文摘
结合scRNA-seq、空间转录组有可能导致肺架构的前所未有的视图在单细胞水平,在肺生理和生理病理学提供原始信息https://bit.ly/3uDYir0
介绍
单细胞技术的最新发展,尤其是单一细胞RNA序列(scRNA-seq),提供了宝贵的工具来解读复杂的生物系统,如肺。呼吸系统,scRNA-seq分析导致新发现的细胞类型,如ionocytes以及细胞组成的细化分类肺(1- - - - - -4]。分析超过300 000个细胞来自患者的肺部疾病,如特发性肺纤维化(IPF),使得识别新的的异常的基础群体和内皮细胞特定IPF (5]。此外,人类细胞图谱等集体努力,旨在描述人体所有细胞在分子水平和空间,有标记优先肺器官6]。持续努力现在指向空间转录组技术的发展允许识别细胞本地化和器官中的主流和信息交互的描述来定义一个生理细胞图谱。尽管技术序列原位单个细胞的转录组迅速崛起,他们仍然缺乏所需的分辨率描述极端细胞异质性,正是肺的解剖。本文将概述不同空间转录组的方法,可以应用于肺,以及他们的呼吸系统研究和医学的潜在影响。
一个目标,不同的方法
中央空间转录组的目标是描述转录组景观在单细胞水平在本地组织组织部分。两个正交技术在细胞水平上研究转录在过去十年已经牢固确立。首先,scRNA-seq提供,从细胞悬液,进入一个无偏的细胞的转录组测序。计算分析允许不同细胞类型的识别以及各自的转录组信息。虽然scRNA-seq分析提供关键信息来理解转录改变,它缺乏敏感性和,最重要的是,失去了空间环境中由于实验所需的细胞分裂。第二,传统的单分子荧光原位杂交(smFISH)检测RNA表达直接杂交的荧光标记探针的组织部分。这使得高敏感性和特异性RNA表达的定量测定在单细胞水平在原有空间上下文,但并不是在整个转录组的规模7,8]。
最近的进展进一步大幅提高这些技术和创新的几种方法的组合,多路复用和放大等,提供了一个更深的观点。在这里,我们提供一个简要的概述的一些最近达成的里程碑式的发展空间转录组改善方法或者通过实施创新组合。的好处和局限性的不同空间归纳了转录组的方法表1。
scRNA-seq hybridisation-based相结合的方法
计算分析scRNA-seq数据允许不同细胞类型的识别使用发布规范的标记。其他特异性mRNA的分析还允许识别标记,通常2 - 3,对于每一个细胞类型,可用于杂交。接下来,一组细胞特定类型的探测器设计,标签和杂交组织部分使用smFISH协议(见下文),和广角或共焦显微镜成像识别个人mrna (9]。
经典细胞特定类型的列表标记大大丰富了信息在scRNA-seq,从而允许广泛的细胞类型描述在某些器官,如大脑(10]。然而,成像所需数量的标记组织仍然是特别具有挑战性和多个因素(即。表达水平低、高背景由于不相干的杂交或组织自体荧光)可以降低信号质量。为了规避这些问题,不同的方法,这可能结合,旨在:1)增强实际的RNA信号(11- - - - - -15];2)增加探针的特异性,从而减少非目标绑定和背景(16];和/或由组织清算(3)删除自发荧光17,18]。
可靠地检测不同细胞类型,成千成百上千的mRNA物种被发现在相同的组织部分。然而,信使rna能被探测到的物种的数量在传统smFISH被可怕地解决荧光团的数量有限,通常3 - 4。绕过这个限制,执行顺序轮杂交显微镜配备微流控设备,允许适当的软件,完全自动化成像和缓冲交换。例如,在cyclic-ouroboros smFISH方法,三套探测目标三个不同的mrna在组织切片上杂交。成像后,探测器被使用高甲酰胺浓度。接下来,三个新的杂交探针集在同一节中,成像和剥夺,允许目标线性增加的数量与杂交轮的数量(10]。计算分析然后使用概率模型推断出图像中的细胞中的表达水平测量相比以前scRNA-seq获得。
多路复用策略hybridisation-based方法
增加的数量记录在RNA能被探测到的鱼,更复杂的策略使用特定的编码策略近年来开发的。在这里,一个给定的信使rna不是惟一地标识一个杂交,而是一个独一无二的条形码建立了几个杂交轮。这允许几个物种在每一轮有针对性的同时。信使rna表达然后计算推断,经常与纠错策略被包含在编码方案。这些方法包括多路复用Error-Robust鱼(MERFISH)和seqFISH,已改善几个迭代(17,19,20.]。例如seqFISH + 10 000个不同的mrna可以成像的大脑部分,允许精确的细胞类型识别和分子描述他们的空间组织21]。
