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呼吸系统的研究

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电子香烟暴露对小鼠慢性尼古丁依赖的方式引起慢性阻塞性肺病的特征

Itsaso Garcia-Arcos1,2,
帕特里克·格拉提神1,2,
娜塔莉Baumlin3,
迈克尔·坎波斯3,
Abdoulaye朱尔斯达博1,2,
•克尔Jundi4,
内维尔康明斯5,
爱德华伊甸园5,
阿斯特丽德Grosche3,
马提亚Salathe3,
罗伯特Foronjy1,2

¹的肺和危重病医学,纽约州立大学州南部医学中心,纽约布鲁克林美国
²细胞生物学系,纽约州立大学州南部医学中心,纽约布鲁克林美国
³肺,过敏,急救护理和睡眠医学,迈阿密大学米勒医学院的,迈阿密,佛罗里达美国
⁴医学系的,皇家外科医师学院在爱尔兰,都柏林、爱尔兰
⁵肺,急救护理和睡眠医学,西乃山圣卢克罗斯福健康科学中心,纽约,纽约美国

对应到博士罗伯特•Foronjy肺和危重病医学,纽约州立大学州南部医学中心,布鲁克林,纽约11203年,美国;Robert.Foronjy在}{downstate.edu

文摘

背景电子(e)香烟的使用正在迅速增加,但他们的肺部健康的影响并不成立。临床研究潜在的长期影响缴获用于肺部健康将需要几十年的时间。为了解决这个差距在知识,本研究调查的影响接触aerosolised尼古丁自由和含有尼古丁的烟液在小鼠肺和正常人气道上皮细胞。

方法老鼠被暴露于aerosolised磷酸盐,尼古丁自由或含有尼古丁烟解决方案,1小时每天4个月。正常的人类支气管上皮细胞(NHBE)细胞培养在一个气液界面暴露在烟蒸汽或接触尼古丁的解决方案使用Vitrocell烟机器人。

结果吸入含有尼古丁的电子烟增加气道hyper-reactivity,远端领空增大,粘蛋白生产、细胞因子、蛋白酶的表达。暴露在尼古丁自由电子烟并不影响这些肺参数。NHBE细胞暴露于含有尼古丁烟蒸汽显示纤毛受损拍频,气道表面液体体积,囊性纤维化跨膜监管机构和ATP-stimulated K +离子电导和减少FOXJ1、KCNMA1的表情。尼古丁暴露NHBE细胞5天白介素(IL) 6和引发分泌增加。

结论接触吸入烟液内含有尼古丁触发效果通常与慢性阻塞性肺病的发展包括细胞因子表达,气道hyper-reactivity和肺组织破坏。这些影响是尼古丁依赖鼠标肺和人工气道细胞,这表明吸入尼古丁导致气道和肺部疾病除了其上瘾的特性。因此,这些研究结果突出尼古丁吸入烟期间使用的潜在危险。

慢性阻塞性肺病盟机制
肺气肿
慢性阻塞性肺病的病理

这是一个开放的分布式条188滚球软件依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和其派生作品在不同的条款进行许可,提供了最初的工作是正确地引用和非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/thoraxjnl - 2015 - 208039

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关键信息

关键问题是什么?

什么是电子(e)烟吸入肺的后果吗?

底线是什么?

这些发现表明,吸入的尼古丁在电子烟改变炎症、离子电导和黏膜纤毛的功能在人类支气管上皮细胞和诱发气道hyper-reactivity和空气空间扩大暴露小鼠。

为什么要读吗?

本研究提供了洞察肺部健康电子烟的影响,还涉及尼古丁作为诱发因素在慢性阻塞性肺病的发生和进展。

介绍

暴露于吸烟是最主要的可预防的死亡原因在美国。大多数的慢性阻塞性肺病死亡与吸烟暴露有关,与慢性阻塞性肺病现在排名在美国死亡的第三大原因1它预计将成为全球第三大主因在未来20年。2戒烟可以降低一些疾病的风险,可以增加寿命。2虽然吸烟流行在美国减少在过去的50年里,大约19%的人口继续吸烟。3虽然尼古丁替代疗法(NRT)帮助,几乎93%的吸烟者将在6个月内复发尽管NRT的辞职。4鉴于这些困难与戒烟和巨大的公共卫生负担由慢性阻塞性肺病,一些医疗的倡导者们认为电子(e)香烟更安全的替代那些人不能戒烟。5

电子烟是有效地交付设备和气液尼古丁肺部。用户可以选择烟的尼古丁浓度液体(e-liquid)加载到设备的墨盒。当用户吸入,e-liquid,主要是尼古丁在丙二醇(PG)或蔬菜甘油(VG),加热产生的蒸汽吸入肺部。尽管许多可用的口味和品种,几乎所有的消费者选择e-liquids含有尼古丁。6最近的研究表明,由于电子烟暴露可能会带来一些未来的健康问题。电子烟的使用增强了小鼠氧化应激和炎症7和损害的免疫防御细菌和病毒感染。8这也暗示在暴露于二手烟电子烟的尼古丁含量显著提高室内空气,让吸毒者二手蒸气。9尼古丁增强气道hyper-reactivity lipopolysaccharide-challenged小鼠肺上皮细胞和炎症。10尼古丁还会抑制细胞凋亡在肺肿瘤。11然而,尼古丁的生物效应传递到肺部的电子烟没有彻底研究。

