物观察每分通气量(r0.98, p < 0.02, r = 0.87, p < 0.03,分别)。瘫痪,增加机械通风动物没有信使rna探针。系统性缺氧没有额外的影响VEGF或隔膜bFGF的水平。
是得出结论,信使核糖核酸的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在横膈膜上升明显由于活跃的通风,而不是由于血液气体/ pH值变化或被动肌肉缩短本身。
本研究由美国国立卫生研究所的科研补助金,心肺(美国)批准号NIH HL17731。
众所周知,骨骼肌的主要适应重复运动(耐力训练)是新毛细血管的形成(血管)1- - - - - -3。血管生成是一个极其复杂的过程,涉及等步骤解散内皮细胞外基质,细胞迁移和内皮细胞增殖4,5。在恶性肿瘤生长或发展,它已经表明,血管内皮生长因子(VEGF)等因素,基本成纤维细胞生长因子(bFGF)和转换factor-β增长1(TGF-β1参与新毛细血管的形成6- - - - - -8。
已经表明,一个1小时的正常骨骼肌的运动增加了信使核糖核酸(mRNA) VEGF水平,bFGF和TGF-β19(所以在缺氧的VEGF,特别是)。此外,电刺激增加VEGF水平10。最近,这是证明passively-induced hyperperfusion不会增加肌肉VEGF mRNA,推测,细胞内缺氧或机械收缩的影响本身(如纤维拉伸)可能增加负责11。
呼吸肌肉骨骼肌肉和应对耐力训练通过增加毛细血管密度,火车头一样的肌肉。然而,隔膜与机车骨骼肌的不同之处在于,它不断有节奏地合同,因此受到终身“耐力训练”。这些发现有相应的作者的注意力集中在呼吸的毛细管增长肌肉收缩,尤其是隔膜。因为众所周知,呼吸肌肉失败是一种危及生命的疾病,重要的是理解的规定毛细管呼吸肌肉的增长。此外,患者在重症监护病房(icu)通常是机械通风一段时间。因此可能缺乏主动呼吸肌肉工作在这些条件下可以减少呼吸道肌肉毛细现象,这可能导致呼吸困难断奶。
本研究的目的是探讨VEGF的响应,bFGF和TGF-β1信使rna在隔膜通风刺激增加了缺氧和/或血碳酸过多症。这些反应比较与瘫痪,机械通风动物相似的血气和通气水平,以确定是否主动收缩,被动运动或改变氧气分压(PO2)主要负责mRNA的变化。
这是表明,VEGF mRNA水平和bFGF增加1 h后接触这些刺激,这是每分通气量成正比上升。瘫痪,机械通风动物没有信使rna变化,对于任何血管生成因子,表明被动缩短和缺氧。可能这些发现的临床意义进行了讨论。
方法
成年女性Wistar鼠是研究中使用。48动物研究±sd(平均年龄9.2±1.1周,体重272±13 g)。动物学科委员会批准的这项研究是加州大学圣地亚哥,美国。
协议我:完整的动物
四个组,每组六个动物进行了研究。动脉线(PE-50)放置在股动脉在短期氟烷麻醉,使用无菌技术。导管定位皮肤下,退出的动物的脖子。导管肝素化,限制和动物被允许从麻醉恢复至少24小时。第二天,正常动物身体轻松定位成盒(30厘米×18厘米)。动脉线是连接到一个密封的盒子,为了收回动脉血液样本在实验。动物自发呼吸室内空气10 - 20分钟(基本条件),和呼吸机参数的测量(潮汐卷(VT)和呼吸频率(fR)是根据巴特利特和Tenney的方法12。每分通气量V”E计算使用方程V”E=VT×fr .此外,动脉血液样本(1毫升)是测量血液的气体(仪器实验室、1306型)。此后,动物自发呼吸室内空气(A =对照组)或12% O2N + 88%2(B =低氧组),或5%股份有限公司2啊,+ 21%2N + 74%2(C = hypercapnic组)或12% O2+ 5%股份有限公司2N + 83%2(D =缺氧+ hypercapnic集团)1 h。激发了体内的气体浓度的盒子被质谱计连续测量(珀金埃尔默公司1100;珀金埃尔默,Saira路易,密苏里州,美国)。
的测量VT,fR,血液气体是经过30、45到60分钟的呼吸不同的混合物。1 h后暴露在指定气体,这些动物被管理1毫升的戊巴比妥钠安乐死通过动脉线。隔膜是立即删除并迅速在液态氮冷冻总细胞信使rna的隔离。
协议II:动物麻醉,瘫痪,机械通风。
