摘要gydF4y2Ba
哮喘患者气道平滑肌(ASM)与细胞外基质(ECM)的双向相互作用可能影响气道壁重塑和ASM功能。我们研究了培养的人ASM重组三维胶原凝胶结构的能力,以及内皮素(ET)-1和用于治疗哮喘的药物的影响。gydF4y2Ba
将人ASM细胞铸入I型胶原凝胶中。在不存在ET-1和潜在抑制剂、类固醇和β的情况下,测定了72 h内凝胶面积的减少gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体受体激动剂。测量凝胶湿重和羟脯氨酸含量的变化,并通过扫描电镜观察ASM凝胶形态。gydF4y2Ba
ET-1介导的细胞密度依赖性凝胶区减少增强gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体。这一过程与ASM收缩或增殖无关,但与ASM牵拉重塑和迁移一致,导致胶原蛋白凝结而不是胶原蛋白在凝胶内降解。沙丁胺醇和/或布地奈德对ASM的胶原重构无影响。gydF4y2Ba
这项研究证明了ASM在ECM调节和对类固醇和β耐药的气道疾病的调节异常中具有额外的潜在作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体受体激动剂。ASM束内的抗治疗性胶原凝结可能促进ECM-ASM相互作用,并有助于增加气道内阻力。gydF4y2Ba
哮喘气道壁重塑(AWR)的显著特征包括气道平滑肌(ASM)的积累和细胞外基质(ECM)组成的扩张和改变,包括I型胶原蛋白丰度的增加gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.由于这些变化,ASM与改变的细胞周ECM之间的双向相互作用可能会增加。这些相互作用可能受到内皮素(ET)-1的影响,因为ET-1除了具有更好的特征的强效支气管收缩作用外,还可以增加ASM增殖和胶原蛋白分泌gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
相对于其调节气道高反应性的收缩作用,ASM对哮喘中ECM合成和周转的纤维性改变的贡献被认为是次要的gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba.相反,在AWR中气道成纤维细胞对亚上皮纤维化的贡献是有充分证据的gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,分化为与胶原合成增加相关的肌成纤维细胞表型gydF4y2Ba8gydF4y2Ba.然而,表型调节ASM细胞从收缩到合成增殖状态gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba也与一系列促炎细胞因子和趋化因子的释放以及多种ECM蛋白的分泌有关,包括胶原蛋白gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
即使ASM对ECM体积的贡献不大,ECM也能影响哮喘相关的关键ASM功能。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba证据表明,ASM细胞周围ECM环境的退化可以减少肌肉负荷,促进肌肉缩短gydF4y2Ba10gydF4y2Ba而扩张和更硬的ECM与气道扩张性降低有关gydF4y2Ba11gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
此外,ASM周围的ECM改变可以通过自分泌/旁分泌对ASM非收缩功能的影响,包括增殖、迁移和分泌产物的合成,从而达到重要的意义。在I型胶原上培养ASM已被证明能诱导对多种有丝分裂原更大的增殖反应,并增加eotaxin、RANTES和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的产生gydF4y2Ba12gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
糖皮质激素调节ASM-ECM相互作用的能力也可能在ECM改变的情况下发生改变。糖皮质激素对成纤维细胞和ASM均有抗增殖、抗迁移和抗炎作用gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba但这些反应的类固醇敏感性在变性(非纤原性)I型胶原存在时受损gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.此外,对原纤维化介质反应的ECM产生增加也是类固醇耐药的gydF4y2Ba18gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
ASM-ECM相互作用也可能通过细胞介导的周围基质结构重组导致胶原重构。这一过程已通过人胎肺(HFL)-1和成人支气管成纤维细胞在三维I型胶原凝胶中进行了广泛研究gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba作为伤口愈合和组织重塑的模型。成纤维细胞诱导的凝胶面积减少通常被描述为凝胶“收缩”,可以通过包括ET-1和转化生长因子-β在内的多种介质加速或增加gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba.特别相关的是观察到由成纤维细胞介导的胶原蛋白密度的增加可以通过糖皮质激素进一步增强gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
尽管ASM也被证明会导致胶原凝胶面积的减少gydF4y2Ba19gydF4y2Ba在美国,这一过程的机制以及哮喘介质或糖皮质激素对其的调节均未被详细探讨。鉴于ASM-ECM相互作用可能对气道疾病中ASM合成和收缩功能的改变产生影响,我们使用植入人ASM的I型胶原凝胶来研究这些细胞促进周围ECM重塑的潜力。在各种抑制剂和选择性受体拮抗剂的存在下,ET-1和组胺对这一过程的影响已经被评估,以探索asm依赖凝胶收缩的机制。糖皮质激素和β的作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-肾上腺素能受体激动剂也被检查,以探索用于治疗哮喘的药物对胶原重塑的潜在调节。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