在这里,我们使用体外和体内模型来评估生物由于电子烟的使用对老鼠的影响肺和正常的人类支气管上皮细胞(NHBE)收集的一系列人体。本研究发现,电子烟吸入尼古丁触发效果与COPD的发病和进展:空域扩大,粘液细胞肥大、释放炎症介质和改变上皮纤毛功能。收集的数据提供了直接证据的潜在有害影响的电子烟,特别是尼古丁吸入到肺。

方法

在活的有机体内吸入烟液

所有动物实验与罗斯福西奈山医疗中心的批准机构的动物保健和使用委员会。我们开发了一个体内烟暴露模型使用一个鼠标派笼(MPC)药物气溶胶喷雾器(美国马萨诸塞州布伦特里科学、布伦特里)。为4个月(5天/周),A / J小鼠年龄12周(杰克逊实验室)全身暴露在0.4毫升的磷酸盐(PBS)或烟车辆(PG和VG 50/50;美国eLiquid商店)包含0或18毫克/毫升尼古丁(美国eLiquid商店)。所有液体都预热至37°C nebulisation之前和暴露持续了1小时。过去24小时后小鼠安乐死曝光。支气管肺泡灌洗液(BALF)收集和免疫细胞量化如前所述。12等离子体可替宁含量测量后使用商用设备和制造商的指令(美国加州Abnova、核桃)。

气道对乙酰甲胆碱的挑战

气道反应增加剂量的醋甲胆碱(σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国)评估与Scireq Flexivent系统(Scireq,蒙特利尔,魁北克,加拿大)在小鼠暴露于4个月的PBS和e-liquid包含0或18毫克/毫升尼古丁。动物犀牛与氯胺酮和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)和瘫痪是诱导1毫克/公斤泮库溴铵腹腔内。基线测量肺功能(用力呼气流量的50% FVC (FEF₅₀前))测定乙酰甲胆碱挑战在老鼠身上。线性单舱模型被用来评估呼吸系统总阻力。

组织学分析

肺部接受pressure-fixation和固定组织处理和圆)彩色形态测量学的分析如前所述。13粘蛋白与阿尔新蓝染色和复染色番红精O使用商用设备(Abcam,剑桥,麻萨诸塞州,美国)。免疫荧光,幻灯片被封锁在PBS 10%山羊血清1小时在室温下。幻灯片是孵化主要抗体(兔多克隆anti-MUC5AC免疫球蛋白,1:50稀释;圣克鲁斯生物)或兔子山羊血清免疫球蛋白g -控制在5% 1%牛血清白蛋白在PBS一夜之间在4°C,然后用二次抗体(驴antirabbit免疫球蛋白g - 546, 1:200稀释)在室温下1小时。免疫反应性是与荧光显微镜数字化视觉效果。量化组织的巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞被发现在幻灯片主要抗体;兔多克隆anti-MAC3, antineutrophil弹性蛋白酶或anti-CD3免疫球蛋白(Abcam;1:50稀释)。免疫细胞是量化随机选择从10×400从每个小鼠肺组织的图像部分。

细胞生存能力分析

对石蜡包埋组织的细胞凋亡测定末端转移酶的dUTP尼克end-labelling (TUNEL)原位细胞死亡据美联社(罗氏诊断),检测设备制造商的指示。对于每一个肺,10个随机部分得到三个不同深度的组织切片和至少1000个细胞/部分染色后视觉评估。积极的标签总核的细胞被表示为一个百分比。半胱天冬酶活动测量如前所述,3/714使用商用Caspase-Glo 3/7分析系统(美国密歇根州Promega,菲奇堡)。体外细胞生存能力是由乳酸脱氢酶(LDH)释放到媒体使用商用试验(西格玛奥德里奇)。

qPCR, MMP和细胞因子蛋白检测

RNA分离使用试剂盒RNeasy装备和互补DNA(互补)反向转录使用高容量应用生物系统公司cDNA工具包。qPCR执行在Bio-Rad CFX384实时系统使用验证TaqMan探针(生命技术/应用生物系统公司)。qPCR表示为相对量化的结果。基因表达是正常β-actin或3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

细胞因子蛋白水平测定在培养基使用珠子化验Bio-Rad Bio-Plex 200系统(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州,美国)。胶原酶单位计算数量的µmoles亮氨酸解放每毫克的酶,由比色茚三酮的方法。15组织蛋白酶活性测定进行了如前所述。16

免疫印迹分析

肺组织是单一化的四卷radioimmunoprecipitation分析缓冲区。相同浓度的蛋白质免疫印迹了磷酸化PKCα(p-PKCα)PKCα,磷酸化细胞外调节激酶(ERK), ERK和β-actin(细胞信号技术,丹弗斯,马萨诸塞州,美国)。化学发光检测和量化分子成像仪ChemiDoc XRS + (Bio-Rad)。微执行,表示为一个像素的强度比磷酸化蛋白和总蛋白相比,使用Bio-Rad实验室图像实验室软件(V.4.0,建立16)。

