文摘gydF4y2Ba
背景gydF4y2BaNitrative压力特征的人类肺动脉高血压的病理。然而,nitrative压力的作用在闭塞的血管重塑的发病机制和严重的肺动脉高血压基本上仍不清楚。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba我们最近发现小说小鼠模型(gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba,Egln1gydF4y2Ba编码prolyl羟化酶2 (PHD2))闭塞的血管重塑和右心衰,成为一个优秀的模型用在这项研究检查nitrative压力在闭塞的血管重塑的作用。gydF4y2Ba
结果gydF4y2BaNitrative压力明显升高而内皮caveolin-1 (Cav1)表达被抑制在肺部gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠。治疗一种超氧化物歧化酶模拟物,锰(III) tetrakis五氯化(1-methyl-4-pyridyl)卟啉或内皮gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba击倒使用内皮cell-targeted纳米交付CRISPR-Cas9 /指导RNA质粒DNA抑制闭塞的肺血管重塑和衰减严重的肺动脉高压gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠。Cav1表达的基因修复gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠正常化nitrative压力,降低肺动脉高压和提高心脏功能。gydF4y2Ba
结论gydF4y2BaCav1表达这些数据表明,抑制二次缺PHD2增强nitrative压力通过内皮一氧化氮合酶的激活,导致闭塞的血管重塑和严重的肺动脉高压。因此,反应性氧/氮物种拾荒者可能有治疗潜力的抑制闭塞的血管重塑和严重的肺动脉高血压。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
内皮PHD2缺乏降低caveolin-1表达导致增强nitrative压力,导致闭塞的肺血管重塑和严重的肺动脉高压gydF4y2Bahttps://bit.ly/3yw48zmgydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
肺动脉高压(PAH)是一种破坏性疾病的特点是持续增加的肺血管阻力和阻塞性肺血管重塑,导致右侧心脏衰竭和过早死亡gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。多环芳烃的组织病理学特征从不同的目的:包括增加血管壁厚度、血管纤维化、增强氧化/ nitrative压力、微血管阻塞和复杂的网状病变(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。鉴于闭塞的肺血管重塑的分子机制并不完全了解,当前PAH疗法主要目标血管收缩,几乎没有对血管重塑的影响,也无法有效地治愈疾病和促进生存(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
有越来越多的证据的氧化和/或nitrative压力在特发性肺动脉高压患者的肺部(IPAH)。黄嘌呤氧化酶活动参与的生成过氧化物阴离子(活性氧(ROS))明显增加IPAH肺(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),导致慢性低氧诱导肺动脉高压(PH) [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。NADPH氧化酶类,包括Nox1 Nox2 Nox4,也产生高水平的ROS,也参与发展的PH值(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。染色8-hydroxyguanosine(造成的氧化损伤的生物指标超氧化物的反应与鸟嘌呤)是著名的内皮细胞(ECs)的丛状的病灶内IPAH患者(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。相比之下,抗氧化剂如锰超氧化物歧化酶的活性(MnSOD),线粒体的抗氧化剂酶编码的关键gydF4y2BaSOD2gydF4y2Ba基因,是低IPAH肺(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。过度生产的一氧化氮(NO)、超氧化物导致形成毁灭性的活性氮物种(RNS)过氧亚硝基gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。高浓度的过氧亚硝基(gydF4y2Ba即。gydF4y2Banitrative压力)是有害的,可能引起细胞损伤和死亡的肺血管细胞,包括ECs和平滑肌细胞(smc) [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。此外,过氧亚硝基修改酪氨酸残基,导致蛋白质酪氨酸硝化(3-nitrotyrosine形成),因此修改功能(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。过氧亚硝基水平升高在IPAH患者的肺gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),部分原因是由于组织缺氧和炎症(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。免疫组织化学染色显示无处不在3-nitrotyrosine和显著增加的水平(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。我们以前的研究表明,caveolin-1 (Cav1)不足导致内皮一氧化氮合酶(以挪士)激活和没有水平显著增加,以及增强超氧化物的生产,形成过氧硝酸盐导致肺血管突出nitrative压力(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。nitrative合成增加的压力会导致蛋白激酶G (PKG)酪氨酸硝化,削弱其激酶活性,导致增强血管收缩和血管重塑,因此PH值gydF4y2BaPrkg1gydF4y2Ba−/gydF4y2Ba−gydF4y2Ba老鼠(gydF4y2BaPrkggydF4y2Ba编码PKG) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。PKG酪氨酸硝化明显增加IPAH患者的肺(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
