文摘
血管生成在间质性肺疾病的致病的作用(ILDs)是有争议的。这项研究是第一个调查的空间复杂性的微血管结构和分子图案人类ILD的重要子集。我们的研究的目的是确定特定变异的人类ILD neoangiogenesis在三个常见的肺损伤模式。
我们进行了全面和compartment-specific分析24人肺组织通常intersitial肺炎(摘要),非特异性间质性肺炎(NSIP)和肺泡fibroelastosis (AFE)使用组织病理学,微血管腐蚀铸造、micro-comupted使用Nanostring基于断层扫描的容量分析和基因表达分析以及免疫组织化学评估remodelling-associated血管生成。
Morphometrical评估血管直径和intervascular距离显示显著差异在典型neoangiogenesis改建摘要、NSIP AFE肺。同样,基因表达分析显示不同的和特定的血管生成配置文件摘要,NSIP AFE肺。
而摘要肺显示更高的上游多血管密度和低密度病灶周边血管,NSIP AFE肺显示血管密集的肺泡间隔。NSIP血管重塑和AFE的特点是著名intussusceptive neoangiogenesis,与摘要,萌芽的新船到纤维化的地区特点。基因表达的分子分析提供一个基础理解这些基本AFE差异和摘要,并洞察到涉及的细胞功能。
文摘
肺损伤模式的公分母fibrosing肺部疾病的进展。本研究发现不同的表现neoangiogenesis作为人类ILDs肺动脉重塑的司机,调制骨骨髓来源的单核细胞。http://bit.ly/34F7KNS
介绍
间质性肺病(ILD)是指一组复杂的数百名non-neoplastic肺部疾病与变量形态,临床表现和发展趋势。ILD的特点是一个异常的响应,通常导致的肺结构compartment-specific中断(1]。在伤口愈合、血管生成的影响和生理血管结构一直被认为是一个至关重要的元素,特别是在肉芽组织和细胞外基质之间的相互作用2]。虽然血管> 70%的正常肺实质体积(3,4),肺微血管变化对纤维的影响在人类改造的进展,特别是ILD仍然知之甚少。
neoangiogenesis关键作用的特发性肺纤维化(IPF)、特发性间质性肺炎的咄咄逼人的变体,是揭示了E比娜等。(5),谁能证明增加毛细血管密度增加内皮扩散区域的最小的纤维化,但相邻的密度降低了,大多数大幅改建折磨患者的纤维化病变。
微血管腐蚀铸造和高分辨率计算机断层扫描(微型电脑断层扫描)适合可视化和分析肺组织的血管结构(6]。使用这些方法,肿瘤的异质脉管系统的复杂性特征(7- - - - - -9]。这里,高度vascularised capsule-like结构(myo)成纤维细胞的疫源地(10]。在ILD,唯一之前示范知名血管阻塞的肺IPF患者(11]。
众多的非正常表达angiogenesis-related分子介质被描述在IPF患者的肺部和血液,包括血管内皮生长因子(VEGF),基本的纤维母细胞生长因子,科学家趋化因子与ELR基序和转化生长因子(TGF) -β。此外,高度angiostatic色素分子epithelium-derived因素被发现在成纤维细胞的焦点中,典型(但不具体)通常的间质性肺炎(摘要)模式常见于IPF (10,12]。在bleomycin-induced小鼠肝纤维化模型中,CXCL11减少肺纤维化和内皮细胞的绝对数量在改建隔间(13]。我们自己的研究抗血管新生multikinase抑制剂nintedanib [14,15]显示异常的微血管结构的衰减。在具体的研究中,我们和其他人发现整个血管密度减少血管直径的正常化(16)和减少CCL18分泌和在治疗肺巨噬细胞分化17,18]。
在计算机断层扫描分析纤维化程度的改造在IPF患者中,Jacobet al。(19]报道了放射性的影响变量预测进展和死亡率。他们表明,肺血管卷有相关性最强的死亡率(19]。我们和其他人一再提出,微血管改变代表(之一)的第一步(s)的发病机理IPF (20.]。血管的完整性和破坏的损失alveolar-capillary膜肺结构的驱动连续改造pro-angiogenic和pro-fibrotic刺激16]。最近的观察也表明,肺毛细血管可以接受一个endothelial-mesenchymal过渡bleomycin-induced纤维化(21]。