在体外分析NHBE细胞

NHBE细胞分离得到适当答应了捐助者的肺被发现不适合移植。15个捐助者是不吸烟者没有已知的呼吸道疾病,5 25-58岁女性和10个男性。从种族方面,有10个白种人,1 2非裔美国人,西班牙裔白人和2个未知数。扩张后,细胞在气液界面(ALI) redifferentiated collagen-coated 12毫米Transwell插入(康宁,洛厄尔,麻萨诸塞州,美国)。17日至19日细胞暴露于36个泡芙的汽化e-liquid包含0或使用但它还是36毫克/毫升尼古丁暴露系统(Vitrocell系统、Waldkirch德国),应用70毫升吹卷每30年代。细胞也被暴露在尼古丁(0或100μM,估计最后100海里尼古丁浓度在气道表面液体(ASL) nebulisation后)aerosolised云中的系统(Vitrocell系统)或baseolaterally补充尼古丁(0、1或10μM) 12小时或5天。

离子通道功能和黏膜纤毛的清除

短路电流(Isc)和纤毛拍频(CBF)记录在以下时间点:但它还是系统中的蒸汽接触8小时后,4个小时后nebulised尼古丁在云系统和基底后12小时的尼古丁。20.囊性纤维化跨膜调节器(雌性生殖道函数是由减少Isc添加CFTR-inh后细胞刺激10µM forskolin存在10µM阿米洛利室温。顶端,ATP-stimulated K + (BK)电流测量如前所述。20.

测量的美国手语和纤毛表面百分比

24小时后细胞暴露在12毫米插入到36泡芙缴获蒸汽与0或36毫克/毫升尼古丁但它还是曝光系统,文化一个爱普生平板扫描仪成像和图像分析为半月板卷使用ImageJ软件(马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院、美国),请提供的迈克尔Myerburg(匹兹堡大学)。完全redifferentiated NHBE细胞被固定,阻塞和彩色单克隆antitubulin乙酰化抗体(1:10 000稀释;西格玛奥德里奇)检测纤毛。%纤毛区决心使用ImageJ软件。

统计分析

弗里德曼野生D 'Agostino-Pearson综合正常测试,非参数测试和学生的学习任务进行所有的数据集。单向方差分析被用于比较两组以上的后跟一个事后考验人类细胞样本线性趋势分析。数据被表示为点阴谋与线表示均值和酒吧表示SEM。GraphPad棱镜软件(美国加州拉霍亚,GraphPad)是用于所有数据分析和图形化表示。

结果

接触吸入含有尼古丁烟液诱发气道hyper-reactivity和空域肿大

老鼠被暴露于aerosolised PBS和e-liquid(0和18毫克/毫升尼古丁)每天4个月。接触aerosolised含有尼古丁电子烟增加等离子体可替宁,尼古丁降解产物,证明尼古丁是有效地交付给小鼠的肺部和吸收系统(图1A)。气道hyper-reactivity被醋甲胆碱挑战测试评估。在每个剂量醋甲胆碱≥1毫克/毫升,小鼠暴露于含有尼古丁烟液体显示呼吸阻力明显高于小鼠暴露于aerosolised PBS或烟不含有尼古丁的液体(图1B和在线补充图S1)。没有发现不同的气道hyper-reactivity小鼠暴露于尼古丁自由烟液体相比,小鼠暴露于PBS。肺功能检查基线变化由于烟,用力呼气流量(FEF 50%₅₀)的FVC决心。FEF₅₀/ FVC比率从23±1.2显著降低小鼠暴露于尼古丁自由烟液在小鼠暴露于电子烟15±1.5包含18毫克/毫升尼古丁(平均±扫描电镜;p < 0.01),表明阻塞的小航空公司(图1C)。

Lung function in mice exposed to inhaled phosphate-buffered saline (PBS), nicotine-free and nicotine-containing e-cigarette fluids. Mice were exposed daily to inhaled PBS, nicotine-free (EC vehicle, 0 mg/mL) or nicotine-containing (EC vehicle, 18 mg/mL) e-cigarette fluid for 4 months and nicotine absorption was confirmed by (A) plasma cotinine levels. (B) Airway hyperresponsiveness to increasing doses of methacholine was assessed in each animal group. (C) Negative pressure-driven forced expiratory and forced oscillation technique manoeuvres were performed to determine changes in pulmonary mechanics in all animal groups. Forced expiratory flow at 50% of FVC (FEF₅₀) were determined in each animal. (D) Representative H&E-stained images of fixed lung parenchyma from mice exposed daily for 4 months (scale bar=100 µm) and quantification of surface area/unit volume, fractional volume and mean linear intercept. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥6 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test. EC, e-cigarette.

