文摘
以前,它已经表明,t淋巴球主要炎症细胞中发现吸烟者肺泡壁和它们的数量与肺气肿的程度。然而,这些细胞的表型没有定义。本研究的目的是描述不同t细胞表型和调查可能存在细胞凋亡在吸烟者的肺实质。
肺样本得到15例患者在手术从未吸过烟熏和六人。样本冷冻和准备组织学和采用考试。幻灯片是彩色的CD3 +、CD4 +、CD8 +、γδt细胞,CD56自然杀手((NK)细胞),和弹性蛋白酶(中性粒细胞)。Anti-CD95单克隆抗体和原位end-labelling技术被用来检测Fas表达和细胞凋亡。阳性染色细胞被表示为肺泡壁细胞·毫米−1、总细胞的百分比和Fas / APO和细胞凋亡指数。肺气肿是宏观上确定,显微镜下和报告作为礼物或缺席。所有受试者术前肺功能测试。
中性粒细胞是主要的细胞不吸烟者和吸烟者的肺实质没有肺气肿。在吸烟者肺气肿,CD3 +和CD8 +细胞主要在肺泡壁(p < 0.05)。γδ细胞增加在所有吸烟者并没有发现的NK细胞数量增加。t细胞数量·毫米肺泡壁−1显示双线性关系吸烟数量增加30包年的一个转折点−1(右2= 0.345;p < 0.01)。细胞凋亡在吸烟者表现出双线性关系数量大幅增加吸烟者吸烟与肺气肿(R2= 0.3613;p < 0.009)。
得出肺气肿的发病机制可能是由t淋巴球,主要CD8 +细胞溶解的t细胞,细胞凋亡的机制之一可能是肺破坏导致肺气肿的发展。如果是这种情况,它可以推测,t细胞对抗原刺激炎症反应源自肺癌和吸烟引起的。
部分支持卡斯特罗j.t纪念基金和加拿大医学研究理事会的卓越中心的“Inspiraplex”。j .主要由Barcelona-Quebec交换奖学金和加拿大肺脏协会奖学金。
吸烟引起的气管和肺实质炎症反应,由中性粒细胞和肺泡巨噬细胞1- - - - - -4,一直以来接受的气道异常的发展和肺气肿的主要原因,因此,慢性阻塞性肺疾病(COPD)在受到吸烟者。这一概念来源于发现增加的数量的巨噬细胞和中性粒细胞在支气管肺泡灌洗4- - - - - -6室,可能会也可能不会反映事件的肺实质。
很少有研究试图直接描述吸烟者肺泡壁的炎症,在COPD肺破坏的网站,因为安德森和Foraker7发现最早的肺气肿是肺泡壁的内细胞的变化。Eidelman等。8量化这内,发现一个直接联系肺气肿的程度和肺泡壁细胞数量的吸烟者,但肺气肿和中性粒细胞的数量成反比关系,这一发现表明,其他炎症细胞可能参与肺气肿的发病机制。这些发现后,芬克尔斯坦等。9报道,主要是淋巴细胞(CD3 +)的数量,在肺泡壁和肺泡巨噬细胞增加了吸烟者的肺,他们的数量与肺气肿的程度直接相关的。然而,这些淋巴细胞的表型没有定义。
最近的研究中,量化中吸烟者呼吸道的炎症和定义他们的表型,发现在场的主要炎性细胞CD8 + t细胞,他们的数量与气流限制的程度负相关10- - - - - -12。这些发现暗示可能的CD8 + t细胞的作用在COPD气道异常的发病机制。这是猜测,CD8 + t淋巴球也是主要的t细胞中发现吸烟者的肺实质与肺气肿。
本研究进行定义t细胞的表型在吸烟者的肺实质,这些信息是不可用的。因为对t细胞功能的一个重要的影响,尤其是CD8 +细胞溶解的,由穿孔素介导溶菌作用诱导细胞死亡,细胞凋亡,细胞凋亡蛋白酶活化或Fas-FasL配体接触,存在作为表达和凋亡细胞肺也是作为t细胞介导的细胞毒性的间接证据调查。
方法
21例患者接受开胸的本地化nonobstructing外围肺质量进行了研究。15是吸烟者和六从不吸烟。没有一个有哮喘或职业接触粉尘。
