用1918年大流行病毒的血凝素增强甲型流感病毒的毒力

1918 - 1919年的“西班牙”流感大流行是有记录以来最具破坏性的传染病爆发。至少2000万人¹死于他们的疾病，其特征是异常严重和快速的临床过程。1918年流感病毒几个基因的完全测序使得研究这些基因在反向遗传学生成的病毒中编码的蛋白质的功能成为可能，这种技术允许完全从克隆的互补DNA生成传染性病毒。因此，为了确定1918年大流行性流感A株的特性，可能与其非凡的毒性有关，制造了含有病毒血凝素的病毒²(HA)和神经氨酸酶^3.(NA) 1918年菌株的基因。该毒株的HA支持小鼠适应病毒在该动物中的致病性^4，5．在这里，我们证明了1918年病毒的HA在小鼠中增强了对最近的人类病毒的致病性，否则在这个宿主中是非致病性的。此外，这些表达1918年病毒HA的高毒力重组病毒可感染整个肺，并诱导高水平巨噬细胞来源的趋化因子和细胞因子，导致炎症细胞浸润和严重出血，这是最初大流行期间产生的疾病的特征⁶．

1918年甲型流感病毒的HA受体/融合基因序列^sp)于1999年确定(参考。2)，紧接着是NA基因(N^sp）^3.它编码病毒唾液酸酶。这些分子代表了流感病毒的主要病毒表面糖蛋白，是宿主免疫反应的重要靶点，其结构的关键变化可以扩大病毒宿主范围，增强感染的毒力^7，8．然而，1918年病毒的两种蛋白质都不包含已知与高毒力相关的序列基序^2，3.．解释这种病毒异常高毒性的尝试主要集中在第一次世界大战结束时士兵和平民的生活条件上，士兵是一个高度易受感染的群体⁹，以及病毒本身潜在的独特特性^10，11．H的组合^sp和N^sp在A/WSN/33 (WSN) (H1N1)遗传背景中，在没有事先适应这些宿主的生长的蛋白质的情况下，被证明在小鼠中具有致病性^4，5这通常是在小鼠身上产生人类病毒致命感染的先决条件。然而，WSN本身既适应小鼠，又在小鼠体内具有高致病性，因此无法评估H^sp和N^sp对重组病毒的致病性进行了研究。另一个候选基因，1918年病毒的非结构基因，在具有a /Puerto Rico/8/34 (H1N1)遗传背景的重组病毒中测试时，具有衰减作用，这也是一种在小鼠体内的高致病性病毒¹⁰．将WSN的基质、核蛋白和非结构蛋白基因分别替换为1918年病毒的基因，再加上H^sp和N^sp在小鼠中也具有致病性^4，5但不显著高于只含有H的重组体^sp和N^sp基因。因此，1918年大流行病毒空前毒力的分子基础仍不确定，这为直接测试H^sp和N^sp致病性。

因此，我们使用逆向遗传学¹²制造一组含有H^sp与N一起^sp或在WSN、K173和A/Memphis/8/88 (H3N2) (M88)三种流感病毒剩余负意义RNA基因片段的背景下，A/Kawasaki/173/2001 (H1N1) (K173) (表我)．在胰蛋白酶存在下，所有重组病毒在犬肾(MDCK)细胞单层上形成空斑，并有效复制到高滴度(数据未显示)。