我们最近报道一个新的小鼠模型严重的PH值(gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba介导的中断gydF4y2BaEgln1gydF4y2Ba、编码低氧诱导因子(HIF) prolyl羟化酶2 (PHD2),指定为gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba(CKO))与进步的闭塞的血管重塑包括血管闭塞,plexiform-like病变和右心衰临床PAH概括许多特性包括IPAH [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。然而,未知是否氧化/ nitrative压力也增强和参与酸碱在这个严重的发病机制模型。在目前的研究中,我们首次证明内皮PHD2不足引发广泛的氧化/ nitrative压力gydF4y2Ba通过gydF4y2Badownregulation HIF-2α-dependent内皮Cav1表达的方式。活性氧清除剂治疗,基因EC-specific中断gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba或恢复Cav1表达明显减少nitrative压力和PH值减毒活疫苗CKO老鼠。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
动物模型gydF4y2Ba
所有在本研究中使用的小鼠C57BL / 6 j背景。gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba(CKO)和gydF4y2BaHif2agydF4y2Ba/gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba(EH2)老鼠产生如前所述gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba老鼠从威廉Sessa博士的实验室(美国耶鲁大学纽黑文,CT) (gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。CKO老鼠繁殖gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba小鼠产生gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba/gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba(CKO / Tg)gydF4y2BaEgln1gydF4y2Ba/ fgydF4y2Ba/gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba(Tg)老鼠。男性和女性gydF4y2BaEgln1gydF4y2Ba/ fgydF4y2Ba(指定为野生型(WT))gydF4y2Ba,gydF4y2BaCKO, CKO / Tg和Tg同窝出生5岁周3.5个月被用于这些研究。对活性氧清除剂治疗,男性和女性CKO小鼠5岁周服用锰(III) tetrakis五氯化(1-methyl-4-pyridyl)卟啉(MnTMPyP)(5毫克公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba腹腔内每日9周。PBS是用作控制。同一个PBS组是用于我们的以前的出版物gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。综述了动物保健和研究协议和批准的机构动物保健和使用委员会西北大学Feinberg医学院和亚利桑那大学。gydF4y2Ba
超声心动图gydF4y2Ba
超声心动图进行核心设施在西北大学Feinberg医学院和亚利桑那大学如前所述gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。经胸廓的超声心动图进行VisualSonics Vevo 2100或3100超声波机(富士胶片VisualSonics Inc .)使用一个MS550D (40 MHz)传感器。右心室(RV)壁厚在心脏舒张期得到从胸骨旁的短轴视图使用M-mode乳头肌水平。RV横截面积得到从胸骨旁的短轴视图在乳头状肌级别使用b型。肺动脉(PA)加速时间和爸爸射血时间得到从胸骨旁的短轴视图使用脉冲多普勒模式在主动脉瓣级别。左心室(LV)部分缩短及心输出量从胸骨旁的短轴获得使用M-mode视图。gydF4y2Ba
血液动力学的测量gydF4y2Ba
测量右心室收缩压(RVSP),老鼠犀牛与氯胺酮和甲苯噻嗪鸡尾酒。1.4 F压力传感器导管(米勒仪器)是通过正确的颈静脉插入房车。RVSP被AcqKnowledge记录和分析软件(Biopac系统公司)如前所述gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
EC隔离gydF4y2Ba
小鼠肺组织和PBS去除血液灌注。组织被切碎的孵化和胶原酶(1.0 mg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在哈佛商学院,罗氏公司)在摇晃在37°C水浴45分钟,然后被gentleMACS分散分离器(Miltenyi研究),其次是通过40μm细胞过滤器过滤。细胞培养与anti-mouse CD31抗体(BD生物科学,猫# 550274,1.5μg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)对冰1 h,其次是孵化与羊anti-rat免疫球蛋白Dynabeads m - 450(表达载体,猫# 11035,50μL) 30分钟。Bead-bound ECs (CD31gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞)磁性和细胞溶解蛋白质推倒隔离(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