肺功能测试进行手术前根据美国国立卫生研究院的标准协议13。肺量测定法进行一个德国1070击球(医学图形公司、圣保罗、锰、美国),模块和肺容积测量人体体积描记仪。所有的值被表示为每分预测,基于莫里斯的预测公式等。14和高盛andBecklake15。
直接从手术室肺了。三到五组织楔形,∼4×4×1厘米,以随机方式选择,从每个肺被削减至少5厘米的肿瘤和膨胀cryoembedding材料(10月组织Tek实验室Inc . r .英里英里科学部门,内伯威尔市,,美国)使用注射器和针头,在液态氮冷冻,保存在−80°C到使用。手术标本(全肺或叶)检查宏观和肺活检微观肺气肿的存在和被划分,或没有,肺气肿根据出版的指南16。
从每个块,20 5微米厚的部分被削减时−20°C和固定在10%福尔马林7分钟。一节沾haematoxylin-eosin,其余19部分准备免疫细胞化学使用碱性磷酸酶- anti-alkaline phosphatase-method17和反沾mayer苏木精为1分钟。以下主要抗体(Carpenteria Dako公司、钙、美国)使用:CD3 (t淋巴球),CD4(辅助t淋巴球)CD8(细胞毒性t淋巴球)γδt淋巴球,CD56(自然杀伤(NK)细胞)和弹性蛋白酶(中性粒细胞)。抗体抗原反应了碱性磷酸酶- anti-alkaline phosphatase-complex和快速红(西格玛化工有限公司,密苏里州的圣路易斯,美国),导致鲜红的颜色。反应性淋巴结和脾脏样本用于积极控制。
为每个抗体2 nonconsecutive幻灯片/块量化两个方面,和结果表示为两张幻灯片的均值。在28个随机选择的字段(17-39)最少1000核·滑数,和积极的染色细胞细胞总数的百分数表示。因此在同一领域,肺泡壁的长度是数字化(5100年松下数码相机;松下通信工业有限公司、日本和Leitz则Dialux 20显微镜;Leitz则Weslar、德国)和细胞和阳性染色细胞的数量,或密切接触,肺泡壁。每张幻灯片10毫米的最低肺泡壁进行了研究(平均:21.35±5.37毫米幻灯片−1)。细胞被表示为数字·肺泡壁的mm−1。
Fas / APO-1表达式和intranucleosomal脱氧核糖核酸的碎片的检测原位end-labelling技术(ISEL)被用来量化Fas表达细胞和肺泡壁细胞发生凋亡,分别。细胞表达Fas / APO-1检测使用anti-CD95单克隆抗体(Novocasta实验室有限公司、纽卡斯尔、英国)和Dako-labelled streptavidin-biotin染色工具包(Dako公司)。简单,两张幻灯片/块在过氧化物酶阻断方案孵化,然后抗体anti-CD95 (Fas / APO-1)应用。孵化后,应用biotinlayed anti-immunoglobulins和链霉亲和素辣根过氧化物酶,下滑是发达与3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)获得明亮的黄褐色的颜色。冷冻淋巴结积极控制。细胞凋亡在组织部分进行了研究原位细胞凋亡检测kit-peroxidase (ApopTag®;美国马里兰州盖瑟斯堡Oncor Inc .,)后使用ISEL技术制造商的协议。简而言之,从冷冻块5毫米厚的部分被剪掉了,固定在10%福尔马林7分钟后,蘸乙醇乙酸2:1的幻灯片5分钟−20°C,内源性过氧化物酶活性与1%过氧化氢,甲醇就熄了20分钟。