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图1

肺功能在老鼠身上暴露吸入磷酸盐(PBS)尼古丁自由和烟液内含有尼古丁。老鼠暴露每天吸入PBS,尼古丁自由(EC车辆,0毫克/毫升)或含有尼古丁(EC车辆,18毫克/毫升)为4个月和尼古丁烟液吸收(A)证实了等离子体可替宁的水平。(B)增加气道高反应的剂量乙酰甲胆碱在每个动物组评估。(C)等负面压力用力呼气,强迫振荡技术策略进行了确定肺力学在所有动物群体的变化。用力呼气流量的50% FVC (FEF₅₀在每个动物)测定。(D)代表H&E-stained固定肺实质图像从小鼠暴露每天4个月(比例尺= 100µm)和量化的表面积/单位体积,体积分数和平均线性拦截。图表示为均值±SEM的三个测量。p值显示,比较两种治疗由线连接。所有n≥6每组。两个个体之间的对比组是由学生的学习任务。电子商务,包括烟。

补充数据

[thoraxjnl - 2015 - 208039 - supp_figures.pdf]

小鼠暴露于吸入含有尼古丁的烟液显示重要的领空扩大,而尼古丁自由烟液体或PBS接触没有影响肺架构(图1D)。意思是线性拦截,表面积/单位体积比和体积分数计算H&E-stained肺部分。这三个参数改变的小鼠暴露于含有尼古丁烟液:意思是线性拦截增加/单位体积的表面积和体积分数下降(p < 0.05;图1D)。没有区别的这些参数之间观察到小鼠暴露于尼古丁自由烟液体或PBS (图1D)。

尼古丁吸入增强肺部炎性细胞浸润。经过2周的曝光,BALF细胞从130增加000±27 000细胞/鼠标在小鼠暴露于尼古丁自由烟液体280 000±41 000细胞/鼠标小鼠暴露于含有尼古丁的烟液(p < 0.01;意味着±扫描电镜;在线补充图S2D)。经过4个月的接触,小鼠暴露于含有尼古丁烟液体显示,BALF细胞数量增加的趋势(图2)。Cytospins表明巨噬细胞中最丰富的细胞类型恢复支气管肺泡灌洗在所有三个条件,而嗜中性粒细胞和淋巴细胞构成一个小比例(图2),在肺泡巨噬细胞观察空间在所有鼠标组(图2B)和量化组织的炎症证明小鼠肺组织中巨噬细胞数升高受到烟液内含有尼古丁与其他组相比图2C)。嗜中性粒细胞和淋巴细胞数量没有改变(图2C)。

Lung inflammation in mice exposed to inhaled phosphate-buffered saline (PBS) and to nicotine-free e-cigarette fluids. Mice were exposed daily to inhaled PBS, nicotine-free (0 mg/mL) or nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette fluids for 4 months. (A) Total bronchoalveolar lavage fluid cells, macrophages, neutrophils and lymphocytes were quantified in mice exposed daily for 4 months. (B) Representative H&E-stained images of fixed lung parenchyma and macrophages from mice exposed daily for 4 months (scale bar=20 µm). (C) Tissue cellularity was quantified by measuring the average number of macrophages, neutrophils or lymphocytes per high powered field (×400). Ten randomly selected high powered images were used for quantification per mouse. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥7 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test. BALF, bronchoalveolar lavage fluid. EC, e-cigarette.

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图2

肺部炎症小鼠暴露于吸入磷酸盐(PBS)和尼古丁自由烟液体。老鼠暴露每天吸入PBS,尼古丁自由(0毫克/毫升)或含有尼古丁烟液体内(18毫克/毫升)4个月。(一)总支气管肺泡灌洗液细胞,巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞在小鼠暴露日常量化为4个月。(B)代表H&E-stained肺实质图像固定和巨噬细胞从老鼠暴露每天4个月(比例尺= 20µm)。(C)组织细胞结构被量化测量的平均数量巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞/高功率的字段(×400)。10个随机选择的高功率的图像被用于量化/鼠标。图表示为均值±SEM的三个测量。p值显示,比较两种治疗由线连接。所有n≥7每组。两个个体之间的对比组是由学生的学习任务。 BALF, bronchoalveolar lavage fluid. EC, e-cigarette.

尼古丁的烟液触发粘蛋白生产和细胞凋亡

气道粘蛋白生产增加小鼠暴露于含有尼古丁烟液体,如MUC5AC阿尔新蓝染色和荧光显微镜(图3)。老鼠暴露在含有尼古丁的烟液显示增加了二倍Muc5ac基因表达(p < 0.01;图3A)。肺结构细胞的凋亡是COPD的发病机制的另一个重要的事件。21估计TUNEL染色,细胞凋亡增加肺泡内和气道上皮的老鼠暴露在烟含有尼古丁的液体(图33/7 B)。半胱天冬酶的活动,从37±1.5个单位增加尼古丁自由发光的烟液暴露小鼠53±4.7单位的发光烟液内含有尼古丁暴露小鼠(p < 0.01;意味着±扫描电镜;图3B)。综上所述,电子烟中尼古丁促进气道hyper-reactivity,炎症、气道放大、粘液生产和肺细胞凋亡。

Histological analysis of lungs from mice exposed to inhaled nicotine-free and nicotine-containing e-cigarette aerosol. Mice were exposed daily to inhaled nicotine-free (0 mg/mL) or nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette aerosol for 4 months. Then, lungs were fixed and sectioned and stained for histological analysis. (A) Representative pictures of sections after Alcian blue stain and MUC5AC immunofluorescence (scale bar=20 µm). Graphs representing (A) qPCR analysis for Muc5ac are shown. (B) Representative images of sections after transferase dUTP nick end-labelling (TUNEL) (green) and DAPI (blue) staining from airway and alveolar regions of the lung (scale bar=20 µm). Percentage of TUNEL-positive cells quantified in each group and caspase 3/7 activity in lung tissue lysate are also shown. LU, luminescence units. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥5 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

