文摘
的转录因子SRY-related HMG盒(SOX) 2和octamer-binding转录因子(10月)4调节mir - 302 - 367的表达集群。mir - 145调节SOX2和OCT4翻译和p53调节mir - 145的表达。我们分析了表达式mir - 302 - 367的集群和mir - 145和p53的突变状态切除nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)患者和相关结果复发时间(竞技场队伍)。
肿瘤和正常组织样本配对获得从70年非小细胞肺癌患者。微表情与TaqMan MicroRNA分析评估。p53 5到8外显子测序。
mir - 145是表达下调(p < 0.0001)和mir - 367是调节(p < 0.0001),肿瘤与正常组织相比。竞技场队伍是18.4个月患者mir - 145水平低与高水平和28.2个月(p = 0.015)。竞技场队伍是29.1个月患者mir - 367水平低与高水平和23.4个月(p = 0.048)。竞技场队伍是较短的患者都不利的变量(p = 0.009)。低mir - 145表达(p = 0.049),不利的微rna水平(p = 0.02)和低的组合mir - 145与p53突变(p = 0.011)是独立的标志更短的竞技场队伍。
总之,mir - 145和mir - 367表达可能复发手术治疗NSCLC的新标记。p53可能发挥作用在非小细胞肺癌的调制mir - 145的表达。
肺癌是世界上癌症死亡的第一原因(1],∼85%的肺癌是nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)。< 30%的非小细胞肺癌诊断在早期阶段,主要的治疗方法是手术切除。手术后复发率高(20 - 70%,这取决于疾病阶段),和舞台ii iii患者定期接受辅助化疗,这被证明能改善生存在一些随机的临床试验(2- - - - - -5]。然而,辅助化疗并不经常管理I期疾病(2),尽管它已经假定高风险阶段我的病人也可以受益于这种治疗(6]。生物标记物预测复发的风险将是一个有用的工具对风险分层和选择病人的辅助治疗。
的转录因子SRY-related HMG盒(SOX) 2、octamer-binding转录因子(10月)4和NANOG是必不可少的对早期胚胎发育和维护和监管具备干细胞在人类胚胎和成年组织(7,8]。失调与肿瘤相关的这些胚胎转录因子在几个癌症生长和进展(9,10]。在非小细胞肺癌,SOX2强烈和广泛地表达∼90%的鳞状细胞癌和腺癌的20% (11]。SOX2 3 q-amplified致癌基因在肺和食管鳞状细胞癌(12),和3 q放大可以单独在支气管活检(高——从低档发育不良13]。此外,侵袭前支气管病变的临床进展与SOX2放大[有关13]。SOX2在低分化表达式也高于分化良好的肿瘤(14]。有趣的是,不仅SOX2过度刺激细胞迁移和anchorage-independent生长在细胞培养15),但这也是致癌在小鼠模型16]。SOX2表达式,通过免疫组织化学方法检测,提出了作为一个独立的标志阶段贫困结果我肺腺癌17]。
小分子核糖核酸(microrna)是小非编码RNA(22 - 24核苷酸长度),负调控RNA蛋白质翻译。microrna是必不可少的调节细胞增殖、分化和维护具备干细胞(18]。袜和OCT4绑定到mir - 302启动子区域和对其成员的表达至关重要(mir - 302 a * b *碳碳* - d -和mir - 367) [18,19在人类胚胎干细胞。mir - 145调节SOX2 OCT4表达式和块在人类胚胎干细胞自我更新和诱导表达的中胚层和外胚层的分化标记(20.]。