随后end-labelling Digoxigenin混合着末端转移酶(TdT)酶在2:1的比例进行调湿室在37°C 1 h和洗后磷酸缓冲盐(PBS) anti-digoxigenin,过氧化物酶应用和孵化湿润室在室温下30分钟。幻灯片与PBS然后冲洗3 3′-diamenobenzadine (DAB)(美国奥尔德里奇化工有限公司,密尔沃基,WI)申请6分钟作为显色底物。褐黑色污渍出现在网站的反应(图。1⇓)。连续两个部分为每个块染色,用数量来表示的意思是两张幻灯片。大鼠睾丸或胸腺被用于积极控制。
因为很少Fas表达细胞或细胞凋亡,这些参数并不表示为细胞·毫米腺胞壁−1;而不是所有的细胞染色阳性和Fas / APO-1 ApopTag®在每个幻灯片被量化。细胞的数量在每个幻灯片除以数字化滑动区和乘以滑动均值线性拦截(Lm)18作为修正不同数量的肺实质在每个特定的幻灯片。这个计算是表达了Fas和细胞凋亡指数。
细胞定量后,代码被揭露时,病人然后由吸烟史、和肺气肿的存在与否分成三组:1)非吸烟者没有肺气肿患者(6);2)吸烟者没有肺气肿患者(5);和3)吸烟者解剖肺气肿病人(10)有轻度到中度气流阻塞和恶性通货膨胀。
数据分析
用非参数统计软件包对数据进行分析。组数据表示为平均数±标准差。的双尾Wilcoxon测试是用于比较的意思。三组比较克鲁斯卡尔-沃利斯的测试使用。探索性数据分析(EDA)都使用了洛斯(局部加权平滑散点图)平滑方法在适当的时候19。洛斯是EDA的方法,可以利用适合本地最好的非参数的数据分析。曲线(或直线)因此安装可以建议一个数学模型(抛物线,双线性、指数、等。),然后可以进行测试与一般的线性方程。数据分析与s +(4.5版)计算机程序(数学软,西雅图,华盛顿,美国)。统计学意义的5%置信水平是接受。
结果
平均值为年龄、吸烟史和肺功能测试如表1所示⇓。六个病人从不吸烟,没有肺气肿。吸烟者,10有肺气肿和5没有肺气肿(宏观和微观)。所有组的年龄是相似的。一秒用力呼气量(FEV1)% pred低与肺气肿吸烟者比不吸烟者和吸烟者没有肺气肿(p < 0.05)。功能余气量% pred高与肺气肿吸烟者比不吸烟者和吸烟者没有肺气肿(p < 0.05)。
表2⇓显示了图像测量结果在吸烟者和不吸烟者和肺气肿。细胞的总数每毫米肺泡壁在所有组相似。炎症在不吸烟者和吸烟者,划分根据缺席或肺气肿,如图2所示⇓。不吸烟者有更多比CD4 + t细胞淋巴细胞和中性粒细胞数量超过CD8 + t细胞。吸烟者没有肺气肿的概要文件是类似于不吸烟者。吸烟者与肺气肿有不同的概要文件显著增加CD3 +和CD8 +细胞·毫米肺泡壁−1(p < 0.05)。percentells (NK)在所有组相似。
Fas / APO-1表达不到一半的肺部研究和组间没有差异。细胞凋亡存在于所有肺部研究,所有组的凋亡指数相似(表2⇑)。
图3⇓显示包·年之间的相关性−1烟熏和CD3 +细胞·毫米肺泡壁−1。洛斯平滑技术的相关性最好被描述作为一个双线性关系·30包年的拐点−1(右2= 0.345;p = 0.01),之后CD3 + t细胞数量增加,肺气肿是显而易见的。图4⇓表明,该模型同样适用于CD8 + (R2= 272;p = 0.03)和CD4 + (R2= 0.220;p = 0.051)。CD56 + t细胞之间没有相关性(NK)γδt细胞或肺泡壁弹性蛋白酶+细胞·毫米−1和包·年−1。