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图3

组织学分析从小鼠暴露于肺部吸入尼古丁自由和含有尼古丁烟气溶胶。老鼠暴露每天吸入尼古丁自由(0毫克/毫升)或含有尼古丁烟气溶胶内(18毫克/毫升)4个月。然后,肺被固定,切片和染色组织学分析。(一)代表阿尔新蓝染色后的照片部分和MUC5AC免疫荧光(比例尺= 20µm)。图形表示(A) qPCR分析Muc5ac所示。(B)代表的图像部分后转移酶dUTP尼克end-labelling (TUNEL)(绿色)和DAPI染色(蓝色)从肺气道和肺泡地区(比例尺= 20µm)。TUNEL-positive细胞百分比量化在每组和半胱天冬酶活动3/7肺组织溶解产物也会显示出来。陆,发光单元。图表示为均值±SEM的三个测量。p值显示,比较两种治疗由线连接。所有n≥5每组。两个个体之间的对比组是由学生的学习任务。DAPI 4′, 6-diamidino-2-phenylindole。

烟含有的尼古丁的液体的原理诱导肺癌细胞因子和蛋白酶的表达

一些细胞因子和蛋白酶的表达与组织改造测量肺匀浆后2周(见在线补充图S2A-C)和4个月的接触(图4)。相比之下,暴露在吸入烟液体,缺少尼古丁(0 mg / mL),由于电子烟液含有尼古丁(18毫克/毫升)导致的表达显著增加Il-1β,单核细胞化学引诱物蛋白1(MCP-1),Cxcl10,il - 6和Cxcl2所有(p < 0.05;图4一个)。基质金属蛋白酶(MMP的)9和MMP-12和组织蛋白酶K和L1也显示增加信使RNA表达的小鼠暴露在烟含有的尼古丁的液体的原理(图4B)。胶原酶BALF活动增加了70% (p < 0.03)和组织蛋白酶BALF活动表现出增加的趋势BALF的老鼠暴露在烟含有尼古丁的液体(图4C)的表达Mcp-1,Muc5ac和CatK显示出类似的模式2周后暴露于含有尼古丁的电子烟(见在线补充图S2)。我们的发现表明通过烟吸入尼古丁的液体可以诱导细胞因子和蛋白酶表达和活动以类似的方式暴露于烟草香烟。

Cytokine and protease expression and activity in lungs from mice exposed to nicotine-free or nicotine-containing e-cigarette fluids. Mice were exposed to inhaled nicotine-free (0 mg/mL) or to nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette fluid for 4 months. Gene expression analysis by qPCR for (A) the cytokines IL-1β, MCP-1, CXCL10, IL-6, CXCL2 and CXCL5 and (B) proteases MMP-3, MMP-9, MMP-12, CatK, CatL1 and CatS. (C) Collagenase and cathepsin activity were measured in lung bronchoalveolar lavage fluid. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥5 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test.

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图4

细胞因子和蛋白酶表达和肺的活动从老鼠暴露在尼古丁自由或烟液内含有尼古丁。老鼠被暴露于吸入尼古丁自由(0毫克/毫升)或含有尼古丁烟液内(18毫克/毫升)4个月。基因表达分析qPCR (A)的细胞因子IL-1β,MCP-1,CXCL10,il - 6,CXCL2和CXCL5和(B)蛋白酶MMP-3,MMP-9,MMP-12,CatK,CatL1和猫。(C)胶原酶和组织蛋白酶活性测定肺支气管肺泡灌洗液。图表示为均值±SEM的三个测量。p值显示,比较两种治疗由线连接。所有n≥5每组。两个个体之间的对比组是由学生的学习任务。

吸入尼古丁的烟液激活PKCα/ ERK信号在肺

我们实验室曾表明PKCα和ERK的活化香烟监管肺部炎症和蛋白酶反应。22因为尼古丁能刺激α-7-nicotinic受体(α7nAchR) PKCα上游和ERK在人类肺上皮细胞,11,23我们问烟中尼古丁液体是否会激活这个信号机制。肺匀浆小鼠暴露于尼古丁的烟液显示PKCα磷酸化的增加和趋势增加肺的磷酸化ERK (图5)。值得注意的是,这个途径抑制防止领空扩大在肺部的烟smoke-exposed老鼠。22

PKCα and ERK activation in the lungs of mice exposed to inhaled vehicle or nicotine-containing e-cigarette fluid. Mice were exposed daily to inhaled nicotine-free (0 mg/mL) or to nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette fluid for 4 months. (A) Representative western blots for total and phosphorylated PKCα (p-PKCα) and ERK in lung tissue homogenates. β-Actin was used as a loading control. (B) Optical intensity quantification and calculated ratios of phosphorylated/total protein for PKCα and ERK. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n=9 per group for densitometry analysis. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test.