中央肿瘤抑制基因p53的突变,调节许多microrna的成熟,已被证明导致衰减的microrna的处理活动。有趣的是,p53调节mir - 145的表达通过绑定到其启动子区域(21]。
这些数据表明,mir - 302 - 367集群,mir - 145和p53共同影响人类胚胎干细胞的生长和分化。然而,这三个因素在早期非小细胞肺癌的相关性还有待阐明。为了阐明这个潜在作用mir - 302 - 367的集群,mir - 145和p53, microrna的表达和分析手术切除NSCLC患者p53的突变状态随时间和相关结果复发(竞技场队伍)。
材料和方法
研究人群
70新鲜肿瘤样本和70配对正常组织样本非小细胞肺癌病人在我们的机构完成手术切除前瞻性收集2007年6月至2009年12月。后立即手术,样本的标签,冻结在-80°C,继续进行进一步的处理。所有患者病理证实阶段》非小细胞肺癌,东部合作肿瘤组性能状态0 - 2,是> 18岁,有足够的器官功能。批准这项研究是来自医院的机构审查委员会诊所的巴塞罗那,西班牙。书面知情同意了每个参与者依照《赫尔辛基宣言》。
RNA提取和microrna的量化
总RNA提取新鲜冷冻肿瘤和正常组织使用试剂盒(被生活表达载体技术,卡尔斯巴德、钙、美国)后,制造商的协议。RNA浓度得到使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(费舍尔科学,马德里,西班牙)。10 ng的总RNA用于每个microrna的量化。我们进行了两个独立的副本在一个单一的运行。microRNA的检测进行了使用商业化验(TaqMan microRNA化验;美国应用生物系统公司,培育城市,CA) mir - 145, mir - 302 - a - b - c - d和mir - 367,如前所述[22),使用一个应用生物系统公司7500序列检测系统。使用2相对量化计算−ΔΔCt,Ct是循环阈值。正常化进行与mir - 191被发现冷冻肺标本中最稳定microrna的表达(23]。我们使用正常组织表达的中值作为校准器。
p53基因突变分析
PCR进行50-ng DNA样本识别p53突变。p53突变分析包括外显子5 - 8。以下引物被使用:p53外显子5前进5′-GTTTCTTTGCTGCCGTCTTC-3′,反向5′-GAGCAATCAGTGAGGAATCAGA-3′;p53外显子6向前5′-AGAGACGACAGGGCTGGTT-3′、反向5′-CTTAACCCCTCCTCCCAGAG-3′;p53外显子7向前5 -TTGCCACAGGTCTCCCCAA-3,反向5“-AGGGGTCAGAGGCAAGCAGA-3”;和p53外显子8向前5′-GGGACAGGTAGGACCTGATTT-3′,反向5′-TAACTGCACCCTTGGTCTCC-3′。PCR产品被琼脂糖凝胶电泳分析,纯化,用于两个每个外显子测序反应(正向和反向),使用大染料终结者循环测序工具包(版本3.1;应用生物系统公司)。反应是加载到abi - 310 DNA定序器(应用生物系统公司)。所有与SeqScape序列分析软件(应用生物系统公司)。 The p53 mutation analysis was performed in only 64 patients as the remaining six patients had insufficient tissue for DNA extraction. Conditions are shown in detail in the online supplementary material.