鉴于修复反应血管生成的重要作用,一个可以合理地假设不同的微血管病变可能是反射的不同response-to-injury模式和肺结构中观察到的后续改造ILD [22,23]。之前的研究主要关注epithelial-mesenchymal ILD的病机,而可能的血管特征或理解机制仍然不佳。所以,我们目前研究的目的是描述的形态和分子差异vascularisation ILD血管生成,关注的主要和临床上重要的模式/实体摘要,非特异性间质性肺炎(NSIP)和肺泡fibroelastosis (AFE)。
方法
病人的选择、标本和学习小组
新鲜肺移植培养24 ILD的不同亚型患者纳入本研究。所有诊断都是由经验丰富的欧洲呼吸学会后肺部病理学家和美国胸科学会的指导方针。188bet官网地址病人组患者的放射学特征和组织学模式:摘要(n = 6 0雌性意味着±sd在移植61.4±6.8岁)、特发性NSIP (n = 6, 4女性,年龄在移植52.3±9.2岁)和AFE (n = 6, 5女性,年龄在移植40.7±27.8年)的慢性移植物与宿主病,广播- /化疗后,慢性肺部同种异体移植物功能障碍的组织学特点和idiopathically(特发性pleuroparenchymal fibroelastosis)。控制,我们用手术切除肺同种异体移植物样品之前已经获得立即移植排异反应大小匹配(n = 6, 1女,年龄在移植29.0±22.8年)。尽管小心样本选择、摘要和控制之间的显著差异在年龄仍然(假定值0.046 (< 0.05),Holm-Bonferroni方法)。所有IPF /摘要显示不同程度的轻度肺动脉高压患者符合弹性和肌肉肺动脉硬化。匿名组织标本和样品处理根据表达的原则在《赫尔辛基宣言》。这项研究是设计和执行后当地伦理委员会的要求在汉诺威医学院(道德投反对票。2702 - 2015)。采样和组织学、微血管腐蚀铸造、微型电脑断层扫描和基因表达中所描述的补充的方法。
基因表达分析ILD外植体
所有mRNA表达数据通过的nCounter®分析系统(美国NanoString技术、西雅图、佤邦)使用PanCancer进展面板(770个基因包括30参考基因)。原始计数进行正常化使用nSolver™分析软件3.0版本(NanoString技术)和一个修改版的nCounter®高级分析模块(版本1.1.5)。正常化过程包括积极的正常化(几何平均数),负正常化(算术平均值)和参考正常化(几何平均数)使用五个最合适的参考基因选择的共有30个可用的参考基因geNorm算法(24]。
蛋白表达分析ILD外植体
表达蛋白的检测是使用标准的免疫组织化学和多路复用标签使用蛋白石7系统。额外的信息可以在找到补充的方法。
功能分析
为了了解生理功能的调控表达的mRNA表达在不同ILD的实体,我们利用聪明才智通路分析工具(异丙醇;试剂盒、希尔登,德国)(25]。我们考虑根据以下水平的信心:假定值显著p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001。额外的信息可以在找到补充的方法。
统计分析的血管形态测量学
血管形态测量学的分析是基于测量在≥24肺样本(intervascular距离:2566点测量;容器直径:2259测量分)。Intervascular距离和容器直径由单向方差分析进行分析。如果方差分析显示显著差异(p < 0.05)之间在一组样品,一个所有成对分析(图基)。商用统计分析软件(JMP®8.0.2.2;SAS研究所Inc .,卡里,美国NC)被用来执行统计测试。
结果
摘要,NSIP AFE存在一个特定的血管形态形成的模式