组织学评估gydF4y2Ba
小鼠肺组织灌注了PBS,用10%福尔马林固定gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba在恒压(15而言不啻气管滴注法gydF4y2Ba2gydF4y2BaO)和嵌入在石蜡。肺癌部分是沾Russell-Movat pentachrome染色工具包(美国MasterTech)根据制造商的协议。为评估考评的壁厚,不是从40×20放大图像被图像量化j .壁厚计算的内墙和外墙之间的距离除以外墙之间的距离和内腔的中心gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
Immunofluorescent染色gydF4y2Ba
小鼠肺组织灌注了PBS,膨胀50%最佳切削温度(10月)化合物在PBS和嵌入式cryosectioning 10月。immunofluorescent染色Cav1和α-nitrotyrosine (NT) [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba(5)、肺部分μm)固定用4%多聚甲醛和屏蔽0.1% Triton x - 100和5%正常山羊血清在室温下1 h。三洗后用PBS、幻灯片和anti-Cav1孵化(圣克鲁斯生物技术、猫# sc - 894, 1:10 0), anti-NT(微孔,猫# 05 - 233,施用),anti-CD31抗体(BD生物科学,猫# 550274,1:25),anti-α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA) (Abcam,猫# Ab5694施用)anti-CD45 (BioLegend,猫# 103101,1:10 0)或anti-periostin (Abcam,猫# 14041,1:10 0)在4°C过夜然后用Alexa孵化594 -共轭anti-mouse免疫球蛋白,Alexa 488 -共轭或647 -共轭anti-rat或anti-rabbit免疫球蛋白(生命技术)在室温下1 h。核与DAPI复染色中延长黄金安装媒体(生命技术)。gydF4y2Ba
肺部分formalin-fixed鼠标样本de-waxed和脱水,紧随其后的是沸腾在10更易·LgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba柠檬酸钠(pH值6.0)为抗原检索10分钟。幻灯片是孵化anti-α-SMA (Abcam猫# ab5694,施用)在4°C隔夜紧随其后Alexa 594 -共轭或488 -共轭anti-rabbit免疫球蛋白在室温下1 h。核与DAPI复染色。图片使用蔡司共焦显微镜拍摄LSM880和瓷砖扫描×20放大。α-SMAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba船只被量化每肺(40字段gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
RNA分离和定量逆转录酶聚合酶链反应分析gydF4y2Ba
一个叶的肺组织被TissueLyser单一化(试剂盒)试剂盒(生命技术)的解决方案。RNA分离苯酚:氯仿,紧随其后的是清理与试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒)。高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)被用来抄写1μg RNA的互补。定量逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)分析ABI ViiA 7实时PCR系统(应用生物系统公司)由于“快速上手”项目SYBR绿色主设备(罗氏应用科学)。目标mRNA表达决心使用比较循环阈值的相对定量方法。还有作为一个内部控制。信息还有鼠标Cav1和引物被描述之前(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba];鼠标Nos3引物5′-AGGCAATCTTCGTTCAGCCA-3′, 5′-TAGCCCGCATAGCGTATCAG-3′。gydF4y2Ba
免疫沉淀反应和免疫印迹gydF4y2Ba
肺组织收集从3.5月大小鼠均化。500µg溶解产物/鼠标然后用anti-PKG抗体(免疫沉淀反应gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)和蛋白质conjugated-Sepharose珠子和涂抹anti-NT抗体(微孔,猫# 05 - 233,1:20 00)。相同的膜还与anti-PKG涂抹抗体(细胞信号技术,猫# 13511年代,1:1000)作为加载控制。其他免疫印迹分析进行使用anti-Cav1(圣克鲁斯生物技术、猫# sc - 894或sc - 53564, 1:20 00), anti-NT(微孔,猫# 05 - 233,1:20 00)或anti-eNOS (BD生物科学,猫# 610297,1:1000)。Anti-β-actin(σ,猫# A2228 1:10 000)被用作加载控制。gydF4y2Ba
测量ROS / RNS的水平gydF4y2Ba
肺组织血液灌注自由PBS,紧随其后的是左叶的集合。50毫克的肺组织在PBS冰上单一化。组织匀浆旋转10 000人gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在4°C。50µL匀浆被用于确定组织ROS水平/ RNS (OxiSelect体外ROS / RNS试验装备,猫# sta - 347 t)根据制造商的指导。2′,7′-dichlorodihydrofluorescein (DCF)样品测定fluorometrically对DCF标准荧光板读者(TECAN无限200 Pro)。匀浆中的自由基含量是决定根据DCF标准曲线。相对贴现值正常化的平均值WT组。gydF4y2Ba
纳米颗粒的交付CRISPR EC-targeted击倒的质粒DNAgydF4y2BaNos3gydF4y2Ba在成年老鼠gydF4y2Ba