另一个动物的四组(6)与腹腔内戊巴比妥钠麻醉(40 mg·公斤1)和泮库promide瘫痪注射。(2 mg·公斤1)动物tracheostomized和机械通风啮齿动物呼吸机(哈佛大学# 683;美国哈佛大学、波士顿,MA)。连接管的死腔是< 1毫升。此外,动脉导管放置到股动脉。通风机将产生一个每分通气量相当于协议的完整的动物我在安静的房间里空气呼吸来匹配他们的血液气体。15分钟后基线测量,动物呼吸室内空气(控制)或12% O2N + 88%2有限公司(缺氧),或5%2+ 21%啊2N + 74%2O (hypercapnic)或12%2+ 5%股份有限公司2N + 83%2(缺氧+ hypercapnic)、气体混合物。通风机是集(fR和V”T)通气水平相匹配的完整的动物和他们的血液气体在每个相应的实验条件协议即1 h机械通气后,动物安乐死,和隔膜被处理的完整,自发呼吸动物(协议)。
核糖核酸隔离和北部污点分析
总细胞核糖核酸(RNA)被孤立的从每个肌肉样本Chomczynski和萨基的方法13。RNA准备被吸光度测定的数量在260 nm,和完整无缺被溴化乙锭染色法进行评估。10微克细胞总RNA分离甲醛6.6% - 1%琼脂糖凝胶电泳。分馏RNA由北部污点被转移到一个ζ探针膜(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。RNA被紫外线辐照交联膜的使用紫外线交联剂(模型FD-UVXL 1000;费舍尔科学、汉普顿,美国NH)和储存在4°C。这些墨迹被探测与oligolabelled [a -32磷)脱氧胞苷三磷酸互补脱氧核糖核酸探针(互补),一个特定活动的≥1×109衰变·敏1·μg DNA114。人类的VEGF探针是0.93 - k cDNA片段隔绝生态R我pUC-derived质粒6。人类TGF-β1互补脱氧核糖核酸探针是0.985 kb后三世。Xba我克隆插入pBlue-script II KS+向量15。bFGF探针是1 kbXho我人类bFGF cDNA片段5。甲酰胺Prehybridization和杂交过程中执行50%,5 x SSC (20 x SSC 0.3 M氯化钠和0.3 M柠檬酸钠),10 x Denhardt的解决方案(100 x Denhardt聚乙烯吡咯烷酮聚蔗糖的解决方案是2%和2%),50 mM磷酸钠(pH值6.5),1% SDS,μg·250毫升1用鲑鱼精子DNA在37或42°C。墨迹洗2 x SSC和0.1% SDS在室温下,O.1X SSC和0.1% SDS VEGF mRNA在55°C, 1 x SSC和0.1% SDS TGF-β60°C1和bFGF mrna。的屁股暴露在XAR-5 x光照片电影(美国伊士曼柯达公司,纽黑文,CT)使用Cronex闪电+屏幕在-70°C。在所有分析,定量测密度术的放射能照像是用来测量三个生长因子mRNA水平。每一个污点随后reprobed(之前复合物之后)cDNA特定18 s核糖体RNA,这个信号是规范化信使RNA信号用于小车道荷载的变化。
统计分析
统计方法,定量测量的微使用所有三个生长因子mRNA水平。车道荷载变化控制的标准化与18 s核糖体RNA信号控制乐队。单向方差分析是用来确定mRNA水平变化与增加通风。线性关系进行了最小二乘法和Mann-Whitney清醒完整测试是用来确定差异(I)和瘫痪的通风(P)动物。统计学意义是接受如果p≤0.05。
结果
通气参数的结果(VT,fR,V”E)和血液气体(pH值、动脉血液中氧含量(P啊,一个2),动脉血液中二氧化碳张力(P,有限公司2)清醒,完好无损(I)自发呼吸瘫痪(P),表1中总结了机械通风的动物⇓。发现没有明显的统计学差异变量的平均值之间的完整讨论(I)和瘫痪(P)动物呼吸相同的气体混合物。虽然平均pH值在瘫痪的动物较低(7.28)比完好无损(I)(7.38)在缺氧+ hypercapnic运行期间,建议一种温和的代谢性酸中毒,这些差异并不显著。因此,实验要求测试完整的和瘫痪的动物相似的通气水平下,气体和血液酸碱条件得到满足。此外,表1⇓表明每分通气量(V”E)显著增加由于缺氧和/或血碳酸过多症的自然呼吸的动物。
图1⇓显示了北方滴VEGF, bFGF和TGF-β1隔膜的mRNA水平从协议后我在完整的自发呼吸动物1 h(增加通风造成的缺氧和/或血碳酸过多症。很明显,与缺氧和/或血碳酸过多症VEGF和bFGF mRNA丰度增加。
