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摘要
背景使用电子（E）-cigarettes的迅速增加，但他们的肺部健康的影响是不成立的。临床研究审查的肺部健康电子烟使用的潜在的长期影响将需要数十年。为了解决这个知识缺口，这个研究调查暴露于气雾化和含尼古丁的无尼古丁的电子烟流体上小鼠肺和正常人呼吸道上皮细胞的影响。
方法小鼠暴露于雾化的磷酸盐缓冲盐水、不含尼古丁或含尼古丁的电子烟溶液中，每天1小时，连续4个月。在空气-液体界面培养的正常人支气管上皮细胞(NHBE)暴露在电子烟蒸汽或尼古丁溶液中，使用Vitrocell烟雾暴露机器人。
结果的含尼古丁电子香烟吸入增加气道高反应性，远侧腔扩大，粘蛋白的生产，细胞因子和蛋白酶的表达。暴露于不含尼古丁的电子香烟并没有影响这些肺参数。暴露于含尼古丁的电子烟蒸气NHBE细胞显示受损的纤毛运动频率，气道表面液体的体积，囊性纤维化跨膜调节和ATP刺激的K +离子电导和下降FOXJ1和KCNMA1的表达。Exposure of NHBE cells to nicotine for 5 days increased interleukin (IL)-6 and IL-8 secretion.
结论暴露于吸入的含尼古丁的电子烟流体触发效果通常与COPD的发展，包括细胞因子的表达，气道高反应性和肺组织破坏有关。这些效果尼古丁依赖性二者在小鼠肺和人呼吸道细胞，提示吸入尼古丁有助于气道和肺部疾病除了其成瘾性质。因此，这些发现电子香烟使用期间突出尼古丁吸入的潜在危险。
- COPD AU机制
- 肺气肿
- COPD病理学
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关键信息
什么是关键问题？
什么是电子（E）-cigarette吸入肺后果？
底线是什么?
这些结果表明，尼古丁存在于电子香烟涂改炎症，离子电导和粘膜纤毛功能的人支气管上皮细胞中的吸入和诱导的气道高反应性和在暴露的小鼠空气空间的扩大。
为什么要读吗?
这项研究为了解电子烟对肺部健康的影响提供了见解，并暗示尼古丁是慢性阻塞性肺病发病和发展的诱因之一。
介绍
在美国，接触香烟是可预防的死亡的主要原因。大多数慢性阻塞性肺病死亡与吸烟有关，目前慢性阻塞性肺病已成为美国第三大死亡原因1预计在未来20年内，它将成为世界范围内的第三大事业。2戒烟可以降低罹患多种疾病的风险，并可延长预期寿命。2尽管在过去的50年里，美国的吸烟率有所下降，但仍有约19%的人继续吸烟。3.虽然尼古丁替代疗法(NRT)有所帮助，但近93%的吸烟者在戒烟6个月内仍会复发。4考虑到戒烟的困难和慢性阻塞性肺病造成的巨大公共卫生负担，一些卫生保健倡导者认为，对于那些无法戒烟的人来说，电子烟是一种更安全的选择。5
电子香烟是有效地提供汽化液态尼古丁到肺部的装置。用户可以选择被加载到该装置的筒电子烟液（E液）的尼古丁浓度。当用户吸气时，电子液体，主要是尼古丁丙二醇（PG）或植物甘油（VG），被加热以产生被吸入到肺中的蒸气。尽管许多可用的口味和品种，几乎所有的消费者选择含有尼古丁电子液体。6最近的研究表明，电子烟暴露可能对未来几个健康问题。使用电子香烟增强小鼠的氧化应激和炎症7并妨碍对细菌和病毒感染的免疫防御。8这也有二手烟影响，因为电子香烟显著增加室内空气中的尼古丁含量和暴露的非网民二手蒸汽。9尼古丁能增强脂多糖缺乏小鼠的气道高反应性和肺上皮细胞的炎症反应。10尼古丁还可以抑制肺癌细胞的凋亡。11然而，尼古丁通过电子烟传递到肺部的生物学效应还没有得到充分的研究。
在这里，我们使用体外和体内模型来评估电子烟的使用对小鼠肺部和从一系列人类受试者收集的正常人类支气管上皮(NHBE)细胞的生物学影响。本研究发现，吸入电子烟中的尼古丁可触发COPD发病机制和进展相关的效应:空气空间增大、黏液细胞肥大、炎症介质释放和上皮纤毛功能改变。收集到的数据为电子烟的潜在有害影响提供了直接证据，尤其是尼古丁吸入肺部。
方法
体内吸入电子烟液体
所有的动物实验均来自西奈山罗斯福医疗中心的机构动物护理和使用委员会批准执行。我们开发了使用鼠标馅饼笼（MPC）气溶胶喷雾器用药（布伦特里科学，布伦特里，马萨诸塞州，美国）体内电子香烟暴露模型。For 4 months (5 days/week), A/J mice aged 12 weeks (Jackson labs) were whole body exposed to 0.4 mL of phosphate-buffered saline (PBS) or e-cigarette vehicle (PG and VG 50/50; American eLiquid Store) containing 0 or 18 mg/mL nicotine (American eLiquid Store). All liquids were preheated to 37°C prior to nebulisation and the exposures lasted 1 hour. Mice were euthanised 24 hours after the last exposure. Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected and immune cells quantified as previously described.12血浆可替宁水平的测量使用商用试剂盒，并遵循制造商的说明(Abnova, Walnut, California, USA)。
气道对乙酰胆碱的反应