诱导基因组编辑和击倒gydF4y2BaNos3gydF4y2BaECs,质粒DNA表达CRISPR-Cas9的控制下gydF4y2BaCDH5gydF4y2Ba启动子和两个鼠标gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba特殊技能指导rna (gRNAs)驱动的gydF4y2BaU6gydF4y2Ba启动子是交付给gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠的聚(lactic-co-glycolic酸)(PLGA)的纳米颗粒(Mountview疗法LLC)如前所述gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。简单地说,两个gRNA序列的起始密码子ATG的下游gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba基因编码的n端1/3以挪士设计手动(Genscript程序未能识别的gRNAs在这个地区),和单一互补DNA寡核苷酸gRNA序列对应商业合成DNA技术(集成)。顺序寡核苷酸被磷酸化、退火和克隆到质粒pgydF4y2BaSpgydF4y2BaCas9-2U6-GFP包含两个gydF4y2BaU6gydF4y2Ba启动子。阳性克隆经DNA测序。EC-specific基因组编辑的gydF4y2BaCAGgydF4y2Ba启动子是人类所取代gydF4y2BaCDH5gydF4y2Ba启动子(CRISPRgydF4y2BaCDH5gydF4y2Ba)。老鼠的DNA序列gRNAs对应gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba5′-TCAGCCTATTGGCTGACGAG-3′(反向寡核苷酸5′-CTCGTCAGCCAATAGGCTGA-3′)和5′-GGATCTGATTGCTTCAGTCA-3′(反向寡核苷酸5′-TGACTGAAGCAATCAGATCC-3′)。gydF4y2Ba
交付CRISPRgydF4y2BaCDH5gydF4y2Ba质粒DNA在成年老鼠制造商的指令后,PLGA-based纳米颗粒与质粒DNA混合,室温下孵化了10分钟。混合物被管理retro-orbitally CKO老鼠在7周的年龄(25μg质粒DNA /鼠标)又在8和9周的年龄(总三注射因为这些gRNAs不是有效的)。纳米颗粒的混合物:控制质粒DNA表达随机RNA寡核苷酸是作为一个单独的控制管理的老鼠。老鼠被安置到3.5个月岁血液动力学的测量和组织收集。gydF4y2Ba
基因组编辑效率测定小鼠肺ECsgydF4y2Ba
刚从老鼠肺部孤立ECs与蛋白酶K消化过夜。离心后的上层清液收集在000gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟并提取苯酚:氯仿混合乙醇沉淀分离基因组DNA紧随其后。SYBR Green-based定量PCR分析的基因组DNA进行了定量工作室6-Flex实时PCR系统(应用生物系统;SYBR绿色从罗氏应用科学)来确定基因组indel效率如前所述gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。正向和反向引物的序列5′-CACGTACTCAGAGAGCCTCAA-3′, 5′-AATCCTCAGCCTATTGGCTGAC-3′。的引物序列控制gydF4y2BaNme1gydF4y2Ba基因5′-CCCCTTCTTTACTGGCCTGG-3′, 5′-GCTATCCCACCAGCCTGTTT-3′正常化。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
统计学意义是由图基单向方差分析gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba分析计算假定值修正为多个比较。两群比较被未配对的双尾t检验分析。p < 0.05表示存在统计上的显著差异。所有酒吧图表中的数据均值±gydF4y2BasdgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
突出nitrative压力gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba鼠肺和肺血管ECsgydF4y2Ba
鉴于nitrative应力的特征的病理临床PAH,我们测试是否nitrative压力也是著名的肺gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba(CKO)老鼠。总自由基水平的量化OxiSelect体外ROS / RNS试验装备的肺匀浆显示CKO肺部表现出明显升高活性氧/ RNS水平(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。免疫印迹了NT水平显著增加,表明nitrative压力,CKO鼠肺(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Bac)。然后我们一起执行NT疣状标记对ECs (CD31),炎症细胞(CD45)、成纤维细胞(periostin)和smc(α-SMA)来确定哪些类型的细胞是NTgydF4y2Ba+gydF4y2BaCKO的肺细胞。我们的数据显示,NT是肺血管ECs和CD45高度表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba炎症细胞,在肺血管smc和periostin表达相对较低gydF4y2Ba+gydF4y2Ba成纤维细胞(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba、e和gydF4y2Ba补充图S1a, bgydF4y2Ba)。我们以前的研究表明,nitration-dependent PKG PH值活动参与发展的障碍(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。进一步确定PHD2不足也会影响包裹硝化,我们执行一个免疫沉淀反应测定使用anti-PKG抗体和涂抹anti-NT抗体。数据显示包裹硝化CKO老鼠的肺明显增加(gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba)。在一起,这些数据表明nitrative应力明显增强肺血管病变CKO老鼠。gydF4y2Ba
活性氧清除剂治疗抑制闭塞的血管重塑和减毒的PH值gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba
我们下决定是否消耗的ROS / RNS CKO老鼠PH值的影响发展。5-week-old CKO小鼠建立PH表型治疗腹腔内ROS /过氧亚硝基清道夫MnTMPyP,从而打乱过氧化物,从而形成过氧亚硝基(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),9周。MnTMPyP治疗显著降低了NT水平CKO小鼠的肺血管和肺(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。血液动力学的测量表明,RVSP减少到∼50毫米汞柱MnTMPyP-treated CKO的老鼠相比,接受pbs∼77 mmHg CKO老鼠(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。房车肥大,由RV的重量比gydF4y2Ba与gydF4y2Ba左心室+隔(LV + S)也减毒MnTMPyP-treated CKO老鼠(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。肺癌病理检查也显示抑制血管闭塞改造,就是减少neointima形成(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba),减少PA的远端肺血管壁厚和muscularisation MnTMPyP-treated CKO的老鼠相比,接受pbs老鼠(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba- g)。这些数据显示的参与氧化/ nitrative应力发展的严重的PH值CKO老鼠。gydF4y2Ba
Nos3gydF4y2Ba击倒在ECs nitrative压力降低,血管重塑和严重的PH值gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba
过氧亚硝基是由没有和过氧化物之间的反应。确定没有调和nitrative CKO老鼠、压力和PH值发展我们对待CKO老鼠pan-inhibitor (gydF4y2BaNgydF4y2BaGgydF4y2Ba硝基-gydF4y2BalgydF4y2Ba精氨酸甲酯(gydF4y2BalgydF4y2Ba- name)的饮用水中没有合成酶(1毫克·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba);然而,所有七CKO老鼠死后一周内(数据未显示),这表明没有维护血管内稳态的生物利用度是至关重要的这严重的PH值模型。gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba但无论是(编码以挪士)gydF4y2BaNos1gydF4y2Ba也不gydF4y2BaNos2gydF4y2Ba在CKO调节肺(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba),gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba正常的肺gydF4y2BaEgln1gydF4y2Ba和gydF4y2BaHif2agydF4y2Ba双基因敲除小鼠(gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba/ Hif2agydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba(EH2)),这表明以挪士介导nitrative压力CKO老鼠。研究这个问题,我们利用纳米交付CRISPR-Cas9质粒DNA (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba表达Cas9)的控制下gydF4y2BaCDH5gydF4y2Ba启动子和gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba特殊技能gRNAs驱动的gydF4y2BaU6gydF4y2Ba子特别击倒gydF4y2BaNos3gydF4y2BaECs CKO老鼠(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。我们观察到∼30%基因组编辑效率的肺ECsgydF4y2BaNos3gydF4y2BagRNA质粒DNA-treated CKO老鼠(gydF4y2Ba补充图S4gydF4y2Ba),减少以挪士蛋白表达(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。疣状还显示减少以挪士表达与控制老鼠相比,这些小鼠的肺ECs (gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba),展示成功击倒gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba在CKO肺ECs。因此,NT水平也显著降低肺ECsgydF4y2BaNos3gydF4y2BagRNA质粒DNA-treated CKO老鼠(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba,e),血液动力学的测量显示gydF4y2BaNos3gydF4y2BaECs显著降低RVSP击倒,RV / (LV + S)比在这些CKO老鼠(gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Bag),肺血管重塑评估gydF4y2Ba通过gydF4y2BaPA壁厚(gydF4y2Ba图3 hgydF4y2Ba我),远端肺血管muscularisation (gydF4y2Ba图3 jgydF4y2Ba,k)在这些老鼠也明显减弱。此外,所有5个gydF4y2BaNos3gydF4y2BagRNA质粒DNA-treated老鼠幸存下来,而同期控制CKO小鼠死亡率50%。这些数据表明,以挪士是nitrative压力的主要来源,导致发展的闭塞的改造和严重的PH值在CKO老鼠。gydF4y2Ba
减少表达内皮Cav1次要PHD2缺乏HIF-2α-dependent的方式gydF4y2Ba