与常规肺形态学(图1一个- c),组织病理学亚型ILDs揭示特定的形态学改变。摘要模式的特征是一种时空上异构的间质纤维化之间的过渡,由骨料的myofibroblasts(成纤维细胞疫源地),和形态正常肺组织(图1 f)。摘要显示零零碎碎,密集fibrosing改造主要是在胸膜下空间(图1 d和e)。NSIP显示均匀和温和的间质纤维化和统一的弥漫性肺泡隔增厚以及某种程度的间质炎症(图1 g我)。AFE涉及三个阶段的发展26,27]。AFE模式(图1 j- l)的特点是保留弹性纤维概述前肺泡隔和不断增加弹性蛋白的沉积在肺泡间质,而细胞外基质的空域完全填满。
免疫组织化学分析允许的形态描述纤维领域内皮标志物的表达CD31, bronchoepithelial标记CK7和淋巴podoplanin标志都可以经常看到近距离空间距离(图2)。然而,免疫组织化学染色的纤维领域不能反映了纤维和血管重塑的三维架构方面。
摘要本文分析微血管腐蚀铸件,NSIP AFE肺显示潜在的形态模式(补充材料1)。摘要肺部的微血管结构揭示了blind-ending tumour-like和混乱的异常分布,部分闭塞sinusoid-like血管缺乏层次和广泛的血管直径变化与血管密度减少(图3 b)。NSIP模式的特点是密集,扩张塔夫茨肺泡隔内的血管形成异常曲折(图3 c)。AFE模式表现出一定的相似性与NSIP模式即保存肺泡隔内微脉管系统显示一定程度的压缩(图3 d)。
血管形态测量学摘要显示血管重塑的重要改变,NSIP和安全的
我们评估了微血管单位纤维领域的三维微血管的形态测量学腐蚀投。个人血管纤维化病灶直径,在摘要的肺泡血管,NSIP AFE和健康控制肺显示高度显著差异(图4一)。摘要肺血管直径被认为最高(意味着±sd16.5±7.7µm)与NSIP肺(12.7±5.1µm;p < 0.001),肺AFE(13.1±5.1µm;方差分析,p < 0.001)或健康控制肺(平均5.9±1.9µm;方差分析,p < 0.001)。平均intervascular距离(距离相邻个体血管段)产生了类似的重要结果。摘要最高的intervascular距离观察肺(59.4±24.1µm)相比NSIP肺(18.8±9.0µm;方差分析,p < 0.001),肺AFE(11.6±4.1µm;健康对照组p < 0.001)或(12.0±3.7µm;p < 0.001)。血管容量测定微血管腐蚀投对微型电脑断层扫描(补充材料2得了)来评估上游血管的血管改变直径> 50µm (图4 c)。摘要肺显示更高,尽管重要,血管容积(36.1±5.9%;p = 0.013)和血管surface-volume比率(0.43±0.7;方差分析,p = 0.055)相比NSIP肺(分别为18.9±2.0%和0.54±0.6),AFE肺(平均16.6±3.7%和0.39±0.04,分别)和控制(分别为6.24±0.8%和0.58±0.11)(数据没有显示)。
Intussusceptive和血管生成促进纤维化neovascularisation
我们确定了intussusceptive和发芽血管生成分析肺微血管内腐蚀铸。intussusceptive支柱的形成进行了最初的血管舒张紧随其后的CD34/31-positive progenitor-like [28,29日)和间充质干细胞的激活跨度腔间的桥梁,“intussusceptive支柱”(图5一个和b) (补充材料5;量化CD34 / CD31阳性细胞的增殖ki - 67)。萌芽的出现和intussusceptive血管生成在肺纤维化,而NSIP肺显示更高频率的支柱形成摘要和AFE肺(相比图5 c;方差分析,p < 0.001)。与肠套叠,最高频率(> 10倍增加)相比,摘要肺芽的形成被认为NSIP和AFE肺(p < 0.001,方差分析)(图5 c)。的高发生intussusceptive NSIP肺血管生成是主要观察到扩大隔膜,著名tuft-like扩张血管的观察(图5 d)。摘要肺部,直言不讳,blind-ending与父小静脉扩张血管位于毗邻成纤维细胞的焦点。在这些钝的船只的尖端,豆芽大多是调整中央对成纤维细胞的焦点(图5 e)。
微分调节mRNA表达和生物功能的摘要,NSIP和安全的
