产生TNF/iNOS的树突状细胞是致死性流感病毒感染的必然祸害
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罗伯特·g·韦伯斯特2009年1月20日投稿(2008年12月23日收稿)
摘要
高致病性甲型流感病毒的呼吸道感染的特征是大量产生细胞因子和趋化因子,并增强固有炎症细胞的招募。在这里,我们展示了用强毒性甲型流感病毒(包括目前正在流行的H5N1毒株)挑战小鼠,会导致肺炎气道中特定树突状细胞亚群(tipDCs)的选择性积累增加。这些tipDCs对于流感特异性CD8的进一步增殖是必需的+因为阻断了它们在CCR2中的募集−−/CD8降低+效应器并最终危及病毒清除。然而,用过氧化物酶体增殖物激活的受体-γ激动剂吡格列酮治疗,减少而不是完全消除tipDC的转运,可以在不消除CD8的情况下,缓解tipDC过度招募的潜在致命后果+T细胞扩张或损害病毒控制。因此,以这种方式靶向tipDCs为面对灾难性的大流行提供了治疗干预的可能性。
流感流行和大流行的致病性差异很大。在任何一年中,熟悉的“季节性”流感流行仅在美国就可能导致超过35000人死亡(1),而1918年的“西班牙流感”导致≥全球4000万人(2- - - - - -7)1918年的西班牙流感是现代最严重的急性大流行,全球死亡率超过2.5%(8).我们目前关注的是甲型H5N1禽流感病毒。这些剧毒病原体于1996年首次从禽类宿主中被发现,截至2009年1月,399例经实验室确认的人类病例中有63%的死亡率是由这些病原体引起的(9).与免疫功能低下(非常年轻或老年人)的季节性流感最危险的情况不同,感染高致病性(HP) 1918 H1N1大流行毒株和最近的H5N1分离株与其他健康、完全免疫能力的成人的高死亡率有关(8).这一悖论导致了一种假设,即HP流感病毒诱导免疫介导的病理,其特征是严重的血管渗漏和肺水肿。
致命的呼吸损伤是由失调的免疫反应(通常被称为细胞因子风暴或高细胞活性血症)引起的,这一观点得到了体外和体内证据的支持,这些证据显示肺中促炎介质的水平大大提高(3.,5,10- - - - - -14).在这里,我们展示了树突状细胞(DCs)的一个子集,描述为TNF-α/诱导型一氧化氮合酶(iNOS)产生的DCs (tipDCs) (15),在致死(相对于亚致死)流感感染过程中积累的数量显著增加(无花果S1。).然而,尽管人们可能期望消除tipDCs会改善疾病过程,但我们发现情况恰恰相反。tipDCs还驱动局部的保护性CD8+病毒感染呼吸道的“杀手”T细胞反应最有趣的是,我们发现,部分地妥协tipDC招聘可以起到保护作用。给予小鼠II型糖尿病药物吡格列酮可减少但不能阻止tipDC的招募,同时允许足够的CD8+T细胞扩张,以防止致命的HP流感病毒的挑战。
结果
HP和亚致死性流感感染期间的固有细胞募集。
虽然在HP流感感染期间,促炎细胞因子和趋化因子的快速积累已经被广泛描述,但导致这种免疫诱导病理的细胞类型的身份尚不清楚。因此,我们测量了自然杀伤细胞(NKs)、传统dc (cdc)、中性粒细胞、巨噬细胞和tipDCs在感染H1N1 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)小鼠或H3N2 A/Aichi/68 (x-31)小鼠C57BL/6J (B6)小鼠中的肺募集动力学。一种包含PR8的6个内部基因和典型H3N2病毒的表面HA和神经氨酸酶(NA)的重组。鼻内感染10例3.PR8的空斑形成单位(pfu)在感染后第10天是一致的致命,而所有的人给予10天5x-31的pfu在减掉15–20%的体重后,在第12天恢复(图1一个).每日采集组织(n= 5)灌胃7 d后,采用流式细胞仪(表S1).两种病毒的巨噬细胞、cdc、中性粒细胞和NKs的转运谱具有可比性(无花果S2。).相反,感染HP PR8病毒后,tipDCs从第3天开始积累到显著增加,并在第7天持续增加(图1C和D).此外,其他人(3.,5,10- - - - - -14),经HP病毒(S3无花果。).