原位测序策略
这些方法的目的是进行直接测序组织学组织部分。如FISSEQ(荧光方法原位测序)和STARmap(空间解决成绩单扩增子读出映射)反向转录测序前的细胞内信使rna,放大他们(22- - - - - -24]。其他方法,如Slide-seq / Slide-seqV2和HDST空间转录组(高清晰度)分析,用盖玻片或幻灯片涂有条形码益生元(dT)从组织部分捕捉mrna在记录他们的位置在同一时间25- - - - - -28]。下一代测序后,条码的解码允许可视化mrna的表达模式出现在幻灯片上。ExSeq,最近的方法结合了生物样品的空间扩张和RNA序列,允许高度多路复用映射组织RNA的部分(29日]。hybridisation-based方法相比,目标与高灵敏度相对有限的一组标记,无偏方法sequencing-based方法理论上描述整个转录组的每一个细胞的组织,因此它拥有更大的潜力。然而,一些限制仍然需要克服,如缺乏灵敏度和空间分辨率不经典达到单细胞水平。
空间转录组的方法,有可能导致前所未有的组织结构和生理的理解。然而,这些技术仍然具有挑战性和人员需要评估最适合他们的需要的分辨率和吞吐量(表1)。
空间转录组的肺和未来的应用
三个空间解决转录组研究到目前为止已经完成了肺。首先,PLISH(接近结扎原位杂交)是一种FISH-based方法依赖于探测,结扎后一步作为信号放大的模板。这允许实现高特异性、高灵敏度和高信噪比(30.]。PLISH协议适用于沉淀保留以及formalin-fixed石蜡包埋人体组织,可以结合古典疣状,使其适用于临床研究和诊断。作为一个概念证明,PLISH被用来比较at₂细胞控制的空间分布和IPF人类的肺部组织。此外,作者证明了迭代的图像染色的经典标记上皮细胞(如。AT1、at₂俱乐部细胞)和巨噬细胞送入专用分析管道允许自动映射这些细胞在肺组织学部分。
第二,SCRINSHOT(单细胞决议原位杂交在不同器官组织)进行验证,包括呼吸道(31日]。它使用挂锁探针,武器目标信使rna序列互补,共同的骨干。杂交后,挂锁探针的结扎使用SplintR创建循环单链DNA连接酶分子作为模板放大。染色和分析29 SCRINSHOT允许映射标记的不同的上皮细胞出现在气管上皮,包括最近发现ionocytes [1,2]。在远端气道和肺泡,15强劲标记被用来识别巨噬细胞和上皮细胞,如AT1和at₂细胞,以及俱乐部和神经内分泌细胞。
第三,C持续地等。(32)使用了一个原位测序技术本土化34肺组织感染的免疫记录结核分枝杆菌。简单地说,存在于肺部分rna是反向转录和挂锁DNA探针杂交特定于目标记录。结扎一步出允许螺旋的探测器所需的放大,放大产品进行测序。在这里,空间的免疫细胞转录组允许映射描述结核肉芽肿。
空间转录组领域近年来发展非常迅速。与社区驱动的努力等横膈缪里斯和人类细胞图谱优先呼吸系统(6,33,34)、肺细胞分类被精炼和分子标记为每个细胞类型现在可以从肺scRNA-seq数据集。这些细胞特定类型标记与空间分析转录组将允许更好地描述生理细胞类型以及它们之间的相互作用改变呼吸道疾病,提供关键的见解对他们的生理病理学的理解。
空间转录组在临床实践中,努力规范方法和创建自动化分析管道,最终可能会提供一个有用的补充工具分析分子标记或空间模式具体肺癌病理组织学部分。
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确认
作者要感谢Arnaud Mailleux,布鲁诺,伽马安基丁酸尼古拉斯·吉拉德和海洋勒费弗,莎拉Lagha则,西蒙Lefranc和Agathe Seguin-Givelet对他们的帮助和富有成果的讨论。
脚注
本文根据修正修正发表在2023年2月出版的欧洲呼吸杂志。
利益冲突:美国Curras-Alonso没有披露。
利益冲突:j . Soulier没有披露。
利益冲突:t·沃尔特没有披露。
利益冲突:f·穆勒没有披露。
利益冲突:a . Londono-Vallejo没有披露。
利益冲突:c . Fouillade没有披露。
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- 收到了2020年11月24日。
- 接受2021年3月29日。
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