Airway responses to increasing doses of methacholine (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, USA) were assessed with the Scireq Flexivent system (Scireq, Montreal, Quebec, Canada) in mice exposed to 4 months of PBS and e-liquid containing 0 or 18 mg/mL nicotine. Animals were anaesthetised with ketamine/xylazine (10 mg/kg) and paralysis was induced with 1 mg/kg pancuronium bromide intraperitoneally. Baseline pulmonary function measurements (forced expiratory flow at 50% of FVC (FEF50））的之前在小鼠中乙酰甲胆碱激发确定。直链状单室模型被用来评估总呼吸系统阻力。
组织学分析
肺后行压力固定和固定的组织进行处理和H＆E染色形态计量学分析如先前所描述。13Mucin染色阿利新蓝和萨弗拉宁O使用商用试剂盒(Abcam，剑桥，马萨诸塞州，美国)。免疫荧光法:在室温下，用10%的羊血清在PBS中封闭载玻片1小时。用一抗孵育(兔多克隆抗muc5ac IgG, 1:50稀释;或兔IgG阴性对照于5%山羊血清1%牛血清白蛋白PBS中4℃过夜，然后在室温下用二抗(驴抗兔IgG-546, 1:20 00稀释)1小时。免疫反应性用荧光显微镜观察。巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的组织定量检测;兔多克隆抗mac3、抗中性粒细胞弹性蛋白酶或抗cd3 IgG (Abcam;1:50稀释)。从每只小鼠肺组织切片中随机选择10张×400张的图像，对免疫细胞进行定量。
细胞生存能力分析
使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP末端标记(TUNEL)原位细胞死亡检测试剂盒AP (Roche Diagnostics)，按照制造商的说明，对石蜡包埋组织进行凋亡检测。对于每个肺，在组织切片的三个不同深度随机取10个切片，染色后至少观察1000个细胞/切片。阳性细胞以总细胞核百分比的形式表达。如前所述，测定Caspase 3/7活性，14使用市售的胱天蛋白酶3/7格洛分析系统（Promega，Fitchburg的，密歇根州，美国）。体外细胞活力通过释放到使用市售的测定法（Sigma Aldrich）的媒体的乳酸脱氢酶（LDH）测定。
定量PCR，MMP和细胞因子蛋白质检测
RNA使用Qiagen RNeasy试剂盒分离并互补DNA（cDNA）是使用Applied Biosystems公司的高容量cDNA的试剂盒，逆转录。定量PCR使用验证TaqMan探针（Life Technologies公司/ Applied Biosystems）上的Bio-Rad公司CFX384实时系统上进行。的qPCR结果表示为相对定量。基因表达归一化至β肌动蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。
在培养物中使用珠媒体一个Bio-Rad公司的Bio-Plex系统200（Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚，USA）上测定中测量的细胞因子的蛋白水平。胶原酶单位计算为亮氨酸的微摩尔的数量每mg酶释放，通过比色茚三酮法。15如先前所述进行组织蛋白酶活性测定。16
免疫印迹分析
在4体积的放射免疫沉淀试验缓冲液中均质化肺组织。相同浓度的蛋白质免疫印迹了磷酸化PKCα(p-PKCα)PKCα,磷酸化细胞外调节激酶(ERK), ERK和β-actin(细胞信号技术,丹弗斯,马萨诸塞州,美国)。利用分子成像技术ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad)对化学发光进行检测和定量。使用Bio-Rad Laboratories Image Lab软件(V.4.0, build 16)进行密度测定，并将其表示为磷酸化蛋白与总蛋白的像素强度之比。
在体外NHBE细胞分析
NHBE细胞是从适当的同意捐助者，其肺部被发现不适合移植隔离。The 15 donors were non-smokers with no known airway diseases, 5 females and 10 males aged 25–58 years. From a racial aspect, there were 10 Caucasians, 2 African-Americans, 1 Hispanic white and 2 unknowns. After expansion, cells were redifferentiated at the air–liquid interface (ALI) on collagen-coated 12-mm Transwell inserts (Corning, Lowell, Massachusetts, USA).17-19The cells were exposed to 36 puffs of vaporised e-liquid either containing 0 or 36 mg/mL nicotine using the VC-1 exposure system (Vitrocell Systems, Waldkirch, Germany), with a 70 mL puff volume applied every 30 s. Cells were also exposed to nicotine (0 or 100 μM, with an estimated final 100 nM nicotine concentration in the airway surface liquid (ASL) after nebulisation) aerosolised in the Cloud system (Vitrocell Systems) or baseolaterally supplemented nicotine (0, 1 or 10 μM) for 12 hours or 5 days.