这一分析(图1模拟)的x-31和PR8,然后扩展为两种流感病毒:H5N1 A/越南/1203/2004 (VN1203,来自2004年的致命人类感染)有LD50而H5N1 A/香港/213/2003 (HK213)的毒性要小得多(LD50= 103.7空斑形成单位)。老鼠给102VN1203的pfu在第9天致命,而HK213则在第12天完全恢复,体重下降20% (图1B).正如我们之前所发现的(图1模拟),在HP vn1203感染动物的肺部中发现了显著较高的细胞计数(图1C和E),但巨噬细胞、中性粒细胞、cdc或NKs的数量没有一致的差异(无花果。S4).由于从高安全生物安全级别(BSL) 3+空间(感染HP H5N1病毒的小鼠所在的空间)中提取样本受到限制,我们无法重复对x-31和PR8病毒进行的细胞因子分析S3无花果。.
趋化因子(C-C Motif)受体2 (CCR2)调节tipDC转运和CD8+T细胞反应强度。
已知tipDC前体从骨髓迁移依赖于通过CCR2受体(16).因此,我们比较了tipDCs在CCR2之间的迁移动力学−−/和CCR2+/+(B6)小鼠感染亚致死剂量(102pfu)。如其他人所述(16),几乎没有(如果有的话)tipDCs可以从CCR2的肺中恢复−−/集团(图2一个).然而,鉴于我们先前的结论,即气道中tipDC数量越多,疾病情况越严重,这是令人惊讶的(图1一部)是CCR2−−/小鼠的发病率和死亡率没有降低(图2B和C)。这些结果与之前的一项发现相反,即CCR2缺乏可降低流感引起的死亡率(17,18).比较这些研究很困难,因为每项研究都使用了不同的模型系统。道森等人(17)使用了5个血细胞凝集单位的感染剂量,这掩盖了研究之间比较感染剂量的能力。林等人(18)采用组织培养,50%感染剂量8.9 × 105.这一剂量几乎比本研究中使用的剂量高3 log。发病率和死亡率的显著差异是由于不同的感染剂量造成的,这是合理的。
进一步分析表明,在缺乏tipDCs的情况下,持续的脆弱性可能反映了肺部感染控制的失败。虽然不能从CCR2的BAL液中回收病毒+/+对照组第9天滴度为103.6空斑形成单位(SEM±103.3)被记录在来自CCR2的可比样本中−−/TIPDC的存在或不存在如何影响病毒清除?清除产生流感病毒的呼吸道上皮细胞的主要机制被认为是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的裂解(19,20.).除了对tipDC招募的影响,还有(通过Db帕224 - 233KbPB1703 - 711和DbPB1-F262 - 70四聚体)显著降低流感特异性CD8+感染后第7天采集的BAL样本的CTL计数(图3一个).这是一种间接影响,还是CTL数量在某种程度上依赖于tipDCs的同时存在?似乎这种影响可能是局部的,因为它只在肺中明显,而在区域纵隔淋巴结(MLNs)中不明显,那里有病毒特异性的CD8+在CCR2中,T细胞群的数量基本相等+/+和CCR2−−/老鼠(图3B).