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图5

PKCα和ERK激活小鼠暴露于吸入肺部的车辆或烟液内含有尼古丁。老鼠暴露每天吸入尼古丁自由(0毫克/毫升)或含有尼古丁烟液内(18毫克/毫升)4个月。(一)代表西方的屁股,磷酸化PKCα(p-PKCα)和ERK在肺组织匀浆。β-Actin被用作加载控制。(B)光学强度量化和计算比率PKCα和ERK的磷酸化/总蛋白。图表示为均值±SEM的三个测量。p值显示,比较两种治疗由线连接。每组微密度分析所有n = 9。两个个体之间的对比组是由学生的学习任务。

烟的尼古丁液体改变NHBE细胞纤毛功能和细胞因子的生产

我们充分利用差异化的文化NHBE细胞评估烟蒸汽对纤毛功能内含有尼古丁的影响。NHBE细胞获得健康的捐赠者,培养在阿里和暴露于尼古丁自由或含有尼古丁烟蒸汽(图6),暴露在人间蒸发烟蒸汽没有影响NHBE细胞生存能力,由LDH化验(见在线补充图S3A)。纤毛跳动作为一个主要的航空公司的防御功能。24细胞暴露于含有尼古丁烟蒸气暴露后显著降低CBF 8小时(5.2±0.5 Hz vs 2.6±1赫兹;p = 0.01;p < 0.05;图6B)。因为在电子烟CBF减少暴露于尼古丁,顶端细胞表面的纤毛的每分钱决心NHBE细胞。没有显著差异的百分比在顶端表面纤毛区24小时后暴露在含有尼古丁烟蒸汽(图6C)。然而,ciliogenesis的主要监管机构的基因表达,FOXJ1在细胞减少暴露于含有尼古丁烟蒸汽(图6CFTR D)。离子通道的电导检测在细胞显著减少暴露于含有尼古丁烟蒸汽接触(8小时后图6E),独立的表达雌性生殖道基因(图6F)。离子通道的电导BK通道也显著降低细胞暴露于含有尼古丁烟蒸汽接触(8小时后图6G),同时减少了BK通道α亚基的表达(KCNMA1)基因调节美国手语。25美国手语体积变化明显下降,从14.6±2µL细胞暴露于尼古丁自由烟蒸汽后在24小时内暴露于3.8±1µL细胞暴露于含有尼古丁烟蒸汽(意味着±扫描电镜;p < 0.01;图6我)。因此,尼古丁的烟蒸汽直接影响纤毛功能。

Effects of vehicle and nicotine-containing e-cigarette vapour on normal human bronchial epithelial (NHBE) cells. (A) Scheme showing how fully differentiated NHBE cells, grown at an air–liquid interface (ALI), were exposed to vapour from vehicle (0 mg/mL) or from nicotine-containing (36 mg/mL) e-cigarettes. (B) Ciliary beat frequency significantly decreased after exposure to nicotine-containing e-cigarette vapour. (C) Cells were stained with DAPI and antiacetylated tubulin to visualise cilia, 24 hours after exposures. The % ciliated area was determined using ImageJ software. (D) qPCR for gene expression of FOXJ1. (E) Cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) ion conductance is significantly decreased after exposure to nicotine-containing e-cigarette vapour. (F) qPCR for gene expression of CFTR. (G) ATP-stimulated K+ (BK) ion conductance is significantly decreased after exposure to nicotine-containing e-cigarette vapour. (H) qPCR for gene expression of the α subunit of the BK channel (KCNMA1). (I) Measurement of airway surface liquid volume changes by refraction light microscopy. Graphs are represented as mean±SEM. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥5 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test.

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图6

影响车辆和含有尼古丁的烟蒸汽在正常的人类支气管上皮细胞(NHBE)。(A)方案展示完全分化NHBE细胞,生长在一个气液界面(ALI),暴露在蒸汽从车辆(0毫克/毫升)或含有尼古丁(36毫克/毫升)电子烟。(B)纤毛拍频后显著减少暴露于含有尼古丁烟蒸汽。(C)细胞与DAPI染色和antiacetylated微管蛋白想象纤毛,曝光后24小时。%纤毛区决心使用ImageJ软件。(D) qPCR基因表达的FOXJ1。(E)囊性纤维化跨膜调节器(雌性生殖道)离子电导明显下降后暴露在含有尼古丁烟蒸汽。(F) qPCR基因表达的雌性生殖道。(BK) (G) ATP-stimulated K +离子电导明显下降后暴露在含有尼古丁烟蒸汽。(H) qPCRα亚基的基因表达的BK通道(KCNMA1)。(我)气道表面测量液体体积变化折射光学显微镜。图表示为±SEM。p值显示,比较两种治疗由线连接。所有n≥5每组。两个个体之间的对比组是由学生的学习任务。

尼古丁直接改变NHBE细胞纤毛功能和细胞因子的生产

单独研究尼古丁影响离子运输和CBF NHBE细胞暴露在0或100µM尼古丁nebulised(200µL)到一个室(云从Vitrocell) (图7)。使用Vitrocell微量天平,我们确定的总沉积25问每一个我们的组织文化板块。假设一个手语卷在大约40µL基线,我们计算出有效的尼古丁浓度将达到60 - 120 nM的顶端表面液体在阿里这些细胞生长。暴露在尼古丁aerosolised没有影响NHBE nebulisation细胞生存能力在4小时后(见在线补充图S3B)。细胞暴露于尼古丁aerosolised显示减少雌性生殖道和BK电导在暴露后4小时(图7B, C)。

Effects of aerosolised nicotine on normal human bronchial epithelial (NHBE) cells. (A) Scheme showing how fully differentiated NHBE cells, grown at an air–liquid interface (ALI), were exposed to aerosolised saline containing 0 or 100 μM nicotine. Final concentration of nicotine in the airway surface liquid was estimated between 60 and 120 nM by microbalance deposition measurements. (B) Cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) and (C) ATP-stimulated K+ (BK) ion conductances are significantly decreased in nicotine-exposed cell cultures compared with nicotine-free saline. Graphs are represented as mean±SEM. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥4 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test.