离子通道功能和粘液纤毛清除
在以下时间点记录了短路电流(Isc)和纤毛搏动频率(CBF):在VC-1系统中蒸汽暴露8小时后，在烟云系统中雾化尼古丁4小时后，在基底外侧添加尼古丁12小时后。20囊性纤维化跨膜调节器(雌性生殖道函数是由减少Isc添加CFTR-inh后细胞刺激10µM forskolin存在10µM阿米洛利室温。顶端，atp刺激的K+ (BK)电流测量如前所述。20
ASL和百分比纤毛表面的测量
Twenty-four hours after exposure of cells on 12 mm inserts to 36 puffs of e-cigarette vapour with 0 or 36 mg/mL nicotine in the VC-1 exposure system, the cultures were imaged with an Epson flatbed scanner and images were analysed for meniscus volume using ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA), kindly provided by Michael Myerburg (University of Pittsburgh). Fully redifferentiated NHBE cells were fixed, blocked and stained with a monoclonal antitubulin acetylated antibody (1:10 000 dilution; Sigma Aldrich) to detect cilia. The % ciliated area was determined using ImageJ software.
统计分析
对所有数据集进行f检验、D'Agostino-Pearson综合正态性检验、非参数弗里德曼检验和学生t检验。采用单因素方差分析对两组以上的人进行比较，然后对人体细胞样本进行线性趋势分析的事后检验。数据用表示平均值的直线和表示扫描电镜的条形图表示。GraphPad Prism软件(GraphPad, La Jolla, California, USA)用于所有数据分析和图形表示。
结果
暴露于吸入的含有尼古丁的电子烟液体可诱发气道高反应性和空气空间扩大
米ice were exposed to aerosolised PBS and e-liquid (0 and 18 mg/mL nicotine) daily for 4 months. Exposure to aerosolised nicotine-containing e-cigarettes increased plasma cotinine, the nicotine degradation product, demonstrating that nicotine was effectively delivered to the lungs and absorbed systemically by the mice (图1A).气道超反应性采用甲氧胆碱激发试验(methacholine challenge test)。在每一次甲基胆碱剂量≥1 mg/mL时，暴露于含有尼古丁的电子烟的小鼠的呼吸阻力明显高于暴露于雾化的PBS或不含尼古丁的电子烟的小鼠(图1B和在线补充图S1)。暴露于无尼古丁电子烟的小鼠与暴露于PBS的小鼠在气道高反应性方面无差异。为了检测基线肺功能的变化由于电子烟的使用，用力呼气流量在50% (FEF)50)。FEF50/FVC ratio was significantly reduced from 23±1.2 in mice exposed to nicotine-free e-cigarette fluids to 15±1.5 in mice exposed to e-cigarettes containing 18 mg/mL nicotine (average±SEM; p<0.01), suggesting obstruction of the small airways (图1C)。
吸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)、不含尼古丁和含有尼古丁的电子烟液的小鼠的肺功能。小鼠每日暴露于吸入的PBS、不含尼古丁(EC vehicle, 0 mg/mL)或含尼古丁(EC vehicle, 18 mg/mL)的电子烟液中4个月，(A)血浆可替宁水平确定尼古丁吸收。(B)评估各组动物气道对增加甲氧胆碱剂量的高反应性。(C)进行负压力驱动的用力呼气和用力振荡技术操作，以确定所有动物组的肺力学变化。用力呼气流量为FVC (FEF)的50%50）在每个动物进行了测定。(D)Representative H&E-stained images of fixed lung parenchyma from mice exposed daily for 4 months (scale bar=100 µm) and quantification of surface area/unit volume, fractional volume and mean linear intercept. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥6 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test. EC, e-cigarette.