缺Cav1激活以挪士和ROS增加/ RNS生产,导致nitrative压力,你修改包裹通过酪氨酸硝化和损害其激酶活性,导致PH值(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。找出是否失调Cav1信号参与nitrative压力和PH值的生成发展CKO老鼠,我们首先检查Cav1的表达水平CKO小鼠的肺。所示gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba,gydF4y2BaCav1gydF4y2BamRNA水平明显降低肺CKO的老鼠相比,那些在年龄相仿WT老鼠。CKO HIF-2α删除(EH2)小鼠恢复gydF4y2BaCav1gydF4y2Ba信使rna表达(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。西方墨点法CKO的肺还演示了Cav1蛋白质水平降低,在EH2逆转小鼠和事实上增加EH2 WT相比,小鼠的肺肺(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Bac)。通过执行immunofluorescent染色,我们发现Cav1 co-stained CD31gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba即。gydF4y2BaECs) WT小鼠的肺血管而减少在肺血管病变在肺血管ECs CKO老鼠和恢复EH2老鼠(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba),这表明内皮Cav1减少PHD2缺乏依赖HIF-2α激活gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠。gydF4y2Ba
恢复Cav1表达抑制nitrative压力gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba/gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba
是否缺Cav1负责nitrative压力的增大gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba以挪士激活和PH值的病机CKO老鼠,我们生成一个与Cav1转基因小鼠模型表达式preproET-1启动子的控制CKO小鼠的遗传背景(gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba/gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba(CKO / Tg)) (gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。免疫印迹和免疫染色表明,减少Cav1表达式中看到CKO鼠标CKO / Tg小鼠肺恢复(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Bac)。恢复Cav1表达CKO老鼠大幅减少活性氧的水平/ RNS CKO / Tg小鼠的肺相比CKO老鼠(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。NT水平的进一步检查gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba免疫印迹和免疫染色表明NT水平被抑制在肺和肺血管ECs CKO / Tg的老鼠相比,CKO老鼠(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Bac)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba表明Cav1缺乏负责增加氧化/ nitrative压力CKO老鼠肺部。gydF4y2Ba
Cav1转基因表达减弱PH值出现gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba
我们下决定如果Cav1转基因表达CKO老鼠将救援高血压肺表型。血液动力学的测量显示的部分减少RVSP CKO / Tg CKO的老鼠相比,3.5个月岁(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。房车肥大也减毒CKO / Tg老鼠(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba)。病理检查显示,CKO / Tg小鼠减少肺血管重塑,包括减少neointima和闭塞的病变(gydF4y2Ba图7 cgydF4y2Ba)、PA壁厚(gydF4y2Ba图7 dgydF4y2Ba)和远端肺血管相比muscularisation CKO老鼠(gydF4y2Ba图7 egydF4y2Baf)。gydF4y2Ba
Cav1转基因表达正常化房车和PA功能gydF4y2BaEgln1gydF4y2BaTie2CregydF4y2Ba/gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba老鼠gydF4y2Ba
我们下一个评估是否Cav1转基因表达抑制对CKO小鼠心脏功能障碍。超声心动图显示CKO / Tg小鼠显著降低房车壁厚相比,CKO老鼠(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba- c)。CKO / Tg老鼠也表现出显著的改进RV房车收缩性评估的分数面积变化(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充视频S1和S2gydF4y2Ba)。然而,我们没有观察到显著改变心率、心输出量或LV部分缩短CKO / Tg小鼠相比,CKO老鼠(gydF4y2Ba补充图S5a-cgydF4y2Ba)。CKO / Tg小鼠表现出改善PA功能,评估PA加速度时间/射血时间比例,相比CKO老鼠(gydF4y2Ba图8 egydF4y2Ba)。这些数据表明Cav1转基因表达部分但明显救助有缺陷的PA和房车功能在CKO老鼠。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