统计方法
我们的研究的目的是评估竞技场队伍,计算时间的手术治疗复发或最后随访的日期。计算使用kaplan meier方法和竞技场队伍相比使用生存率较。最优截止点的microrna的表达数据和竞技场队伍总体存活率评估通过最大限度地选择log-rank统计(24)使用Maxstat包(2.8.1发布版本;R统计软件包,统计和数学研究所,维也纳,奥地利),证实了kaplan meier测试。所有变量的假定值≤0.1的单变量分析包含在考克斯多变量分析来计算独立优势比竞技场队伍。所有统计分析PAS 18 W统计(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)和R 2.13版。统计学意义是p≤0.05。
结果
病人的特点
表1显示了70个病人的主要特征包括在分析中。58例(82.9%)患者是男性。他们的平均年龄是67年(46 - 83年)。59例(84.3%)患者接受了叶切除术或bilobectomy。所有患者病理肿瘤阶段》。36例(51.4%)患者腺癌和28个病人(40%)有鳞状细胞癌。15例(21.4%)患者接受cisplatin-based辅助化疗。平均17个月的随访中,23例(32.9%)患者复发,5人(21.7%)接受辅助化疗。
mir - 145和mir - 367表达,单独和组合
总体的意思是竞技场队伍是26.2个月。意味着女性竞技场队伍是36.7个月与23.3个月的男性(p = 0.02)。为了检查的预后影响mir - 145的表达水平,mir - 302 - a - b - c - d和mir - 367,我们使用选择的分界点Maxstat包r .这只识别重要的截止点mir - 145(截止RQ 0.95)和mir - 367(截止RQ 0.65)。两个截止点区分两组病人:患者有或没有重叠与正常组织表达,观察到图1。当患者分为根据选定的分界点,患者平均竞技场队伍mir - 145水平低是18.4个月与28.2个月患者高mir - 145水平(p = 0.015;图2一个)。意味着患者竞技场队伍mir - 367水平低是29.1个月与23.4个月患者高mir - 367 (p = 0.048;图2 b)。没有其他的差异观察竞技场队伍根据临床特点或microrna的表达水平。
为了进一步探索的影响mir - 145和mir - 367,然后我们检查了他们的效应相结合。当患者不利的变量(低- mir - 145和高表达mir - 367)组合在一起,意思是14.7个月对患者不利的竞技场队伍变量与27.8个月患者只有一个或者没有不利的变量(p = 0.009;图3)。
p53突变和mir - 145的表达
p53突变状态在64年成功地评估患者,13例(20%)的人怀有p53突变(表2)。正常化实时PCR结果从64年肿瘤样本显示,mir - 145表达下调患者p53突变和调节不变异患者p53 (p < 0.009)。意味着褶皱变化之间的组与p53突变组与不变异p53是0.37。的平均ΔCt值0.67组与p53突变和-0.71组不突变(图4)。意味着13的竞技场队伍是28.69个月患者p53突变和15.60个月的剩余51没有p53突变(p = 0.002) (图5)。意思是9.95个月的竞技场队伍六个患者低mir - 145表达与p53突变和27.38个月,其余64例低mir - 145表达但没有p53突变(p = 0.00001) (图5 b)。
多变量分析
竞技场队伍执行包括临床变量的多变量分析与单变量log-rank p < 0.1,疾病阶段,mir - 145表达,mir - 367表达与p53突变状态。低mir - 145表达式(或2.70,95%可信区间1.05 - -7.26;p = 0.049)和p53突变(或3.53,95%可信区间1.3 - -9.6;p = 0.014)成为独立标记较短的竞技场队伍,而I期疾病(或0.21,95%可信区间0.068 - -0.657;p = 0.007)是一个独立的标志不再竞技场队伍。
第二个多变量分析被执行,包括相同的临床变量但比较不利的microrna的表达水平(低mir - 145 +高mir - 367)与其他组合和比较低mir - 145表达与p53突变与低mir - 145表达没有p53突变。在这个第二多变量分析,结合不利的microrna的表达水平(或3.56,95%可信区间1.20 - -10.40;p = 0.02)和低的组合与p53突变mir - 145(或3.67,95%可信区间1.34 - -9.98;p = 0.011)是独立标记为较短的竞技场队伍,在舞台上我疾病继续是一个标记时间竞技场队伍(或0.169,95%可信区间0.05 - -0.52;p = 0.002) (表3)。
讨论