吸入含有尼古丁的电子烟液的小鼠显示出明显的空气体积增大，而吸入不含尼古丁的电子烟液或PBS对肺部结构没有影响(图1D).计算h&e染色肺切片的平均线性截距、表面积/单位体积比和部分体积。在暴露于含尼古丁电子烟液体的小鼠中，所有三个参数都发生了改变:平均线性截距增加，表面积/单位体积和分数体积减少(p<0.05;图1D).暴露于不含尼古丁的电子烟或PBS (图1d）。
吸入尼古丁会增加肺部炎症细胞的浸润。暴露2周后，无尼古丁电子烟组BALF细胞数从130 000±27000 /只增加到28 000±41 000 /只(p<0.01;意味着±扫描电镜;在线补充图S2D）。After 4 months of exposure, mice exposed to nicotine-containing e-cigarette fluids showed a trend towards increased cell number in BALF (图2一个)。细胞涂片显示，巨噬细胞，在所有这三个条件的支气管肺泡灌洗液中最丰富的细胞类型恢复，而中性粒细胞和淋巴细胞组成的较小比例（图2一个)。在肺泡空间中观察到在所有小鼠组的巨噬细胞（图2组织炎症的B）和定量表明，小鼠的肺组织中升高的巨噬细胞数目进行与其他组相比，含尼古丁的电子烟流体（图2C).中性粒细胞和淋巴细胞数目没有改变(图2C)。
肺部炎症的小鼠暴露于吸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）和无尼古丁的电子香烟流体。米ice were exposed daily to inhaled PBS, nicotine-free (0 mg/mL) or nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette fluids for 4 months. (A) Total bronchoalveolar lavage fluid cells, macrophages, neutrophils and lymphocytes were quantified in mice exposed daily for 4 months. (B) Representative H&E-stained images of fixed lung parenchyma and macrophages from mice exposed daily for 4 months (scale bar=20 µm). (C) Tissue cellularity was quantified by measuring the average number of macrophages, neutrophils or lymphocytes per high powered field (×400). Ten randomly selected high powered images were used for quantification per mouse. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n≥7 per group. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test. BALF, bronchoalveolar lavage fluid. EC, e-cigarette.