目前的研究表明,nitrative压力在肺部明显增强,尤其是在血管病变CKO的老鼠,概括的病理特征的临床多环芳烃。nitrative压力的增加是由于内皮Cav1不足和以挪士激活。Cav1转基因表达CKO / Tg小鼠减少nitrative压力和减毒的PH值,减少RVSP,肺血管重塑和房车肥大以及改善房车和PA的功能。两种药物清除ROS / RNS和基因内皮Nos3击倒gydF4y2Ba通过gydF4y2BaEC-targeted纳米交付CRISPR-Cas9技术在成年老鼠nitrative减少压力和显著降低肺血管重塑的严重性和PH值在CKO老鼠。这些发现表明,恢复Cav1表达式和ROS / RNS清除代表潜在的治疗策略用于治疗严重的多环芳烃,其中包括IPAH (gydF4y2Ba图8 fgydF4y2Ba)。临床相关性验证了我们之前的观察,PHD2表达减弱肺血管闭塞的ECs IPAH患者(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
著名的氧化/ nitrative压力是临床的病理特征多环芳烃(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。我们最新研究首次显示,CKO小鼠自发发展严重的PH值与闭塞的肺血管重塑,包括血管闭塞病变,plexiform-like病变的形成,标志着海拔RVSP从70 - 100毫米汞柱以及右心衰的发展(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。这里我们可以看出一个很明显的增加活性氧/ RNS CKO老鼠肺部和突出anti-NT染色表明广泛nitrative压力在肺血管病变,特别是ECs和炎症细胞。这项研究提供了进一步的证据,CKO老鼠是一个优秀的人类PAH的小鼠模型。此外,与活性氧清除剂治疗的老鼠MnTMPyP抑制闭塞的肺血管重塑和减毒的PH值、证明的致病作用氧化/ nitrative压力的严重性的PH值。gydF4y2Ba
Nitrative压力是由过多的过氧化物,不,该化学反应形成过氧硝酸盐。我们发现的表达gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba但无论是gydF4y2BaNos1gydF4y2Ba也不gydF4y2BaNos2gydF4y2Ba在CKO肺明显增加。专门抑制过氧亚硝基形成,我们采用EC-targeted纳米交付CRISPR质粒DNA技术选择性地破坏gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba表达在成年小鼠CKO ECs,导致减少nitrative压力CKO的肺,特别是肺血管ECs。这些数据表明,ECs nitrative压力的主要来源gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba以挪士表达和激活次要PHD2缺乏CKO肺。鉴于过氧硝酸盐比没有更加稳定和扩散,EC-derived nitrative应力很容易扩散到其他细胞病变,如肺血管smc、成纤维细胞和促炎细胞渗透。因此,EC-specificgydF4y2BaNos3gydF4y2Ba降价会导致减少nitrative应力不仅ECs而且在整个肺。此外,EC-derived过氧亚硝基扩散到肺血管smc和诱发酪氨酸硝化的包裹用smc表示,损害其激酶活性,导致肺血管重塑和PH值的发展。一直,我们观察到减少RVSP、肺血管重塑和房车在内皮营养不良gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba中断CKO老鼠。在一起,这些数据提供了明确的证据表明nitrative压力来源于内皮功能障碍导致闭塞的肺血管重塑和严重的PH值的发展。gydF4y2Ba
先前的研究显示减少的gydF4y2BaCAV1gydF4y2Ba信使rna和蛋白质水平肺ECs的PAH患者(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。Cav1缺陷也很明显的动脉病变PH老鼠,包括Sugen5416 /低氧诱导酸碱和monocrotaline-induced模型(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。我们之前的研究提供了第一个遗传证据表明Cav1缺陷诱发小鼠的PH值(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。最近的一项研究表明,缺Cav1 ECs促进更严重的PH值在应对缺氧gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。一致地,gydF4y2BaCAV1gydF4y2Ba变异与遗传有关PAH患者(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。综合来看,这些研究提供了清晰的证据CAV1博士的发病机制不足我们其他的研究表明,基因缺失gydF4y2BaCav1gydF4y2Ba和gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba或治疗的gydF4y2BaCav1gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠没有合酶抑制剂gydF4y2BalgydF4y2Ba- name或ROS / RNS清道夫MnTMPyP抑制的PH值gydF4y2BaCav1gydF4y2Ba−/gydF4y2Ba−gydF4y2Ba老鼠,这表明慢性激活以挪士次要Cav1 Cav1不足引起的缺陷是PH值的机制(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。其他人也表明gydF4y2BalgydF4y2Ba- name治疗抑制PH值gydF4y2BaCav1gydF4y2Ba−/gydF4y2Ba−gydF4y2Ba老鼠(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。它已被证明,以挪士激活次要Cav1不足导致过氧硝酸盐的形成,导致包裹硝化gydF4y2BaCav1gydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba老鼠。PKG硝化损害其激酶活性,从而诱发肺血管重塑和PH值(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。以挪士激活和PKG硝化突出在IPAH患者的肺组织gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。这些研究提供了明确的证据表明Cav1缺乏诱发nitrative压力,导致包裹硝化和PH值。gydF4y2Ba