我们进行了数字多路复用基因表达分析通过NanoString nCounter®技术(补充材料3模拟)。记录分析显示,20个基因的表达显著差异在三个肺肺损伤模式相比,健康控制(图6)。为了验证,选择基因的蛋白表达也室具体地分析通过免疫组织化学。这里,胶原蛋白(坳我,III, IV)和胶原重塑基质金属蛋白酶(MMP2、MMP9 MMP14)相关与neoangiogenesis mRNA表达相应的网站(补充材料4)。比较基因分析显示重叠之间的显著差异表达基因的摘要,NSIP和AFE (图6 b)。16个基因显著调节AFE肺,而只有四个基因差异表达摘要肺和一个基因NSIP肺。一个基因(IGF1)显著调节(p < 0.001)的公分母AFE和摘要,而MEG3显著(p < 0.01)表示在两个受伤的摘要和NSIP模式。COL1A1和THY1是高度显著(p < 0.001)中表达NSIP和AFE肺(补充材料3)。除了规范的途径,也被相关的差异表达基因功能通路使用异丙醇(图6 c)。通过这种方法,AFE肺部表现出不同功能的upregulation途径相比,NSIP和摘要。分析主张显著(p < 0.01),非常显著(p < 0.001)激活的上皮细胞和成纤维细胞迁移,以及巨噬细胞分化AFE NSIP肺。此外,激活epithelial-mesenchymal过渡在AFE肺。Neoangiogenesis,内皮细胞的迁移和纤维发生也显著激活AFE摘要相比肺(p < 0.01)。NSIP AFE相比,肺和摘要显示通路激活(NSIP >摘要)。炎症信号通路分析,仅在摘要调节肺AFE和NSIP相比。
讨论
在这项研究中,我们评估了形态形成和血管生成的分子方面的间质性肺损伤模式摘要,NSIP和安全的。我们组装的病人群显示年龄或性别方面无显著差异,除了摘要集团(老,一般来说)。然而,由于统计分析基因表达数据的健康对照组并没有发现年龄相关性的影响,这似乎是可信的,NSIP AFE和摘要分析相比,健康对照组。
首先,我们的数据表明,组织病理学形态特性广泛依赖于底层的血管结构改变。NSIP和AFE透露类似的血管损伤模式明显增厚,肺泡隔的改造而摘要肺的特点是upregulation上游血管的血管密度和减少船舶密度病灶周边和肺泡病灶周边毛细血管丛。此外,血管直径和intervascular距离的差异反映了这些个人的变化。第二,我们的数据为角色提供证据的萌芽和intussusceptive血管生成病灶周边和肺泡血管的扩张。第三,我们的研究结果的差异和相似之处angiogenesis-related基因表达强调的形态特征在摘要血管重塑,NSIP和AFE (图7)。
血管生成的影响ILD的发病机理和发展已经成为一个争议的话题(12,20.,25]。虽然一些研究建议刺激异常的血管生成是ILD的核心特征,其他作者已经报道了IPF患者肺活检的血管密度降低,特别是[5,20.,30.]。合法问题”在肺纤维化,血管生成过多或不够吗?提出的“Hanumegowdaet al。(12)无法轻易解决由于建筑血管系统的复杂性及其对二维密度组织学幻灯片。因此,在这项研究中,使用三维分析,我们把精力解体的复杂性两个时空异质性的微血管变化出现在摘要,NSIP AFE肺。似乎矛盾的整体摘要是调节血管的体积,而病灶周边血管密度降低和减少而完全相反与NSIP明显肺。血管的临床预测价值体积作为死亡率的标记最近在深度讨论了Jacobet al。(19),使用一个基于计算机的算法评估肺血管数量衡量计算机断层扫描。然而,这种技术只抓住了上游血管的改变从肺泡和病灶周边毛细血管丛,但并没有解决异构血管形态学方面的新近形成的血管,可能导致疾病的进展。纤维领域的形成,必然会造成血液动力学的变化与开放之间的吻合肺和支气管循环。这些血流动力学和微机械部队提高扩张的血管丛intussusceptive血管生成(26,31日]。因此,改造可能代表一个关键支柱形成和分支适应性反应的不断增加血流量和血压在炎症和再生。以前,我们组所示,慢性炎症触发progenitor-like血管生成细胞的迁移和招聘网站的改造(25- - - - - -27]。在炎症ILD NSIP模式和安全的32,33),我们观察到intussusceptive支柱的频繁发生。