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图7

aerosolised尼古丁对正常的人类支气管上皮细胞(NHBE)。(A)方案展示完全分化NHBE细胞,生长在一个气液界面(ALI),暴露在aerosolised盐水含有0或100μM尼古丁。最终浓度的尼古丁在气道表面液体估计60至120纳米微量天平沉积测量。(B)囊性纤维化跨膜调节器(雌性生殖道)和(C) ATP-stimulated K + (BK)离子电导明显减少nicotine-exposed细胞培养与尼古丁自由盐水。图表示为±SEM。p值显示,比较两种治疗由线连接。所有n≥4每组。两个个体之间的对比组是由学生的学习任务。

分析长期接触尼古丁的影响,基底NHBE细胞暴露于媒体补充0,1或10µM尼古丁5天(图8A)。暴露在尼古丁在文化媒体5天没有影响NHBE细胞生存能力(见在线补充图S3C)。在细胞暴露于10µM尼古丁在文化媒体,CBF减少从控制7.2±0.3 6.2±0.3(意味着±扫描电镜;p < 0.05;图8B)有一个下降的趋势在雌性生殖道活动(图8C)。媒体尼古丁补充也增加了细胞因子释放的基底外侧和顶端双方NHBE细胞培养浓度的10µM:白介素6 (IL)浓度在洗从390增加到442 pg / mL (p < 0.05;中位数)。引发和MCP-1还显示顶端洗(增加的趋势图8D)。在媒体报道中,il - 6和引发显著升高10µM尼古丁暴露和倾向于增加MCP-1 nicotine-exposed细胞(图8E)。在一起,这些数据表明,尼古丁暴露参数直接影响NHBE黏膜纤毛的功能和促进促炎症状态的细胞。

Cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) conductance, ciliary beat frequency (CBF) and cytokine expression in normal human bronchial epithelial (NHBE) cells exposed to basolateral nicotine. (A) Differentiated NHBE cells, grown at an air–liquid interface (ALI), were exposed to nicotine (0, 1 and 10 μM) basolaterally. (B) CBF and (C) CFTR ion conductance measurements were performed 12 hours after exposure. Graphs are represented as mean±SEM. One-way analysis of variance was used to compare the time-course curves and multiple comparisons were determined by the Dunn's method. (D–E) NHBE cells were exposed to culture media with or without nicotine for 5 days as outlined in Methods section. The concentration of interleukin (IL)-6, IL-8 and MCP-1 was measured in the apical wash (D) and in the basolateral media (E) following 5 days of exposure to culture media with or without nicotine. Graphs are represented as median±range. p Values shown, comparing both treatments connected by a line; n≥3 per group. (D–E) Data sets were analysed by non-parametric Friedman tests.

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图8

囊性纤维化跨膜调节器(雌性生殖道)电导,纤毛拍频(CBF)和细胞因子表达在正常人类支气管上皮基底细胞暴露于尼古丁(NHBE)。(一)分化NHBE细胞,生长在一个气液界面(ALI),暴露在尼古丁(0、1和10μM)管基底。CFTR CBF (B)和(C)检测离子电导测量进行暴露后12小时。图表示为±SEM。单向方差分析是用来比较的时间进程曲线和多个比较邓恩的测定方法。(d e) NHBE细胞暴露在培养基有或没有尼古丁方法部分中概述为5天。白介素6 (IL)的浓度,引发和MCP-1测量在顶端洗(D)和基底外侧媒体(E)后5天的接触培养基有或没有尼古丁。图表示为±中值范围。p值显示,比较两种治疗方法被一条线连接;n≥3每组。 (D–E) Data sets were analysed by non-parametric Friedman tests.

讨论

英国皇家医师学院最近主张转向电子烟将帮助戒烟和减少伤害从传统香烟使用。26事实上,它是良好的电子烟产生更少的环境污染,有害的焦油和缺乏包含更少的致癌化学物质。9,27公共卫生专家认为,电子烟会挽救生命,减少或消除组件暴露在有害的香烟。这个职位,但是,仍然是有争议的关于电子烟的影响缺乏科学数据。事实上,在美国食品和药物管理局已经宣布,它将开始调节由于电子烟产品。这项研究首次表明,电子烟诱导致病反应类似于发生在人类的慢性阻塞性肺病。更重要的是,它表明,尼古丁是关键组件负责这些致病性肺的变化。而少烟的使用可能会引起癌症和心血管疾病与传统香烟相比,我们的数据表明,它仍然会促进阻塞性气道疾病的发展。因此,本研究的结果建议患者时应考虑可能的这些产品的健康风险。