在CKO的老鼠,我们观察到高浓度的活性氧/ RNS和PKG硝化和减少内皮Cav1表达式。我们证明Cav1 CKO老鼠缺乏参与的规定nitrative压力,因为Cav1转基因表达正常化的ROS水平/ RNS和抑制nitrative压力,就是明证肺血管ECs,减弱NT含量,从而抑制闭塞的肺血管重塑和降低PH值以及改善房车和PA函数CKO老鼠。我们观察到完全抑制血管闭塞改造没有neointima形成CKO / Tg小鼠、内皮gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba可拆卸的CKO老鼠和MnTMPyP-treated CKO老鼠。在这些老鼠内侧厚度影响较小,这是与明显下降但仍偏高RVSP一致。在一起,我们的数据表明,内皮Cav1缺乏次要PHD2缺乏介导nitrative压力的增大CKO老鼠肺部gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba激活内皮Nos3,闭塞的肺血管病变和严重的PH值。gydF4y2Ba
目前的研究表明,治疗与ROS / RNS清道夫MnTMPyP变弱RVSP和血管重塑CKO老鼠,这与先前的观察是一致的,抗氧化剂防治慢性缺氧大鼠引起的治疗降低PH值(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。然而,另一种抗氧化剂,TEMPOL,有益的影响减少RVSP但不是动脉重塑在缺氧和SU5416 / PH值低氧诱导大鼠模型(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。因此,抗氧化治疗是否有效的临床前模型PH值仍有争议,但这争议可能是因为所选代理,剂量和实验设计gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。例如,根据浓度和肺细胞类型,TEMPOL氧化剂和抗氧化剂可以(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。其他的研究还表明,高浓度的增加或延长接触TEMPOL ROS水平(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。进一步的研究是必要的,解决这一重要问题的抗氧化剂是否应该给PAH患者疾病的治疗。gydF4y2Ba
总之,我们演示了著名nitrative压力CKO老鼠的血管病变,介导的内皮Cav1缺乏归因于HIF-2α激活和合成以挪士激活。ROS / RNS清道夫治疗,CRISPR-mediated内皮gydF4y2BaNos3gydF4y2Ba击倒或转基因的表达Cav1抑制nitrative压力和闭塞的肺血管重塑和减弱PH CKO老鼠。因此,Cav1 deficiency-induced氧化/ nitrative压力中等PHD2不足是一个严重的PH值的机制的一部分,CKO老鼠,见PAH患者。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
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请注意:gydF4y2Ba补充材料并不是由编辑部,编辑和上传已由作者提供。gydF4y2Ba
补充数据。gydF4y2Baerj - 02643 - 2021. -补充gydF4y2Ba
补充视频S1。超声心动图M-Mode CKO的老鼠。gydF4y2Baerj - 02643 - 2021. - video_s1gydF4y2Ba
补充视频S2。超声心动图M-Mode CKO / Tg的老鼠。gydF4y2Baerj - 02643 - 2021. - video_s2gydF4y2Ba
可共享的PDFgydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们非常感谢部门的威廉·c·Sessa耶鲁医学院的药理学和药物对他的慷慨为我们提供的gydF4y2BaCav1gydF4y2BaTggydF4y2Ba老鼠。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
作者的贡献:z戴秉国和等号左边。赵构思的实验。z戴,b . Liu d .咦,j .戴n . Machireddy d .董k .拉米雷斯y彭和朱M.M.设计并进行了实验,并分析了数据。z戴,r . Vanderpool和等号左边。赵分析和解释数据。z戴写的手稿。z戴秉国和等号左边。赵监督项目和修订后的手稿。所有作者批准了手稿。gydF4y2Ba
这篇文章一篇社论评论:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.1183/13993003.01776 - 2022gydF4y2Ba
利益冲突:等号左边。赵是MountView疗法的创始人兼首席科学官LLC。这个项目利用技术受制于以下未决专利名为“PLGA-PEG纳米颗粒和使用方法”和“阳离子polymer-formulated纳米颗粒和使用方法”等号左边。赵。其他作者声明没有利益冲突。gydF4y2Ba
支持声明:这项工作的部分支持由美国国立卫生研究院(NIH)(赠款R01HL133951、R01HL140409 R01HL148810和R01HL164014)等号左边。赵,NIH (R00HL13827和R01HL158596),啊哈职业发展奖(20 cda35310084), ATS基金会肺动脉高压协会研究奖学金,亚利桑那州生物医学研究Cente (adhs18 - 198871)和亚利桑那州大学的部门启动资金戴z。资金信息,本文已沉积的gydF4y2BaCrossref资助者注册表gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2020年4月19日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2022年6月24日。gydF4y2Ba
- 版权©2022年作者。gydF4y2Ba
这个版本分布在创作共用署名非商业性许可证的条款4.0。商业生殖权利和权限接触gydF4y2Ba权限在}{ersnet.orggydF4y2Ba
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