tipDCs将抗原呈递到肺部的CD8 T细胞。
因为流感特异性CD8+CCR2的肺(但淋巴结)中的T细胞计数显著减少−−/动物(图3一个),我们接下来的问题是,tipDCs如何调节病毒特异性CD8+T细胞数量。一种可能性是,tipDCs可以产生可支持CD8的可溶性因子+T细胞存活,分裂,或者两者兼而有之。因此,我们测定了pr8激发CCR2的无细胞BAL液中23种细胞因子和趋化因子的浓度−−/和CCR2+/+发现参与调节CD8 T细胞的关键细胞因子(包括IL-2和IL-4)没有显著差异(无花果S5。).下一步是评估tipDCs作为抗原提呈细胞(APCs)的功能。在本实验中,从pr8感染的B6小鼠的第6天BAL洗涤中纯化tipDCs(与中性粒细胞作为对照),然后与CD8孵育+D细胞特异性T细胞杂交瘤bPB1-F262 - 70表位。不出所料,中性粒细胞没能刺激杂交瘤。相比之下,新鲜分离的tipDCs则相当于每个D细胞40 pmolbPB1-F262 - 70抗原决定基(图3C).由于在本实验中没有添加外源性肽,很明显,tipDCs既在原位处理了流感蛋白,又表达了PB1-F262 - 70肽/ H2DbMHC I类糖蛋白复合物在病毒感染的肺细胞表面。
然而,证明具有处理和呈递可被CD8 T细胞杂交瘤识别的抗原的能力并不能证明TIPDC确实在流感病毒感染期间充当APC。事实上,很明显,TIPDC不是唯一驱动流感特异性CD8克隆扩增的APC+T细胞的前体。我们无法在感染后的任何点从引流的MLN中分离出tipDCs,淋巴结CTL对D产生反应b帕224 - 233KbPB1703 - 711和DbPB1-F262 - 70抗原表位(图3B)与CCR2相同−−/和CCR2+/+老鼠。如果tipDCs在体内确实起到APCs的作用,则这种功能在引流淋巴结外表现出来。
为了进一步描述tipDCs是否能作为呼吸道APCs发挥作用,我们从被x-31或双敲除(DKO) x-31病毒感染的B6小鼠BAL中纯化了tipDCs。变异的NP366 - 374和爸爸224 - 233DKO病毒中的多肽不与H2D复合b,因此对这些抗原决定基的反应就丢失了(21).然后我们转移了10个4从x-31或dko感染的小鼠中恢复的tipDCs直接进入CCR2气道−−/在24小时前感染x-31病毒的动物。我们发现从CCR2给予TIPDC+/+用完整的x-31病毒感染的动物的CCR2−−/DbNP366 - 374-和Db帕224 - 233-特异性CD8+CTL反应,而来自DKO病毒感染的类似小鼠的反应,>低10倍(图3D).CD8的恢复+tipDC转移后的T细胞反应明显具有抗原依赖性,证明tipDC确实可以作为CD8的APC+感染甲型流感病毒的小鼠肺中的T细胞。这些结果与最近发现的CD8相一致+T细胞和树突状细胞在流感感染小鼠的肺部相互作用(22).
减少tipDC积累可防止致命流感挑战。
到目前为止,我们已经证明,在感染HP流感A病毒的小鼠中,tipDCs的数量显著增加,这些tipDCs作为APCs在呼吸道局部发挥作用,它们是充分实现保护性CD8的必要条件+T细胞介导的免疫反应。此外,他们的肺部完全没有CCR2−−/提示tipDC消融不是一种可行的治疗选择。
考虑到这一点,我们假设减少,而不是消除,在HP流感病毒A攻击后,肺中的tipDC积累可能被证明对宿主有益。而寻找药物抑制趋化因子(碳碳主题)配体2 (CCL2)分泌,我们发现发表的证据表明,激活的过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)合成受体激动剂吡格列酮可以降低生产的多种促炎的分子,包括CCL2, TNF -α,伊诺(23- - - - - -25).有了这些知识,我们推测预防方案吡格列酮可能通过减少气道招募的tipDCs的数量提供对HP流感挑战的保护。以体重减轻作为发病率的衡量指标,B6小鼠在感染前3天开始口服吡格列酮(60 mg/kg, 100 μL PBS)或PBS (100 μL), 5只小鼠50%致死剂量(MLD)50)。与PBS对照组相比,吡格列酮治疗的动物受影响较轻,恢复较快(图4一个),而死亡率则由92%降至50% (图4B).