图5⇓表明,在不吸烟者,有显著相关性(r = 0.829;p < 0.05)之间的细胞总数·毫米肺泡壁−1(结构和炎症)和凋亡指数。在吸烟者,没有发现这样的关系(r =−0.29;p = ns),这可能意味着不同的细胞凋亡在不吸烟者比吸烟者。图6⇓显示细胞凋亡之间的关系指数和吸烟的剂量(包年−1)。细胞凋亡指数没有肺气肿的吸烟者减少意味着细胞凋亡指数的不吸烟者∼40包·年最低−1,然后显著增加,包年−1增加了吸烟者的肺气肿。这是最好的洛斯所描述的技术是一个双线性关系在40包·年一个拐点−1(右2= 0.3613;p = 0.009)。CD8 + t细胞数量和细胞凋亡指数与肺气肿与所有吸烟者r = 0.324 (ns)。与肺气肿exsmoker移除时,CD8 +的数量和apoptic指数之间的相关性成为重要的r = 0.642;p < 0.05。
Fas指数并没有与细胞或炎症细胞的总数不吸烟者。在吸烟者(有或没有肺气肿),Fas指数与CD3 + t细胞的数量每个肺泡壁·毫米−1(r = 0.675;p < 0.006),每个肺泡壁CD4 + t细胞(r = 0.564;p < 0.020),而不是与CD8 + t细胞的数量每个肺泡壁·毫米−1(r = 0.396;p = ns)。Fas指数并不是与吸烟的量(包年−1)。
讨论
因为芬克尔斯坦等。9描述的t细胞在吸烟者的肺,吸烟之间的关联,慢性阻塞性肺病,FEV1和t淋巴球浸润下呼吸道的吸烟者被描述10- - - - - -12,20.- - - - - -22,这表明t淋巴球在COPD的发病机制中发挥作用。此外,肺气肿的程度在吸烟者的数量与CD3 + t细胞在肺泡壁9,这一发现似乎涉及到早期肺气肿的发病机制。在目前的工作中,作者想进一步定义肺泡壁的t细胞的表型,这将提供哪些信息,以及如何,t细胞可能参与肺破坏的机理。发现早期表型都增加了吸烟者和肺气肿,CD8 + t细胞的一个优势,这增加了两相的剂量与吸烟的关系。也发现,细胞凋亡与肺气肿主动吸烟者一起抽烟量增加和CD8 + t细胞的数量在一定剂量的吸烟(40包·年达成−1)表明,细胞毒性可能在肺气肿的发病机制中发挥作用。
肺活检与cryoembedding尽可能膨胀材料(10月)注射肺结构允许一个好的图片而不是精确的形态测量学。因此,肺气肿的存在被小心的微观和宏观检查发现肺和微观部分,并表示现在或缺席16。肺泡长度测量,大小影响较小的差异向肺压力,表达细胞的数量每毫米肺泡壁8。炎症细胞的百分比,肺泡壁细胞总数的比例,显示出类似的结果,促进了信心的形态学研究结果。
人口的分离为不吸烟者和吸烟者,有或没有肺气肿,显示出不吸烟者的肺渗透主要由变量的中性粒细胞数量和t细胞CD4 + t细胞数量CD8 +细胞。吸烟者没有肺气肿有一个类似的模式与趋势不吸烟者更多的CD8 + t细胞和γδ。然而,当肺气肿发达,CD3 + t细胞数量的中性粒细胞和CD8 + t细胞数量明显大于不吸烟者和吸烟者没有肺气肿。γδ淋巴细胞的存在在吸烟者的肺没有被报道。这些t细胞主要是发现在肠道上皮表面的和少量的肺,但其功能尚不清楚。的工作假说γδt细胞的功能是识别抗原在主机和外部环境之间的边界启动免疫反应微生物或其他特定αβt细胞的抗原在招聘23- - - - - -25。
不同的炎症模式中发现吸烟者,有或没有肺气肿,可以解释为易感性的差异或吸烟的剂量效应。因此,吸烟的剂量效应在炎症反应的发展研究。目前的研究结果表明,一定数量的年的吸烟是必要的早期炎症反应之前,所有αβt细胞似乎参与,明显(无花果。3和4⇑⇑),这表明有一个剂量(包年−1前炎症发生肺气肿)阈值变得明显。此外,正如之前已被证明的,一旦出现淋巴细胞炎症(CD3 +) t细胞的数量在肺泡壁是吸烟者与肺气肿的严重程度相关9,表明因果关系。