评价H^sp和N^sp对致病性在活的有机体内，小鼠鼻内接种重组病毒和亲本病毒。每一个携带H的病毒^sp以及WSN病毒在感染后第3天在肺部复制到高滴度(p.i;表我)，并具有致病性，导致严重的发病率和最终死亡。值得注意的是，K173和M88亲本人类病毒在小鼠中没有引起明显的发病率，并且仅在肺中复制到低滴度，而K173/H^sp和M88 /小时^sp在病毒中，原来的HA蛋白被H^sp，在小鼠中引起致命感染。N^sp蛋白对病毒致病性没有贡献，因为病毒含有H^sp和N^sp与K173 NA相比，致病性并不高。相比之下，WSN的HA和NA蛋白并没有显著增强M88或K173的毒力，这表明重组M88/HN接种小鼠后没有发病^摘要:以及与K173/HN相关的有限疾病^摘要:感染。WSN/H的能力^spN^sp(H^sp和N^sp在WSN背景下)和WSN在呼吸道外器官中的复制也进行了评估，在心脏、脾脏、肝脏、肾脏或大脑中没有检测到复制的证据。小鼠脑内接种6 × 10⁵WSN的斑块形成单元(PFU)， WSN/H^spN^sp或K173 /小时^spN^sp(H^sp和N^sp在K173背景下)导致只在大脑中复制WSN(数据未显示)，这一结果与纤溶酶原被NA结合激活HA并增加WSN的神经嗜性的能力一致¹³， K173或1918病毒的NA蛋白所不具有的特性。含H病毒的相对致病性^sp这取决于提供其他基因片段的病毒类型。对WSN /小时^spN^sp杀死50%感染小鼠所需的剂量(MLD₅₀)与WSN (表我)．MLD₅₀其他病毒的值均高于WSN/H^spN^sp，反映了与未适应的人类病毒相比，适应于小鼠的WSN的基因的贡献。因此，H^sp具有未知的特性，在WSN HA中没有发现，这决定了它在小鼠中增强甲型流感病毒毒力的能力。

为了进一步了解1918年病毒毒性的增加，我们检查了经鼻内感染10 MLD的小鼠的肺部₅₀(详见MLD的方法₅₀)的WSN, WSN/H^spN^sp, M88 /小时^spN^sp(H^sp和N^spM88背景)或M88/H^sp，或相当于(PFU) 10 MLD的M88剂量₅₀M88 / H^spN^sp(因为M88并不致命)。第6天p.i.。WSN/H的病毒抗原分布^spN^sp, M88 /小时^spN^sp和M88 /小时^sp比M88或WSN更宽，包括支气管、细支气管和几乎整个肺泡上皮(图1 a - c；另请参阅补充图1和图2；M88/H数据^spN^sp没有显示)。感染带有H^sp其特征是大量多形核细胞(主要是中性粒细胞)聚集并伴有肺泡内出血(图1 d；另请参阅补充图1和图2)．另一方面，M88产生了有限的炎症灶，这是由细支气管的初始感染引起的，只有少量延伸到邻近的肺泡。大部分肺部与正常、未感染的对照组有相似的外观(图1 e，f；另请参阅补充图1)，只检出有限的病毒抗原(图1；另请参阅补充图1)．H的存在^sp在M88 /小时^sp与M88相比，在更长的时间内允许更大的病毒复制，如第6天的病毒抗原检测所示。（图1一个，b)，但含有H .^sp并不仅仅与病毒复制的程度有关。在同时感染WSN和WSN/H的小鼠肺中发现了高滴度的病毒^spN^sp在每天的第3天和第6天。，but lesions produced by WSN/H^spN^sp在肺组织中明显更严重(补充表1而且补充图2a, b)．WSN感染小鼠肺具有支气管肺炎的特征，但炎症反应和病毒抗原主要局限于支气管、细支气管和细支气管周围肺泡。如M88/H^sp重组病毒只具有1918年病毒的HA，引起了与WSN/H相似的严重肺部感染^spN^sp或M88 /小时^spN^sp感染，这些结果表明H^sp是重组病毒致病性增强的主要决定因素。严重的肺部感染是由最初的大流行病毒在人类中产生的疾病的一个标志⁶，表明大流行性病毒血凝素与其在人类中的致病性之间可能存在(尽管不是结论性的)联系，并表明有必要在其他动物模型中研究血凝素对病毒致病性的贡献。