SOX2 / OCT4 / NANOG组转录因子是至关重要的维持多能性胚胎干细胞表型。p53增强了转录后成熟mir - 145 (25),负责监管SOX2 / OCT4[的表达20.),而SOX2 OCT4和上游NANOG作为监管者的集群(mir - 302 - 36719]。有趣的是,两个SOX2 / OCT4 NANOG和mir - 302 - 367表达水平高在胚胎发育的初始阶段,但在细胞分化[差别进行快速对这些26,27]。此外,在一些细胞系的一项研究显示,异位表达mir - 302 - 367的集群足以让细胞,将它们转化为具有多能性细胞(28]。虽然很明显,SOX2 / OCT4 NANOG及其相关的microrna, mir - 302 - 367集群和mir - 145,在胚胎干细胞中发挥独特作用,这是第一份研究的潜在影响预后这些胚胎microrna在手术治疗癌症患者。
目前的研究显示显著差异mir - 367的表达水平和mir - 145从手术切除肿瘤和正常组织之间的非小细胞肺癌患者。mir - 145肿瘤的表达低于正常组织,这是类似于胚胎干细胞的发现和癌症细胞系。在人类胚胎干细胞,mir - 145调节SOX2和OCT4表达,抑制自我更新和多潜能20.),和CD133+癌症细胞系,mir - 145超表达显著降低癌症干细胞的增殖能力(29日]。在目前的研究中,水平较低的病人mir - 145有一个短的比那些竞技场队伍水平较高,表明mir - 145可能在早期非小细胞肺癌相同的抑制作用。
mir - 145相比,mir - 367肿瘤的表达明显高于正常组织,和更高水平的患者mir - 367有一个短的竞技场队伍比那些较低的水平。同理,人类胚胎干细胞实验研究发现mir - 367可以积极调节细胞自我更新和维护细胞多能性通过抑制细胞周期蛋白D1 /到和激活转化生长因子β(TGF)节点/苯丙酸诺龙(30.]。众所周知,SOX2 / OCT4 NANOG调节集群mir - 302 - 367的表达在胚胎干细胞和实验和临床研究表明之间的关系SOX2 / OCT4 NANOG和肿瘤生长和转移17,31日]。总的来说,这些发现表明,mir - 367高表达可能促进肿瘤发展。
最近,之间的显著相关性被发现mir - 145表达与p53突变状态在前列腺肿瘤组织和肿瘤细胞系(32]。前列腺癌p53突变样本和mir - 145细胞系表现出低表达与相邻正常的地区或non-mutated细胞系。在目前的研究中,患者p53突变和mir - 145低表达患者预后比不变异p53和低mir - 145。这是发现的细胞系,p53突变导致衰减的microrna的处理活动,暗示tumour-suppressive p53的作用[25]。这些数据表明,有可能是一个重要的联系p53突变状态和mir - 145的表达。
多元分析在目前的研究表明,低mir - 145表达结合高mir - 367表达是一个独立的标志更短的竞技场队伍,表明除了扮演独特的角色在胚胎干细胞,mir - 145和mir - 367也可能影响成人干细胞。它最近建议成人肺干细胞保留分子特征的典型胚胎干细胞(33]。因此,它可以假定mir - 145的异常表达和mir - 367可能是一个必要的正常成体干细胞的转化成癌症干细胞。
我们所知,目前的研究首次探索潜在影响胚胎早期肿瘤进展相关的microrna。虽然有很多承认非小细胞肺癌的预后和预测标记,包括几个基因签名,microrna和microrna的签名,microrna多个目标基因的转录调节使我们的分析推测,microrna的表达可能拜访比基因表达的影响。虽然进一步的研究是必要的,microrna的签名很可能是有用的在预测患者将如何应对某些化疗方案或复发的风险更大。
总之,我们的研究结果提供了第一个暗示mir - 145和mir - 367表达可能是一个有效的预后标志物可用于危险分层和选择早期非小细胞肺癌患者的辅助治疗。此外,p53的潜在作用调制mir - 145表达需要进一步调查。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项工作是由支持洋底de Investigacion疗养地(FIS 080135, 09年00547),皇家社会诺拉德Neumologia y Cirugia Toracica(SEPAR 809 - 2009)Societat Catalana de Pneumologia(2009届社会资本市场)。t·迪亚兹是由报社de涉外d 'Ajuts Universitaris我德Recerca (AGAUR) Generalitat de加泰罗尼亚和社会Europeo洋底。r·特是巴塞罗那大学的一员。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2012年3月22日。
- 接受2012年6月29日。
- ©2013人队