![图1. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/4/681/F1.medium.gif)
北部滴血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β),基本fibroplast生长因子(bFGF)归一化到18 s核糖体RNA (Rn 18岁)醒着,自然呼吸的动物:控制(室内空气),低氧(12%啊2),hypercapnic(5%有限公司2)和缺氧和hypercapnic(12%啊2+ 5%股份有限公司2)条件。
北方能够从协议相同的血管新生因子II动物麻醉,瘫痪和机械通风是如图2所示⇓。可以看出,没有明显的VEGF的变化发生在这些实验条件。
北方滴血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),转化生长因子(TGF-β1)和RN18S规范化。在麻醉、瘫痪和机械通风的动物。
VEGF mRNA的归一化值,bFGF和TGF-β1隔膜的完整的动物(协议)和瘫痪,机械通风动物(协议II)如图3所示⇓。VEGF mRNA增加2.5倍以上的控制条件(呼吸室内空气)完整的自发呼吸动物1 h后增加通风(5%股份有限公司2阿加12%2)。同样,bFGF增加约1.5倍,增加显著(p < 0.0017, p < 0.001),增加通风。相比之下,TGF-β11 h后mRNA水平并没有改变呼吸的四个实验条件下完整的动物(图。3⇓)。
![图3. -](http://www.qdcxjkg.com/content/erj/17/4/681/F3.medium.gif)
均值±sem的归一化值信使核糖核酸(mRNA)的血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),转化生长因子(TGF-β1)完好无损的隔膜,清醒,自发呼吸(I)和麻醉瘫痪(P),机械通风动物呼吸。□:室内空气;└:12%啊2;
:5%的公司2O和┘:12%2+ 5%股份有限公司2。*:明显不同于室内空气。
没有重大变化的三个生长因子mRNA水平观察在瘫痪的动物当他们机械通风通气水平高(类似于那些在完整的动物)和类似的pH值和血液气体。增加的趋势在mRNA水平三个因素被认为的瘫痪期间动物缺氧(图3所示⇑、孵化酒吧),但是这并没有达到统计学意义。bFGF的mRNA水平在缺氧和高碳酸血症(图3所示⇑,孵化bar)实际上降低了。
图4一⇓显示每分通气量之间的关系(V”E)和平均VEGF mRNA水平正常化,bFGF和TGF-β1在隔膜。之间存在显著的线性关系V”E和VEGF (r = 0.98, p < 0.02)和之间V”E和bFGF (r = 0.87, p < 0.03)但不是之间V”E和TGF-β1。
每分通气量之间的关系(V”E),信使核糖核酸(mRNA)的血管内皮生长因子水平,基本成纤维细胞生长因子和改变控制增长factor-β1隔膜,缺氧和/或hypercapnic条件。醒着),完好无损,自发呼吸动物;b)在瘫痪的机械通风的动物。•:VEGF完好无损(r = 0.980, p < 0.002);▴:bFGF完好无损(r = 0.870, p < 0.03);♦:TGF-β1完好无损(无意义的;ns);○:VEGF瘫痪(ns);▵:bFGF (ns);⋄:TGF-β1 (ns)。
观察无显著关系之间已经和三个生长因子mRNA丰富瘫痪通风动物(图4 b⇑)。
最后,被发现在mRNA水平和无显著关系P啊,一个2,P,有限公司2,(图5所示⇓)或动脉pH值的完整,清醒,自发呼吸或瘫痪的动物。
块信使核糖核酸(mRNA)水平的血管内皮生长因子(VEGF;•○),基本成纤维细胞生长因子(bFGF;▴▵)和转化生长因子(TGF-β1;♦⋄)与动脉氧张力(P啊,一个2)完好无损(关闭)和瘫痪(打开符号)动物控制,缺氧和/或hypercapnic条件。b)类似的情节VEGF mRNA水平、bFGF和TGF-β1与动脉二氧化碳张力(P,有限公司2)的完整和瘫痪的动物。以上是显著的关系。
讨论