尼古丁在电子香烟流体触发器粘蛋白产生和细胞凋亡
气道粘液产量暴露于含尼古丁的电子烟流体小鼠增加，作为用于MUC5AC（所示阿辛蓝染色和荧光显微镜图3一个)。小鼠暴露于含尼古丁的电子烟流体显示出增加两倍Muc5ac基因表达（P <0.01;图3A).肺结构细胞凋亡是慢性阻塞性肺病发病机制中的另一重要事件。21细胞凋亡，通过TUNEL染色估计，暴露于含有尼古丁电子香烟流体肺泡和小鼠的气道上皮细胞中增加（图3B）。Caspase 3/7 activity, increased from 37±1.5 units of luminescence in nicotine-free e-cigarette fluid exposed mice to 53±4.7 units of luminescence in nicotine-containing e-cigarette fluid exposed mice (p<0.01; mean±SEM;图3B）。总之，尼古丁电子香烟促进气道高反应性，炎症，气道放大，粘液分泌和肺细胞凋亡。
来自暴露于吸入和含尼古丁的无尼古丁的电子香烟烟雾的小鼠肺的组织学分析。米ice were exposed daily to inhaled nicotine-free (0 mg/mL) or nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette aerosol for 4 months. Then, lungs were fixed and sectioned and stained for histological analysis. (A) Representative pictures of sections after Alcian blue stain and MUC5AC immunofluorescence (scale bar=20 µm). Graphs representing (A) qPCR analysis forMuc5ac所示。(B)代表的图像部分后转移酶dUTP尼克end-labelling (TUNEL)(绿色)和DAPI染色(蓝色)从肺气道和肺泡地区(比例尺= 20µm)。各组tunel阳性细胞的百分比和肺组织裂解液中caspase 3/7的活性也被显示。陆,发光单元。图用三个测量值的平均值±SEM表示。p值显示，比较两个处理之间的连线。每组n≥5例。两组之间的比较由学生的t检验决定。DAPI 4′, 6-diamidino-2-phenylindole。
含有烟碱诱导肺的细胞因子和蛋白酶的表达E-香烟流体
2周后在肺匀浆中检测了几种与组织重塑相关的细胞因子和蛋白酶的表达(见网上)补充图S2A-C)和4个月的暴露(图4)。与吸入不含尼古丁的电子烟液(0 mg/mL)相比，含尼古丁的电子烟液(18 mg/mL)显著增加了IL-1β,单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),Cxcl10,IL-6和Cxcl2（P <0.05所有;图4一个)。基质金属蛋白酶(MMP的)-9和MMP-12和组织蛋白酶K和L1在暴露于含尼古丁电子香烟流体的小鼠（也显示增加的信使RNA的表达图4B）。胶原酶活性BALF增加了70％（P <0.03）和组织蛋白酶BALF活性呈朝增加的小鼠暴露于含有尼古丁电子香烟流体中BALF的趋势（图4C)的表达Mcp-1,Muc5ac和CatKshowed similar patterns after 2 weeks of exposure to nicotine-containing e-cigarettes (see online补充图S2)。我们的发现表明，通过电子烟液体吸入尼古丁可以诱导细胞因子和蛋白酶的表达和活性，其方式与烟草烟雾暴露相似。
从暴露于或含尼古丁无尼古丁的电子烟流体小鼠细胞因子和蛋白酶的表达和活性在肺部。米ice were exposed to inhaled nicotine-free (0 mg/mL) or to nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette fluid for 4 months. Gene expression analysis by qPCR for (A) the cytokinesIL-1β,MCP-1,CXCL10,IL-6,CXCL2和CXCL5和（B）蛋白酶MMP-3,MMP-9,MMP-12,CatK,CatL1和猫。(C)测定肺支气管肺泡灌洗液中胶原酶和组织蛋白酶活性。图用三个测量值的平均值±SEM表示。p值显示，比较两个处理之间的连线。每组n≥5例。两组之间的比较由学生的t检验决定。
吸入尼古丁的烟液激活PKCα/ ERK信号在肺
我们实验室曾表明PKCα和ERK的活化香烟监管肺部炎症和蛋白酶反应。22由于尼古丁能刺激α-7烟碱受体（α7nAchR）在人肺上皮细胞和PKCαERK的上游，11,23我们想知道电子烟中的尼古丁是否会激活这种信号机制。肺匀浆小鼠暴露于尼古丁的烟液显示PKCα磷酸化的增加和趋势增加肺的磷酸化ERK (图5)。值得注意的是，抑制在香烟烟雾暴露的小鼠的肺中该途径防止腔扩大的。22
PKCα和ERK活化的小鼠暴露于吸入车辆或含尼古丁电子烟流体肺部。米ice were exposed daily to inhaled nicotine-free (0 mg/mL) or to nicotine-containing (18 mg/mL) e-cigarette fluid for 4 months. (A) Representative western blots for total and phosphorylated PKCα (p-PKCα) and ERK in lung tissue homogenates. β-Actin was used as a loading control. (B) Optical intensity quantification and calculated ratios of phosphorylated/total protein for PKCα and ERK. Graphs are represented as mean±SEM of three measurements. p Values shown, comparing both treatments connected by a line. All n=9 per group for densitometry analysis. The comparisons between two individual groups were determined by Student's t-test.