这种保护作用是炎症减少的结果吗?为了探讨这种可能性,用吡格列酮或PBS处理小鼠肺内的免疫细胞,并用5 MLD进行激发50用流式细胞术计数PR8病毒的数量。尽管细胞炎性渗出物的大小普遍下降,但在统计学上唯一显著下降的是tipDC (图4C)这一发现与最近的一项研究一致,在该研究中,通过CCR2依赖机制增加炎症与死亡率增加相关(26).此外,当我们测量吡格列酮对BAL上清液中促炎细胞因子和趋化因子的影响时,在药物处理的动物中,只有CCL2 (MCP-1)和MCP-3降低到具有统计学意义的水平(图4D和E).
为了确定吡格列酮的保护作用是否与抑制病毒复制有关,我们测量了感染后第3、6和9天吡格列酮和pbs治疗的动物BAL液中的病毒滴度。各时间点的病毒滴度均无显著差异(无花果S6。一个).此外,在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中,高达1 μg/mL的吡格列酮(与PBS相比)没有抑制病毒复制(无花果S6。B).总之,这些结果表明,在吡格列酮处理的B6小鼠中观察到的保护作用反映了tipDCs招募的减少(通过抑制CCL2 (MCP-1)和MCP-3),而不是任何病毒复制的抑制。
讨论
本研究证实,感染HP型甲型流感病毒株的年轻健康个体死亡率的不成比例增加与tipDCs向肺招募的显著增加有关。然而,尽管tipDCs促进免疫诱导病理,完全消除它们是有害的。这表明它们也具有APCs的功能,促进效应器CD8的最佳扩张+病毒感染呼吸道内的T细胞
顺便提一下,CD8明显增加+由局部存在的抗原呈递tipDCs诱导的T细胞计数也提供了一个关于流感中T细胞介导免疫本质的老问题的见解。现在看来,效应剂CD8+ctl确实在离开淋巴组织后继续在病理部位分裂,尽管正式的替代方案仍然(当然)是,tipDCs的功能是促进抗原特异性CD8+T细胞滞留在受感染的肺部(而不是进一步循环)。无论哪种方式,tipDCs都能增强CD8的保护性+T细胞反应。
因为CD8+T细胞在清除流感病毒中起着关键作用(19,20.),迟钝的反应损害了对感染过程的控制,并导致发病,抵消了免疫病理减弱可能带来的任何积极后果。在这里,我们演示了PPAR-γ激动剂吡格列酮的使用。我们发现吡格列酮的预防性治疗足以降低HP甲型流感病毒感染的发病率和死亡率。吡格列酮治疗的疗效与CCL2 (MCP-1)和MCP-3分泌水平的降低有关,并最终减少气道招募到tipDCs的数量,但与病毒复制的减少无关。实际上,吡格列酮治疗在免疫反应的保护性后果和病理性后果之间找到了一条更好的“中间道路”。
从目前的分析结果确定了一个新的治疗靶点,免疫操纵,tipDCs。以往使用全球免疫抑制剂(如类固醇)的研究未能预防致命流感病毒的挑战(27).这并不奇怪,这种非特异性免疫抑制剂没有带来任何好处,因为细胞介导免疫系统的减少极大地妨碍了病毒的清除。基于目前的研究结果,我们有理由认为,新的治疗方法可能侧重于促进减少而不是消除呼吸道tipDCs积累的中间途径。此外,针对tipDC招募的可能性可能对其他疾病有价值,在这些疾病中,过度的免疫反应促进病理和严重的疾病后果值得考虑(28).