人类流感病毒诱导疾病的严重程度与毒力病毒株诱导巨噬细胞促炎细胞因子的能力相关^14，15．此外，在流感感染者中，细胞因子水平与临床症状严重程度之间有很强的相关性^16，17，18．因此，H^sp-表达病毒可能与它们诱导促炎细胞因子和对感染小鼠组织造成免疫损伤的能力增强有因果关系。为了探究这种可能性，我们比较了毒力不同的病毒分离株肺部细胞因子/趋化因子的水平。M88/H肺中单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、MIP-2、MIP-3α、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-12 (p40)、IL-18和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)水平显著降低^SP-感染小鼠明显高于m88感染小鼠(图3)．因为激活的巨噬细胞是炎症期间IL-1β， IL-6, IL-12, IL-18和G-CSF的主要来源，这些细胞因子的高水平存在强烈地指示巨噬细胞激活(补充图3)．然而趋化因子MCP-1、MIP-1β和MIP-3α能够诱导混合白细胞募集到炎症部位，MIP-2(中性粒细胞的强趋化剂)的强烈诱导与M88/H肺中粒细胞的浸润高度一致^SP来华的老鼠。综合来看，这些数据表明H^sp是巨噬细胞激活的关键决定因素，特别是在感染早期(见图3)，以及产生中性粒细胞的趋化剂，从而导致中性粒细胞的转运和急性肺损伤^19，20.．

1918年的病毒被认为起源于禽类²．因此，HA识别人类病毒的首选受体物种的相对能力-唾液酸通过α2,6连接与邻近的半乳糖结合(neuac α-2,6 gal)，而鸟类病毒的首选受体neuac α-2,3 gal²¹-被认为会影响其感染人类并引发疾病的能力。利用竞争性结合实验，我们发现H^sp优先识别neuac α-2,6 gal (图2)．尽管人类在呼吸道上皮细胞中具有这两种类型的受体，并且容易受到含有任一受体特异性的HA蛋白的病毒的感染²²迄今为止研究的所有人类病毒都优先识别neuac α-2,6 gal而不是neuac α-2,3 gal²¹．因此，我们的数据表明，最终成为1918年大流行毒株的病毒必须在人类中传播，或者可能是另一种具有人类类型受体的适应性宿主(如猪)，有足够的时间对人类唾液酸受体产生偏好。该模型得到了最近解决的H^sp(参考文献23，24)，从而预测该蛋白会优先与人类受体结合²³．

影响流感大流行或流行严重程度的另一个因素是对病毒已有的免疫水平。为了评估人类在多大程度上免受1918年样病毒的出现，我们比较了1999年从年龄相差很大的患者身上获得的一组人类血清中的中和活性。大多数年龄小于15岁的血清供体，大多最近感染过H1N1病毒，对最近的H1N1测试病毒表现出很强的中和活性，但对WSN/H只有有限的活性^spN^sp病毒(图4；另请参阅补充表2)．相比之下，1918年活着的献血者的血清样本显示出明显的抗WSN/H活性^spN^sp与最近H1N1和H3N2分离株相比。1934年至1978年间出生的供体对WSN/H的中和活性有限^spN^sp病毒。因此，很大一部分人口将容易受到1918年流感病毒爆发的影响。唯一具有显著自然保护的群体是1918年流感大流行的幸存者，他们对80多年前接触过的抗原仍然表现出高水平的抗体，这种现象被称为原始抗原罪^25，26．

对1918年大流行期间感染的人保存的组织中病毒基因直接获得的序列信息进行分析，为评估HA、NA和其他病毒蛋白对这种独特病原体的极端毒性的贡献提供了无与伦比的机会。利用逆向遗传学技术生成一组含有不同H^sp和N^sp在不同的遗传背景下，我们表明，1918年病毒的HA蛋白(而不是NA蛋白)在动物模型中对于高毒力感染是必不可少的。然而，流感病毒的毒力可能是一个多基因特征，因为最终我们期待其他基因产物，如NS1蛋白²⁷与1918年流感病毒的表型有关。H^sp其他人的基因表明它起源于鸟类²因此很可能包含在仍在禽类中传播的病毒中，在禽类中病毒蛋白保持相对不变。一旦H的性质^sp如果能更好地了解导致其致命传染性的基因，就有可能设计出有效的控制措施，并改善对人类和其他动物物种构成最大威胁的流感病毒的全球监测网络。