电子烟中的尼古丁会改变NHBE细胞的纤毛功能和细胞因子的产生
我们使用完全分化的NHBE细胞来评估含有尼古丁的电子烟蒸汽对纤毛功能的影响。NHBE细胞取自健康供体，在ALI培养，暴露于不含尼古丁或含有尼古丁的电子烟蒸气(图6A).根据LDH测定，暴露于蒸发的电子烟蒸汽对NHBE细胞活力没有影响(见网上)补充图S3A)。纤毛搏动是气道的主要防御功能之一。24暴露在含有尼古丁的电子烟烟雾中的细胞在暴露8小时后，CBF明显降低(5.2±0.5 Hz vs . 2.6±1 Hz;p = 0.01;p < 0.05;图6B）。由于暴露于尼古丁在电子香烟减少CBF，纤毛的顶端细胞表面上的％是上NHBE细胞来确定。There was no significant difference in percentage of ciliary area on the apical surface 24 hours after exposure to nicotine-containing e-cigarette vapour (图6C).然而，一个主要的纤毛形成调节因子的基因表达，FOXJ1，在暴露于含尼古丁的电子烟蒸气细胞减少（图6D).暴露于含有尼古丁的电子烟蒸气8小时后(图6E），并且是独立的表达的CFTR基因(图6F).暴露于含有尼古丁的电子烟蒸气8小时后(图6G），其具有降低的BK通道α亚基的表达相一致（KCNMA1)调节ASL的基因。25A年代lvolume changes showed a significant decrease, from 14.6±2 µL in cells exposed to nicotine-free e-cigarette vapour at 24 hours after exposure to 3.8±1 µL in cells exposed to nicotine-containing e-cigarette vapour (mean±SEM; p<0.01;图6I).因此，电子烟蒸汽中的尼古丁直接影响纤毛功能。
车辆和含尼古丁的电子烟蒸气对正常人支气管上皮（NHBE）细胞。(A)年代cheme showing how fully differentiated NHBE cells, grown at an air–liquid interface (ALI), were exposed to vapour from vehicle (0 mg/mL) or from nicotine-containing (36 mg/mL) e-cigarettes. (B) Ciliary beat frequency significantly decreased after exposure to nicotine-containing e-cigarette vapour. (C) Cells were stained with DAPI and antiacetylated tubulin to visualise cilia, 24 hours after exposures. The % ciliated area was determined using ImageJ software. (D) qPCR for gene expression ofFOXJ1。(E)吸入含有尼古丁的电子烟蒸汽后，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)离子电导明显降低。(F)基因表达的qPCRCFTR。(G)暴露于含有尼古丁的电子烟蒸气后，atp刺激的K+ (BK)离子电导显著降低。(H) qPCRα亚基的基因表达的BK通道(KCNMA1)。(I)利用折射光学显微镜测量气道表面液体体积的变化。图用均数±SEM表示。p值显示，比较两个处理之间的连线。每组n≥5例。两组之间的比较由学生的t检验决定。
尼古丁直接变造纤毛功能和细胞因子产生中NHBE细胞
单独研究尼古丁影响离子运输和CBF NHBE细胞暴露在0或100µM尼古丁nebulised(200µL)到一个室(云从Vitrocell) (图7A).使用Vitrocell微天平，我们确定在我们的组织培养板的每个孔中总共沉积了25个nL。假设一个手语卷在大约40µL基线,我们计算出有效的尼古丁浓度将达到60 - 120 nM的顶端表面液体在阿里这些细胞生长。雾化后4小时暴露于雾化尼古丁对NHBE细胞活力无影响(见网上)补充图S3B）。Cells exposed to aerosolised nicotine showed decreased CFTR and BK conductance at 4 hours after exposure (图7B，C）。