本研究的主要发现是,VEGF mRNA水平和bFGF在隔膜增加1 h(积极增加通风,通风比例,但无关P啊,一个2和P,有限公司2。那些TGF-β1在相同的实验条件下并没有改变。
本研究的设计使得评估的独立的作用:1)主动收缩;b)系统性的低氧血;和c)被动肌肉缩短机械通气中生长因子基因的反应。基于作者之前的工作在运动性骨骼肌9,16- - - - - -19,显示一个增强VEGF mRNA反应缺氧,研究瘫痪,通风动物控制与类似的血气值作为积极呼吸动物提供的方法区分a)和b)。与运动性骨骼肌系统缺氧就没有刺激mRNA水平的隔膜在瘫痪的实验。因此,隔膜的数据表明,主动收缩需要增加的基因表达和缺氧本身不是分摊。瘫痪的其他结论,可以控制动物是被动换气过度,因此纤维缩短也可以排除导致基因响应。为什么隔膜似乎对系统性缺氧水平增加VEGF mRNA即使在休息腓肠肌相同的物种还不清楚,但是没有能力测量细胞内P啊,一个2在这两种情况下,是不可能提供一个清晰的答案。本协议的另一个弱点是,肢体肌肉澄清系统缺氧的影响并不包括在内。
Ameredes的结果等。20.支持目前的结果证明隔膜相对不敏感短(24分钟)O的变化2提供在中度缺氧(吸入氧气分数(F阿,我2)= 0.13)。他们推测,这可能反映了不同代谢或缩短收缩隔膜的血流特征。这可能是可视化更好如果考虑隔膜的几何形状,就像一个圆顶(弯曲)与骨骼肌的线性性质。横隔膜肌肉长度较短的血流增强21和活跃的肌肉缩短可能优化毛细管配置22。因此,动脉缺氧不能准确反映O的分压2在横隔膜肌肉纤维。另一种解释为不同的横隔膜的系统性反应比在低氧血VEGF在隔膜的腓肠肌可能是由另一个机制即腺苷途径23。
TGF-β缺乏变化1有效通风后并不意外。布林的研究等。9显示更高的信号比TGF-βVEGF和bFGF1运动后。此外,罗卡角的研究等。11显示增加VEGF mRNA的电刺激后而不是在mRNA水平bFGF和TGF-β1。尽管这些结果在另一个物种(狗)和不同实验条件下,很明显,主要的血管生成因子基因响应骨骼肌肉和呼吸的VEGF。短半衰期的VEGF mRNA水平血管平滑肌24可以解释急性增加VEGF作为早期应对增加的代谢需要。
基本的FGF,尽管直接血管生成因子,更广泛的程控特异性。有人推测bFGF可能代表一个长期的肌肉刺激8。本实验只持续了1 h,可能不足以测试这个假说。然而,VEGF的增加在bFGF小于同意这个建议。
众所周知,VEGF表达在转录调控25,转录后26- - - - - -28和转化29日的水平。VEGF upregulation通过缺氧已经证明在体外和在活的有机体内和诱导新生血管形成30.。此外,已经有一些研究报告,延伸移植VEGF表达的心31日在培养的心脏细胞32。似乎这段诱导VEGF介导TGF-β部分。然而,这个网络各种血管生成因素并不完全理解之间的交互和这项研究的结果为进一步的研究提供了一个理由监管区域的血管生成生长因子的基因。特别是,还需要进一步的实验来调查mRNA水平之间的关系,这些血管生成因子的蛋白质含量的隔膜。
总的来说,血管生成生长因子为中介的重要生理作用的动态血管化组织为了满足新陈代谢,营养和氧气供应的要求。这项研究的结果表明,upregulation VEGF mRNA水平的早期反应增加机械隔膜造成紧张局势增加通风。此外,这些数据表明,血管生成生长因子基因表达的隔膜膈负载敏感,这就提出了一个未来的可能性增强膈血管治疗呼吸衰竭患者的增长可能导致经济复苏(断奶从呼吸机)。而必须做进一步的工作来评估这一假说,心肌的研究33,34和缺血性血管疾病35表明定向生长因子政府改善局部血液供应吗36- - - - - -40。
总之,这项研究的结果表明,活性增加通风的缺氧和/或血碳酸过多症上调血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子信使核糖核酸水平的隔膜,这每分通气量成正比增加。在瘫痪的机械通风动物动脉血气和通气水平相似,信使核糖核酸水平没有变化的三个血管生成因素研究观察。因此,中度缺氧和被动缩短肌肉没有额外的效果。最后,血管生成基因的反应隔膜取决于主动收缩隔膜。
- 收到了1999年10月14日。
- 接受2000年11月7日。
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