相比之下,血管生成在摘要肺部病灶周边发芽血管生成是由缺氧,这等因素,指出upregulation的胰岛素样生长因子(IGF) 134]。与恶性肿瘤,UIP-specific多血管显示混乱vessel-like安排许多生硬的结束。低氧诱导的血管重塑与修改相关联的细胞外基质,基质金属蛋白酶,正如我们前面显示,抑制igf - 1能阻碍发芽明显血管生成(35]。此外,局部缺氧导致化生和肺泡II型细胞的增生Notch信号和Krt5pos官腔细胞在肺泡的扩张修复和改造36]。
Nintedanib multikinase抑制剂,抗血管生成属性,已被证明有效果在减少IPF患者肺功能的下降37]。除了抗炎和anti-fibrotic效果,问题仍然在于,抗血管生成治疗可能发挥关键作用在IPF患者改善功能结果。bleomycin-induced鼠标纤维化模型中我们的研究表明,改变血管架构似乎“正常化”nintedanib治疗后(16),这种现象同样存在于肿瘤治疗有抗血管生成疗法(35,38]。此外,intervascular距离和容器直径显示nintedanib-treated动物的显著差异,而在治疗肺功能改善。因此,结构动力学的微血管结构可能会构成ILD的受伤和发展模式。否则,Farkas等。(39)可以显示在一个IPF鼠模型瞬态超表达的积极TGF-β1减少多血管与广泛的改造和继发性肺动脉高压。在这个模型中,VEGF管理显示肺动脉高压的改进通过抑制内皮细胞凋亡,但也加重了肺纤维化。
一些作者认为,血管改变可能代表一个初始触发ILD的发病和进展(20.,40),并得出结论,肺的肺纤维化患者显示方面静脉闭塞性疾病(PVOD)异常postcapillary haemangiomatosis扩张。类似的观察是IPF患者[non-fibrotic地区40),65%的病例证明venopathy闭塞。我们自己最近的工作(41在PVOD强调多病灶的intussusceptive neoangiogenesis和血管萌芽代表进步的三维关联肺haemangiomatosis。此外,我们描述类似的形态形成的现象在慢性血栓栓塞肺动脉高压的丛状的血管病变有明显intussusceptive血管生成(42]。
NSIP AFE显示共享upregulation COL1A1和Thy1 / CD90。Thy1 / CD90表达内皮细胞在网站上的慢性炎症和相邻的恶性肿瘤,以及在成人动脉外膜间充质祖细胞,在哪里都是参与的微血管扩张intussusceptive neoangiogenesis [43]。其他的研究报道,具有抑制受损血管生成延伸intussusceptive毛细管增长的主要驱动力Thy1.1-nephritis模型(43),这是符合人类NSIP隔血管的复苏和AFE肺。我们观察到更高频率的intussusceptive安全特性在NSIP和肺纤维化。的扩张微血管网络progenitor-like肠套叠与招聘相关的血管生成细胞形成腔间柱(26,31日]。这些循环progenitor-like血管生成细胞被招募为tissue-resident派生或骨髓单核细胞可transdifferentiate其他类型为proangiogenic M2-polarised肺泡巨噬细胞(29日,44,45)或内皮细胞然后纳入新成立intussusceptive血管(42,45]。一个lvarez等。(44]characterisedendothelial细胞与肺微循环和高度vasculogenic能够更新整个层次结构的内皮细胞生长。
最近的证据(46)证实骨髓单核细胞衍生的主要成分由intussusceptive血管新生血管扩张,由SDF-1 / CXCR4信号控制。我们组观察到类似的CD11b对迁移的影响+单核细胞在肺再生(29日]。总之,我们提供了第一个证据,危及生命的组织病理学损伤模式ILDs高度依赖于底层的血管结构改变和船舶密度在摘要,NSIP AFE肺。而摘要肺显示更高的上游多血管密度和低密度病灶周边血管,NSIP AFE肺透露密集的肺泡和隔血管。微血管病变的萌芽(摘要)和intussusceptive血管生成(NSIP AFE)可能贡献的关键致病的机制在疾病的进展capillary-alveolar交互。我们的数据可以确定新的治疗靶点的潜在积极改变的影响异常的血管生成ILD的ILDs的不同亚型。