病毒

采用70 mer寡核苷酸连续聚合酶链反应扩增法构建1918年甲型流感病毒HA (GenBank登录号AF117241)和NA (GenBank AF250356)基因，克隆到含有RNA聚合酶I启动子和终止子的质粒载体(pPolI)中，生成pPolI- 1918ha和pPol-1918NA。重组病毒WSN/H^spN^sp, K173 /小时^spN^sp, K173H^sp, M88 /小时^spN^sp, M88 /小时^spK173 / HN^摘要:M88 / HN^摘要:亲本病毒K173、M88和WSN是通过前面描述的反向遗传产生的¹²．病毒在MDCK细胞上传代两次，存在1.0µg ml¹tpck处理的胰蛋白酶在微量必需培养基(MEM)中添加0.3%牛血清白蛋白和抗生素。流感病毒A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (NewCal)、A/duck/Hong Kong/836/80 (H3N1) (dk/HK/80)和另一种最近的临床分离病毒A/Kawasaki/233/2001 (H1N1) (K233)在MDCK细胞中相似地繁殖。所有与含有1918年病毒基因的病毒相关的程序都在温尼伯加拿大卫生部国家微生物实验室的生物安全4级设施中进行，或在威斯康星大学麦迪逊分校的增强BSL3设施中进行。

在体外病毒复制分析

半融合的MDCK细胞以每细胞0.001 PFU的感染倍数感染，每种病毒保持在用于病毒繁殖的相同生长条件下。上清分别于每小时0、15、24、39和48小时采样，在1.0µg ml存在的情况下，用标准斑块法测定融合MDCK细胞的滴度¹TPCK-trypsin。报告重复试验结果。

固相结合法分析血凝素受体

如前所述，在96孔板的孔中，允许病毒在4°C下附着过夜²⁸．含有唾液酸的聚合物结合缀合物N-乙酰神经氨酸通过α-2,3或α-2,6键与半乳糖相连(neu5ac α2,3 lacnacb - pap和neu5ac α2,6 lacnacb - pap)，如前所述²⁹．在含0.01% t吐温-20 (TPBS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续稀释每种唾液基糖缀合物，并将25µl与25µl 47 nM辣根过氧化物酶(HRP)偶联牛胎蛋白一起添加到含有固定化病毒的孔中。在4°C孵育2 h后，用PBS广泛清洗孔，每孔100µlo-苯二胺(0.4 mg ml¹)在0.02% H中₂O₂，加入50 mM柠檬酸磷酸盐缓冲液，pH 5.5。25°C孵育15 min后，读取490 nm处的吸光度。

病毒致病性和致死剂量测定

异氟烷麻醉的6周龄雌性BALB/C小鼠鼻内接种病毒10倍连续稀释(每稀释3只小鼠)于100 μ l PBS。这些小鼠在21天内每天都被监测疾病症状和生存情况。杀死50%小鼠所需的剂量(MLD₅₀)采用ref方法计算。30.．

为了确定病毒在小鼠中的复制程度，我们用10 MLD鼻内接种动物₅₀M88 / H^spN^sp, M88 /小时^sp, K173 /小时^spN^sp, K173 /小时^sp、WSN或WSN/H^spN^sp，或注射非致病性病毒M88或K173, PFU相当于10 MLD₅₀M88 / H^spN^sp和K173 /小时^spN^sp,分别。第3天和第6天。，thelungs, heart, spleen, kidneys, liver and brain were collected from mice infected with WSN and WSN/H^spN^sp（n= 5).第3天p.i.。，thelungs of mice infected with the remaining viruses were collected. The organs were homogenized, and virus growth was determined in each tissue by plaque assay on MDCK cells.