目前发现的肺实质类似报告给我们等。11小航空公司的吸烟者,他们发现,吸烟者有或没有慢性阻塞性肺病,唯一的区别是一个吸烟者的CD8 + t细胞数量增加与慢性阻塞性肺病。类似的结果被O ' shaughnessy报道等。10在吸烟者的大型航空公司。因此,慢性阻塞性肺病只有吸烟者发展增加了数量的CD8 + t细胞在气道和肺实质,突显出这些细胞在疾病的发病机理中的作用。
进一步支持角色的CD8 + t细胞生产肺破坏迪亚兹在最近的一份报告中可以找到等。26显示病人感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)和大量的CD8 + t细胞在肺泡灌洗吸烟加速引起的肺气肿发病。
t淋巴球的作用导致一个特定的免疫疾病的嫌疑很大程度上是因为示范的t细胞病变的器官27。的功能活动CD4 +和CD8 + t细胞都是由特定抗原的结合提出了与主要组织相容性复合体(MHC)在目标细胞t细胞抗原受体。一旦激活,t细胞迁移到外围组织,肺在这种情况下,抗原的条目和持久性27- - - - - -29日。因此,数据邀请猜测,经过多年的持续的中性和肺泡巨噬细胞炎症二次吸烟,抗原物质产生或释放在肺最终导致激活,招聘和积累一些吸烟者的t细胞。CD8 + t细胞的能力产生肺损伤最近被恩尼罗等。29日。他们最终证明肺”自身抗原的识别CD8 + t细胞是足以产生肺损伤在缺乏刺激,如病毒感染,肺损伤介导或放大不抗原特异性的炎症细胞,单核细胞和巨噬细胞。
CD4 + t细胞的数量在肺部吸烟的吸烟者在∼30岁后显著增加的CD8 + t细胞,这表明CD4 + t细胞可能在炎症过程中的作用。CD4 + t细胞需要帮助CD8 +细胞毒性t细胞反应的启动维护他们的记忆,并保证其生存,这表明,即使是低CD4 + t细胞的数量可能是必不可少的CD8 + t细胞炎症的发展渗透在吸烟者中找到30.。
CD8 + t细胞的数量的增加在吸烟与慢性阻塞性肺病表明这些细胞被激活。大多数CD8 + t细胞precytolytic时,成为细胞溶解的识别类MHC相关肽在专业的抗原递呈细胞”25,27。因为细胞凋亡的一个重要结果的效应细胞溶解的CD8 + t细胞的功能,随着靶细胞坏死,促进非特异性细胞炎症反应27,29日,在肺气肿研究细胞凋亡的存在的间接证据CD8 + t细胞的细胞溶解。只有一小部分肺显示凋亡细胞。然而,可视化的小百分比的凋亡细胞生物学意义重大,因为凋亡细胞迅速通过巨噬细胞和树突细胞31日。因此,在肺气肿等慢性疾病进展缓慢,少量的凋亡细胞可能代表一个重要的组织破坏。
细胞凋亡是明显不吸烟肺,这一发现与先前的报告32没有发现细胞凋亡在正常或cigarette-exposed人类肺部。凋亡指数在吸烟者和不吸烟者往往高于肺气肿和总细胞数显著相关·毫米肺泡壁−1在不吸烟者(r = 0.829;p < 0.05)。图5⇑表明,有一个大的变化在肺泡壁细胞的总数不吸烟者,因为肺结构细胞的数量(肺泡I型和II和内皮细胞)是相当恒定的33,细胞不吸烟者的数量变化可能是由不同数量的炎症细胞,和细胞凋亡可能代表未激活的炎症细胞的稳态流动。相比之下,(图5所示⇑在吸烟者有或没有肺气肿,之间不存在相关性炎症细胞的总数和细胞凋亡(r =−0.29;ns)表明不同细胞发生细胞凋亡在不吸烟者和吸烟者。在最近的一份报告中,笠原等。34也报道了细胞凋亡存在于吸烟者的肺,但不吸烟者可能会有吸烟者一样高的凋亡细胞的数量。需要进一步的调查,以更好地阐明这个复杂的现象在吸烟者和不吸烟者的肺。