方法
病毒
PR8和x-31 A型流感病毒是从圣犹大儿童研究医院的仓库中获得的。x-31 DKO病毒突变,无应答DbNP366 - 374和Db帕224 - 233早期使用8质粒反向遗传系统生成的多肽(21,29).HK213和VN1203病毒是通过世界卫生组织全球流感监测网络获得的。用鸡胚尿囊接种10天的鸡胚进行繁殖,在MDCK单层上测定病毒滴度为pfus。对H5N1病毒的实验是在美国农业部批准的BSL 3+控制设施中进行的。
老鼠。
野生型C57BL/6J (B6)和CCR2−−/小鼠购自杰克逊实验室,并被安置在特定的无病原体条件下。本研究中所有小鼠均根据圣犹大儿童研究医院动物护理和使用委员会批准的协议使用。
病毒感染和样本收集。
小鼠经腹腔注射阿维丁(2,2,2-三溴乙醇)麻醉后,将适当剂量的病毒稀释于30 μL无菌无内毒素PBS进行腹腔攻毒。动物在感染前称重,然后每天监测体重减轻情况,作为发病率的衡量标准,或在适当的时间点对动物实施安乐死,以收集样本。三次1毫升HBSS洗涤收集BAL液。细胞轻离心成球,用库尔特计数器(IG仪)测定每个BAL样本的总数。
流式细胞术分析。
用fitc标记的抗ly6g (1A8;BD Biosciences),藻红蛋白(PE)标记的抗mhc II类(AF6-120.1;BD Biosciences), pe - cy5标记的抗cd11c (N418;Alexa Fluor 647标记的anti-Ly6c (ER-MP20;AbD Serotech), allophycocyanin (APC)-Cy7-labeled anti-CD11b (M1/70;BD Biosciences), fitc标记的抗cd4 (RM4.5;BD Biosciences), pe标记抗nk1.1 (PK136;apc标记αβT细胞受体(H57-597;BD)、apc - cy7标记的抗cd8 (53-6.7;或pe标记的抗tnf -α (MP6-XT22; BD Biosciences) after blocking of the Fc receptor with anti-CD32/CD16 (BD Biosciences) at 4 °C. For CD8+T细胞分析,细胞用D特异性四聚体染色b帕224 - 233KbPB1703 - 711,或者维bPB1-F262 - 70表位在室温下保存1小时,然后用单克隆抗体(mAbs)染色。细胞内染色是通过对细胞表面标记物进行染色,然后用2%多聚甲醛固定,并用Perm/Wash缓冲液渗透(BD Biosciences)。对于iNOS染色,细胞与山羊抗iNOS (M-19;Santa Cruz生物技术),其次是fitc偶联抗山羊IgG (Jackson ImmunoResearch)。使用FACSCalibur或FACScan (BD Biosciences)采集数据,使用FloJo (Tree Star)分析数据。为了表征细胞类型,绘制了一个大栅格,包括单核细胞和淋巴细胞种群,从前向散射和侧散射。通过表达细胞特异性标记物,细胞进一步分化表S1.使用库尔特计数器(IG instruments)测定每个BAL样本的活细胞数,并将每个细胞类型的百分比(由FACS确定)乘以每个BAL回收的活细胞总数计算单个细胞亚群。
细胞因子和趋化因子定量。
采用Bio-Rad复合法测定无细胞BAL液中的小鼠细胞因子和趋化因子。
病毒效价测定。
无细胞BAL液样品通过MDCK细胞上的菌斑试验进行滴定。接近汇合25 cm2用6倍稀释的BAL液1 mL在37℃感染MDCK单层细胞1 h,然后用PBS洗涤,然后加入3 mL含1 mg/mL的MEMl-1-甲苯胺-2-苯乙基氯甲基酮处理胰蛋白酶(Worthington)和0.9%琼脂糖。培养物在37°C, 5% CO下培养272 h后,用结晶紫显示斑块。
tipDCs对T细胞杂交瘤的刺激。