补充材料
补充材料
请注意:补充材料并不是由编辑部,编辑和上传已由作者提供。
补充材料1。三维图像erj - 00933 - 2019. - supplement_1
补充材料2。摘要本文在微CT。erj - 00933 - 2019. - supplement_2a
补充材料2 b。NSIP微CT。erj - 00933 - 2019. - supplement_2b
补充材料2摄氏度。AFE微CT。erj - 00933 - 2019. - supplement_2c
补充材料3。基因表达:样品、原始数据和正常化。erj - 00933 - 2019. - supplement_3a
补充材料3 b。基因表达:微分表达式与控制。erj - 00933 - 2019. - supplement_3b
补充材料3 c。基因表达:统计数据。erj - 00933 - 2019. - supplement_3c
补充材料3 d。基因表达:功能分析。erj - 00933 - 2019. - supplement_3d
可共享的PDF
确认
作者感谢Regina恩格尔哈特,安妮特·穆勒Brechlin克里斯蒂娜的作品,妮可·克伦克和江诗丹顿Kloepper(汉诺威医学院,汉诺威,德国)和Kerstin巴尔(美因茨大学医学中心、美因茨、德国)为他们的优秀的技术支持,和加雷斯·格里菲斯,艾莉森塞德尔和波林Tittmann(汉诺威医学院)编辑稿件。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com。
作者的贡献:a . Haverich t Welte和d Jonigk管理病人。m·阿克曼a . Haverich l . Neubert舒伯特,h·斯塔克,w•斯蒂勒柔瓦格纳和m . Kuehnel激动手术标本。m·阿克曼·h·斯塔克,中华民国Mentzer, t . Welte a .而H.R. Shah m . Kuehnel和d Jonigk解释数据。m·阿克曼舒伯特,h·斯塔克,m . Kuehnel和d Jonigk写的手稿。m·阿克曼l . Neubert p . Borchert m . Wielputz w·斯蒂勒,柔若瓦格纳、f·林茨和h·斯塔克准备了图片。m·阿克曼t . Welte中华民国Mentzer, h·斯塔克,m . Kuehnel和d Jonigk修订后的手稿。
支持声明:这项工作是由国家卫生研究院的基金支持HL94567 HL134229 m·阿克曼和中华民国Mentzer;Sonderforschungsbereich”SFB“738 (Projekt B9)德国研究基金会的d . Jonigk;和欧洲研究委员会(ERC),欧洲集运商格兰特,XHale哒。Jonigk(参考号771883)。
利益冲突:h·斯塔克没有披露。
利益冲突:l . Neubert没有披露。
利益冲突:美国舒伯特没有披露。
利益冲突:p . Borchert没有披露。
利益冲突:f .林茨没有披露。
利益冲突:柔瓦格纳没有披露。
利益冲突:w·斯蒂勒报告赠款从德国联邦教育和研究(BMBF),在进行这项研究的。
利益冲突:m . Wielputz报告赠款从勃林格殷格翰集团和顶点医药,在提交工作。
利益冲突:a .而没有披露。
利益冲突:a . Haverich没有披露。
利益冲突:中华民国Mentzer没有披露。
利益冲突:H.R.沙没有披露。
利益冲突:t . Welte报告赠款从德国的研究和教育,在进行研究;个人费用咨询委员会工作从勃林格殷格翰的发言和演讲,个人费用从罗氏临床研究,在提交工作。
利益冲突:m . Kuehnel没有披露。
利益冲突:d Jonigk没有披露。
利益冲突:m·阿克曼没有披露。
- 收到了2019年5月9日。
- 接受2019年11月26日。
- 版权©2020人队