为了评估具有1918病毒HA和NA基因的病毒在中枢神经系统中的复制能力，我们用6 × 10接种4周龄BALB/C小鼠⁵WSN的PFU, WSN/H^spN^sp或K173 /小时^spN^sp．在p.i.第4天收集大脑。用空斑法测定MDCK细胞的病毒复制情况。

用10个MLD感染小鼠进行病理分析₅₀M88, M88/H^spN^sp, M88 /小时^sp、WSN和WSN/H^spN^sp病毒在第3天和第6天处死小鼠后，将肺取出并固定在10%磷酸盐缓冲的福尔马林中。然后将组织脱水，用石蜡包埋，切成5微米厚的切片，用标准苏木精和伊红染色。病毒抗原检测切片采用两步右旋糖酐聚合物法(DAKO)进行免疫染色，兔抗WSN多克隆抗体为一抗。

所有的动物实验都是在经过批准的动物使用文件下进行的，并根据加拿大动物护理委员会的指导方针进行。

细胞因子/趋化因子分析

异氟烷麻醉6周龄BALB/C小鼠鼻内接种10 MLD₅₀M88 / H^sp或1.5 × 10⁶空斑形成单位M88。第1天，第3天，第5天和第6天。，lungs were collected from three mice infected with each virus and homogenized in PBS. MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MIP-3α, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-18, G-CSF, granulocyte-macrophage (GM)-CSF, tumour-necrosis factor (TNF)-α, IP-10, RANTES, vascular endothelial growth factor (VEGF), interferon (IFN)-α, and IFN-γ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (R&D Systems).

人血清中和试验

血清样本采集于1998-2001年间，年龄在15个月至102岁之间。血清用受体破坏酶(RDE) (Accurate Chemical and Scientific Corp.)处理，以破坏流感病毒复制的抑制剂。在56°C处理1 h后，RDE失活，WSN/ h^spN^sp和K233分别与两倍连续稀释的血清在37°C孵育1 h。剩余的传染性是通过在MDCK细胞上的斑块试验中滴定样品来确定的。

我们感谢D. Dick, A. Grolla, M. Garbutt和S. Jones对BL4程序的帮助，M. McGregor和K. Wells的技术援助，J. Gilbert对手稿的编辑，以及Y. Kawaoka的插图。这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部、CREST(日本科学技术公司)、NIAID公共卫生服务研究补助金和加拿大卫生部的资助。

作者指出

1. Darwyn Kobasa

   现地址:加拿大曼尼托巴省温尼伯市人类和动物健康科学中心国家微生物实验室，邮编R3E 3R2

2. 恭子山中

   现地址:日本东北大学医学研究生院动物实验研究所，仙台市980-8575

3. Keiko Mitamura

   现地址:日本川崎市立医院儿科，川崎210-0013

4. Norio Sugaya

   现地址:日本横滨，220-0012，启裕医院儿科

从属关系

1. 威斯康辛大学病理生物科学系，美国威斯康辛州麦迪逊53706

   Darwyn Kobasa, Masato Hatta, Peter Halfmann, Shinji Watanabe, M. Suresh和Kawaoka Yoshihiro

2. 东京大学医学科学研究所微生物与免疫学系病毒学研究室，东京，108-8639，日本

   高田绫子，新谷京子，前田靖子和河冈义弘

3. CREST，日本科学技术振兴机构，日本埼玉，332-0012

   高田Ayato，铃木隆，铃木康夫和河冈义弘

4. 加拿大卫生部国家微生物实验室特殊病原体计划和马尼托巴大学医学微生物学系，温尼伯，马尼托巴，R3E 3R2，加拿大

   Steven Theriault & Heinz Feldmann

5. 新泻大学医学院公共卫生系，日本新泻951-8510

   Hiroshi Suzuki

6. 仙台国立医院病毒研究中心临床研究部，仙台，983-8520，日本

   Hidekazu西村

7. 日本厚安医院儿科，日本川崎210-0852

   Mitamura Keiko和Sugaya Norio

8. 静冈大学应用生物化学系，日本静冈422-8529

   臼井太一和村田武美

9. 静冈大学生物化学系，药学学院和21世纪COE计划，矢田，静冈市，422-8526，日本

   铃木隆和铃木康夫

相应的作者

对应到喜田岛Kawaoka．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

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