野生型B6小鼠感染105感染后第6天,收集BAL液,通过细胞分选(MoFlo;Beckman Coulter)纯化TIPDC(≈1 × 104)在2 × 10的96孔板上共培养4DbPB1-F262f_2 -54杂交瘤细胞与DbPB1-F262但与D负相关b帕224KbPB1703KbNS2114和DbNP366.同时,用连续稀释的PB1-F2对未感染的脾细胞进行脉冲,得到标准曲线62多肽,与F2-54杂交瘤共培养。IL-2的产生与APC细胞表面MHC I类表达直接相关,根据制造商的说明,使用纯化的抗IL-2和生物素抗IL-2抗体(BD BiosciencesBD),通过ELISA检测IL-2的产生。根据标准曲线得出的IL-2产量计算表位浓度,用测定的肽量除以加入检测的APC的数量来计算每个APC提供的肽量。
tipDC转移。
B6小鼠用105完整的x-31或D中断的DKO病毒的pfubNP366 - 374和Db帕224 - 233抗原表位。感染后第6天,用MoFlo (Beckman Coulter)从BAL液中分离出tipDCs,纯度>95%。在CCR2−−/动物感染了105空斑形成单位x-31。感染后第1天,104从给予x-31或DKO的动物中纯化的tipDCs经气管内转移到CCR2中−−/动物。在tipDC转移后6天(感染后7天)收集BAL液,并用D特异性四聚体染色bNP366 - 374和Db帕224 - 233表位在室温下放置1小时。在4°C下用抗CD32/CD16(BE Biosciences)阻断Fc受体后,用APC-Cy7标记的抗CD8(eBioscience)对细胞进行染色,并通过流式细胞术(FACScan,BD Biosciences Pharmingen)进行分析。使用库尔特计数器测定每个BAL样本的总细胞数(IG仪器)。
吡格列酮治疗。
B6小鼠在感染前3天开始口服吡格列酮60 mg/kg (100 μL PBS悬液),感染后继续每日灌胃。对照组小鼠给予100 μL PBS,两组小鼠均给予5 MLD刺激50PR8。每天监测体重减轻情况作为发病率的衡量标准。在感染后的第3天和第6天,治疗组和对照组的小鼠被安乐死。用HBSS三次1-mL洗涤收集BAL液,用轻离心分离细胞。使用Coulter计数器测定每次BAL的总细胞数,并用流式细胞仪分析细胞。采用空斑试验测定BAL液中病毒滴度。细胞因子和趋化因子采用Bio-Rad多重检测法定量,MCP-3除外,采用ELISA法(Bender MedSystems)测定。
统计分析。
数据以平均值±SEM表示。时间过程数据,即细胞计数、细胞因子和趋化因子表达,采用多元回归分析。当存在显著交互效应时,通过对每个时间点进行方差分析,考察病毒或处理的简单效应。该分析使用回归分析的均方误差计算多重比较F统计资料如果交互作用不显著,则进行模型简化,以找到最小的适当模型。类似的技术被用于分析感染后的体重减轻。然而,由于在每个时间点测量每只小鼠,因此在回归模型中将小鼠作为随机效应包括在内。模型简化在R2.8.0中进行(www.R-project.org).所有其余的分析在JMP 4.0.4 (SAS研究所)中进行。
致谢
我们感谢颜慧玲和文佳的建议;理查德·威比为DKO病毒;Scott Krauss、Melissa Morris、Richard Cross、James Knowles、Jennifer Rogers、Ashley Webb、Yolanda Griffin和Cedric Proctor获得优秀的技术援助;Ray Kuhn和Sharon Naron获得编辑协助;请朱莉·格罗夫协助无花果S1。;以及世界卫生组织全球流感监测网络提供的H5N1病毒。作者将这份手稿献给我们的好朋友和同事,已故的塞德里克·普罗科特。Cedric在我们高密封设施中的支持对完成目前的研究至关重要。这项工作得到了美国国家过敏症和传染病研究所、美国卫生与公众服务部国家卫生研究院和美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构HHSN266200700005C合同的支持。
脚注
- 1信件应寄给谁。电子邮件:robert.webster在}{stjude.org
作者贡献:J.R.A、C.E.M、P.C.D、R.G.W、P.G.T.设计研究;D.A.B J.R.A C.E.M。,镉比,J.F。和P.G.T.进行研究;S.A.B.提供了新的试剂/分析工具;N.J.N.分析数据;j。r。a。写了论文
作者声明没有利益冲突。
参见页面评论4961.
这篇文章包含了在线支持信息www.pnas.org/cgi/content/full/0900655106/DCSupplemental.