雾化吸入尼古丁对正常人支气管上皮(NHBE)细胞的影响。(A)方案展示完全分化NHBE细胞,生长在一个气液界面(ALI),暴露在aerosolised盐水含有0或100μM尼古丁。通过微平衡沉积测量，测定气道表面液中尼古丁的最终浓度在60 ~ 120nm之间。(B)与无尼古丁生理盐水相比，暴露于尼古丁的细胞培养中，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)和atp刺激的K+ (BK)离子电导显著降低。图用均数±SEM表示。p值显示，比较两个处理之间的连线。每组n≥4例。两组之间的比较由学生的t检验决定。
分析长期接触尼古丁的影响,基底NHBE细胞暴露于媒体补充0,1或10µM尼古丁5天(图8A).在培养基中暴露尼古丁5天对NHBE细胞活力没有影响(见网上)补充图S3C)。在细胞暴露于10µM尼古丁在文化媒体,CBF减少从控制7.2±0.3 6.2±0.3(意味着±扫描电镜;p < 0.05;图8B）和有一个在CFTR活性减少的趋势（图8C)。米edia nicotine supplementation also increased cytokine release both to the basolateral and the apical sides of the NHBE cell cultures at concentrations of 10 µM: interleukin (IL)-6 concentration in the wash increased from 390 to 442 pg/mL (p<0.05; median). IL-8 and MCP-1 also showed a trend towards an increase in the apical wash (图8D)。在媒体报道中,il - 6和引发显著升高10µM尼古丁暴露和倾向于增加MCP-1 nicotine-exposed细胞(图8E）。总之，这些数据直接表明烟碱暴露粘膜纤毛功能的影响参数和促进细胞NHBE促炎状态。
暴露于基底外侧尼古丁的正常人支气管上皮细胞(NHBE)的囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)传导、纤毛搏动频率(CBF)和细胞因子的表达。(一)分化NHBE细胞,生长在一个气液界面(ALI),暴露在尼古丁(0、1和10μM)管基底。(B) CBF和(C) CFTR离子电导测量在暴露12小时后进行。图用均数±SEM表示。时间-过程曲线的比较采用单因素方差分析，多因素比较采用Dunn法。(D-E) NHBE细胞暴露于含有或不含尼古丁的培养基中5天(见方法部分)。白介素(IL)-6、IL-8和MCP-1的浓度分别在根尖冲洗(D)和基底外侧介质(E)中测定。图用中位数±范围表示。p值显示，比较两个处理由一条线连接;n≥3每组。 (D–E) Data sets were analysed by non-parametric Friedman tests.
讨论
英国皇家内科医师学会(Royal College of Physicians)最近提出，改用电子烟将有助于戒烟，并减少传统香烟的危害。26事实上，这是公认的电子香烟产生更少的环境污染，缺乏有害的焦油和含有少得多的致癌化学物质。9,27公共卫生专家认为，电子烟将通过减少或消除暴露在有害的香烟成分挽救生命。但这一立场，因为关于电子卷烟的影响的科学数据缺乏仍存在争议。事实上，美国食品和药品管理局在美国已经宣布，将开始规范电子烟产品。这项研究表明，第一次，电子香烟诱发类似于人类COPD发生什么致病性反应。更重要的是，它表明，尼古丁是负责肺这些致病变化的关键组件。虽然电子烟使用可能潜在地导致癌症少和血管疾病与普通香烟相比，我们的数据表明，它仍然会促使气道阻塞性疾病的发展。因此，从这个研究的结果应通知这些产品可能的健康风险的患者时，可以考虑。
传统上，尼古丁已经研究作为香烟上瘾的成分，但越来越多的证据表明，尼古丁也是在启动和COPD进展的关键因素。尼古丁会阻碍粘液的水化，28促进钙2+涌入气道平滑肌细胞，29块中性粒细胞凋亡三十并诱导促炎树突状细胞反应。31在弹性蛋白酶处理的大鼠中，高剂量尼古丁香烟产生的烟雾比低剂量尼古丁香烟引起更多的肺气肿变化。32缺乏关注尼古丁这种疾病令人惊讶,因为基因分析确定烟碱受体(α3nAchR和α5nAchR)作为COPD的易感性位点。33此外，尼古丁几乎占烟叶干重的3%，吸烟者每天吸入42毫克尼古丁。34一旦被吸收，尼古丁结合到烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs的）。