传统上,研究了尼古丁的香烟上瘾的组成部分,但越来越多的证据表明,尼古丁也是一个关键因素在慢性阻塞性肺病的发生和发展。尼古丁会阻碍粘液的水合作用,28促进钙^{2 +}在气道平滑肌细胞涌入,29日块中性粒细胞凋亡30.和诱导树突细胞反应。31日烟产生高剂量尼古丁香烟诱发肺气肿的变化比低剂量尼古丁的香烟,在elastase-treated老鼠。32缺乏关注尼古丁这种疾病令人惊讶,因为基因分析确定烟碱受体(α3nAchR和α5nAchR)作为COPD的易感性位点。33此外,尼古丁几乎占干重的3%烟叶和吸烟者吸入尼古丁42毫克/天。34一旦吸收,尼古丁结合烟碱乙酰胆碱受体(乙酰胆)。气道上皮细胞表达α3、α4α5,α7,α9,β2和乙酰β4子单元,35和他们的表达最高的顶端细胞表面,暴露于吸入尼古丁发生的地方。36在细支气管细胞,尼古丁通过α7AchR上调γ-aminobutyric酸(GABA)_一个Rα2和诱发Muc5ac表达和粘液生产。37这种效应可以解释增加粘蛋白染色Muc5ac表达式中发现老鼠肺部暴露于含有尼古丁电子烟。有趣的是,雌性生殖道和BK离子电导和CBF震级更大更多的负面影响在细胞暴露于aerosolised尼古丁与尼古丁是媒体的补充。这表明顶端接触可能比基底接触有害。这发生尽管尼古丁是高的浓度在媒体上(10μM)与美国手语(60 - 120 nM) aerosol-exposed细胞。这将表明,吸入尼古丁对肺部的影响不同于尼古丁在体内循环。然而,还需要进一步的研究来比较肺部吸入尼古丁的后果和尼古丁吸收系统虽然尼古丁贴片等产品。虽然尼古丁刺激PKCα通过α7nAchR(见行动图9潜在的信号),它还有待决定多少PKCα激活导致的致病性变化发生在我们的肺模型。事实上,识别信号机制负责这些nicotine-mediated效应将是未来研究的一个关键目标。

Possible signalling mechanism for nicotine-containing e-cigarette-induced lung damage. ERK, extracellular regulated kinase; IL, interleukin; nAChR, nicotinic acetylcholine receptor.

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图9

可能含有尼古丁的信号机制e-cigarette-induced肺损伤。细胞外调节激酶ERK;IL,白介素;乙酰胆,烟碱乙酰胆碱受体。

其他体外和体内研究表明,短期烟蒸汽吸入改变肺部炎症反应。7,8到目前为止,没有其他研究观察慢性烟暴露对小鼠肺部炎症的影响。与我们的研究和勒纳的研究等,7苏珊等8不确定增加il - 6或MCP-1回应烟暴露的差异,但这可能是占鼠标背景,曝光时间,包括烟调味,可替宁含量在等离子体和肺部感染的存在。8在老鼠ova-albumin敏感,10周烟据报道,增加气道hyper-reactivity38我们发现慢性吸入烟本身诱发气道hyper-reactivity。类似于吸烟,尼古丁的电子烟促进气道平滑肌增生和收缩,从而影响气道hyper-reactivity暴露个人。39因此,尼古丁可能是一个关键因素驱动肺部疾病的发病和进展。

商业上可用,尼古丁自由,车辆被用作控制烟液内含有尼古丁。除了尼古丁,这两种液体的成分是相同的。我们选择调查车辆(50:50 PG: VG)烟常用的用户。为了避免潜在的干扰,我们还当选为使用车辆,不含香料添加剂以来由于电子烟口味产生大量的氧化和肺细胞和组织的炎症反应。7本研究观察到没有汽车的有害影响,但作者不能排除潜在的长期的副作用在各种商用e-liquids组件。事实上,最近由于电子烟研究发现大量的检测水平的有毒金属,如铝、铜、锌、铅和铬。40

总之,这些结果显示慢性缴获的肺的不良健康影响。此外,他们证明尼古丁是关键组件,导致气道hyper-reactivity和肺组织破坏。电子烟含有更少的致癌物质和不太可能促进致癌作用。因此,虽然电子烟有更好的安全性,避免尼古丁吸入可能会影响保护肺部健康。

确认

作者感谢震响Salifu和杰拉德Turino博士和詹姆斯·p·马拉肺病和露丝中心昂格尔和Mah Jongg基金会联盟的支持和指导。他们也承认迈克尔Myerburg(匹兹堡大学)使气道表面液体体积估计半月板扫描软件可用。

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视图抽象

脚注

指定和PG同样起到了推波助澜的作用。女士和射频共享高级作者。
贡献者指定和PG:负责研究设计和执行、数据收集和手稿准备。NB, MC, AJD BJ,数控,AG)和情感表达:负责研究执行。女士:负责研究设计和执行和手稿准备。射频:负责研究设计、执行数据收集和整体手稿准备。他是担保人。
资金这项工作是提供赠款支持射频(空姐医学研究所YCSA 24039年,074047年中央情报局和美国国立卫生研究院1 r01hl098528-05),女士(空姐医学研究所,中央情报局130033年和詹姆斯和以斯帖国王佛罗里达生物医学研究项目拨款# 5 jk02), PG(空姐医学研究所YCSA 113380)和指定(空姐医学研究所YCSA 13005)。
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