细胞凋亡在吸烟者吸烟相关剂量时双线性趋势。在吸烟者没有肺气肿,细胞凋亡指数从非吸烟者减少值,随着吸烟剂量的增加(图6所示⇑),可能表明抗细胞凋亡的发展由于炎症细胞的活化吸烟35。中性粒细胞似乎成为interleukin-8,抗细胞凋亡的细胞因子大量出现在吸烟者的肺36。同样,t细胞的凋亡变化与激活这些细胞的状态。“忽视”的幼稚t细胞死亡的凋亡27,但在激活的初始阶段,t细胞产生抗药性凋亡为了维持免疫反应35。赞成这种可能性是Fas的行为指数通常增加抗原刺激后准备潜在的t细胞凋亡来控制自身免疫35,37。在吸烟者,CD3 +数字之间的显著相关性和Fas指数可能表明,这些细胞被激活27,35。
吸烟者与肺气肿、细胞凋亡和CD8 + t细胞增加吸烟数量增加,表明免疫反应的控制不成功(t细胞并没有被淘汰),淋巴细胞,主要是CD8 +、扩散和细胞发生细胞凋亡的数量增加。细胞发生凋亡并不确定;然而,最近的一些报告34,38,39已经确定的结构细胞发生细胞凋亡数量增加气性肺,支持这个想法,CD8 + t细胞诱导凋亡的结构细胞在肺气肿。之间的显著相关性的CD8 + t细胞数量和细胞凋亡在主动吸烟者会赞成这种可能性。识别的CD8 + t细胞表达穿孔素和Fas配体在肺部这个假设将增加力量25。
CD8 + t细胞在气肿的肺部炎症,以前的工作描述中的t细胞数量之间的显著相关性肺泡壁和肺气肿的程度和丰富的文学描述的CD8 + t细胞浸润吸烟与慢性阻塞性肺病的航空公司,强调了潜在的t细胞在COPD的发病机制中的作用。然而,t细胞在肺部疾病的发病机制中的作用可能在吸烟者不应该排除传统的中性粒细胞和巨噬细胞的作用与COPD的发病机制有关。此外,这些细胞的参与很可能是必不可少的。在作者看来,以下投机性的解释将链接中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞在COPD的发病机制。研究者还认为,吸烟将促进一个初始的中性粒细胞和巨噬细胞炎症,通过不同的机制(蛋白酶、氧化、等。)可能会损害肺细胞和降解间质(弹性蛋白、胶原蛋白、proteoglyeans等。)。肺损伤可能导致结构性变化自体抗原产生部分可交叉反应的neo-antigens,和解剖学上的释放被扣押的抗原27,29日,40可以被autoreactive诱导t细胞活化和增殖。通过他们的效应功能,激活和possibleCD4 + CD8 + t细胞可能会损害肺进一步通过促进炎症细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)27,29日;直接杀死靶细胞穿孔素诱导坏死或穿孔素Fas-Fas诱导细胞凋亡25,40生产组织破坏和改造,并最终出现在慢性阻塞性肺病。
如果t细胞,单独或连同其他炎性细胞,负责肺损伤和慢性阻塞性肺疾病的进展,这将作为响应一个抗原刺激源自肺癌和吸烟引起的。如果是这样,慢性阻塞性肺疾病可以被认为是一种自身免疫性疾病由吸烟引起的。
确认
作者感谢j·霍格和p .削减提供的一些情况下,k .惠塔克的技术援助和c . Di人工秘书的帮助。
- 收到了2000年7月3日。
- 接受2000年12月12日。
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