气道上皮细胞表达α3，α4，α5，α7，α9，β2和β4亚基的烟碱受体，35它们在接触尼古丁的根尖细胞表面表达最高。36在细支气管细胞,尼古丁通过α7AchR上调γ-aminobutyric酸(GABA)ARα2和诱发Muc5ac表达和粘液产生。37这种效应可以解释粘蛋白染色和Muc5ac在暴露于含尼古丁的电子香烟表达在小鼠肺检测。有趣的是，CFTR和BK离子电导和CBF被带更多负在暴露于其中烟碱在媒体补充细胞相比气雾化尼古丁细胞更大的幅度时的影响。这表明，根尖暴露可能比基底曝光更有害。This occurred despite the fact that the concentration of nicotine was actually higher in the media (10 μM) compared with the ASL (60–120 nM) of the aerosol-exposed cells. This would suggest that inhaled nicotine impacts on the lungs differently than nicotine circulating in the body. However, further studies are needed to compare the pulmonary consequences of inhaled nicotine versus nicotine absorbed systemically though products like nicotine patches. Though nicotine acts via α7nAchR to stimulate PKCα (see图9潜在的信号),它还有待决定多少PKCα激活导致的致病性变化发生在我们的肺模型。事实上，确定这些尼古丁介导效应的信号机制将是未来研究的一个关键目标。
含尼古丁电子烟致肺损伤的可能信号机制。ERK，细胞外调节激酶;IL,白介素;烟碱乙酰胆碱受体nAChR。
其他体外和体内的研究，表明短期电子烟蒸气吸入肺变造炎症反应。7,8迄今为止，还没有其它研究着眼于对肺部炎症慢性电子烟暴露小鼠的影响。不像我们的研究和勒纳研究等,7苏珊等8没有发现在IL-6或MCP-1的增加，响应于电子香烟曝光，但是这可能由血浆和肺部感染的存在下，在鼠标背景，曝光时间，差异电子香烟调味，可替宁水平可以占。8在OVA白蛋白致敏小鼠，为期10周的电子烟曝光据报道，增加气道高反应性38我们发现，慢性电子烟吸入，通过本身，引起气道高反应性。类似香烟，尼古丁电子香烟促进气道平滑肌增生和收缩，可在暴露的个人影响气道高反应性。39因此，尼古丁可能是驾驶肺部疾病的发生和发展的关键因素。
商用的、不含尼古丁的载具被用来作为含有尼古丁的电子烟液体的对照品。除了尼古丁，这两种液体的成分是相同的。我们选择调查电子烟使用者常用的车辆(50:50 PG:VG)。为了避免潜在的混淆效应，我们还选择了一种不含香料的汽车，因为电子烟香料中的添加剂会在肺细胞和组织中引起显著的氧化和炎症反应。7这项研究观察到车辆的无有害影响，但作者无法在各种市售的E液体排除组件的潜在的长期副作用。事实上，最近的电子香烟研究发现有毒金属的显着可检测的水平，如铝，铜，锌，铅和铬。40
总之，这些结果显示了长期电子烟暴露对肺部健康的不利影响。此外，他们确定尼古丁是导致气道超反应性和肺组织破坏的关键成分。电子烟所含的致癌物要少得多，也不太可能促进致癌。因此，尽管电子烟可能有更好的安全性，但避免吸入尼古丁可能会对保持肺部健康产生影响。
致谢
作者感谢Moro Salifu博士、Gerard Turino博士和James P. Mara肺病中心以及Ruth Unger和Mah Jongg基金会联盟的支持和指导。他们还感谢Michael Myerburg(匹兹堡大学)开发了用于气道表面液体体积估计的半月板扫描软件。
参考文献
脚注
iga和PG贡献相等。MS和RF共享高级作者身份。
贡献者iga和PG:负责研究设计和执行，数据收集和手稿准备。NB, MC, AJD, BJ, NC, AG, EE:负责研究执行。MS:负责研究的设计和执行以及手稿的准备。RF:负责研究设计、执行、数据收集和整体稿件准备。他是担保人。
资金这项工作是提供赠款支持射频(空姐医学研究所YCSA 24039年,074047年中央情报局和美国国立卫生研究院1 r01hl098528-05),女士(空姐医学研究所,中央情报局130033年和詹姆斯和以斯帖国王佛罗里达生物医学研究项目拨款# 5 jk02), PG(空姐医学研究所YCSA 113380)和指定(空姐医学研究所YCSA 13005)。
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