人ASM培养来自宏观正常气道的支气管,取自肺移植受者或供体以及肺切除术标本。从支气管壁显微解剖ASM,用胶原酶(1 mg·mL)酶解gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)和弹性蛋白酶(0.5 mg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
细胞保持在37°C, 5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在空气中杜尔贝科的改良鹰中型(DMEM)(2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺,0.25%牛血清白蛋白,100 U·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba青霉素G, 100 μg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba链霉素,2 μg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba两性霉素B和10% vol/vol胎牛血清)。细胞每周以1:4的分裂比例传代第3代和第14代。gydF4y2Ba
钙动员的测量gydF4y2Ba
ET-1 (0.1-100 nM)或组胺(0.1-100 μM)对细胞内钙水平的影响如前所述gydF4y2Ba23gydF4y2Ba.ASM的镀密度为2×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(4000个细胞·gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba当>90%融合时,去除DMEM,用羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)缓冲盐水(HBS)缓冲液(145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO)洗涤细胞两次gydF4y2Ba4gydF4y2Ba.7HgydF4y2Ba2gydF4y2BaO, 10mmgydF4y2BadgydF4y2Ba-葡萄糖,10毫米HEPES,游离酸,2毫米钙gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.2HgydF4y2Ba2gydF4y2BaO, 2.5 mM丙苯乙酯,37°C, pH 7.4)。用含1 μM Fluo-4的HBS在35°C下浸泡60 min后清洗。细胞内钙离子的变化gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba使用Flexstation II (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)在2分钟内测量激动剂浓度增加引起的浓度。gydF4y2Ba
胶原凝胶的制备gydF4y2Ba
在不完全培养基(胎牛无血清DMEM, 0.25%重量/体积BSA)中,将融合ASM的烧瓶中去血清72小时,导致生长停滞。用0.5%胰蛋白酶置换细胞,收集并离心(1500 × 1500)gydF4y2BaggydF4y2Ba, 5分钟),在细胞密度≤3.75×10时重新悬浮gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba四倍浓缩不完全DMEM。细胞悬液立即与纤原性I型胶原蛋白(1.6 mg·mL)充分混合gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba透析大鼠尾腱胶原蛋白提取如前所述gydF4y2Ba24gydF4y2Ba, 4°C),以1:3的比例,将凝胶浇注在24孔培养板(0.5 mL凝胶·孔gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba, 37°C, 15分钟)。凝胶凝固后,加入1ml不完全DMEM,将凝胶移出,转移到六孔板上,在3ml不完全DMEM中自由悬浮,孵育≤72小时。gydF4y2Ba
药物处理及凝胶面积测定gydF4y2Ba
评价ET-1 (0.1 ~ 10 nM)和组胺(0.01 ~ 100 μM)对asm介导的凝胶面积变化的影响。ET-1拮抗剂BQ123 (ETgydF4y2Ba一个gydF4y2Ba-selective)和BQ788 (ETgydF4y2BaBgydF4y2Ba-选择性)用于确定ET-1是否介导凝胶收缩gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba或等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体,分别。这些试剂的活性在0.1 ~ 10 μM范围内进行评估,因为该浓度范围横跨公布的pAgydF4y2Ba2gydF4y2BaBQ123为6.9 - 7.4,BQ788为6.9gydF4y2Ba25gydF4y2Ba.以已知的浓度添加磷酸肌醇3-激酶(PI3K) (LY294002, 20 μM)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK) (SB203580, 30 μM)和MEK 1/2 (U0126, 50 μM)抑制剂,以抑制ASM(在gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).细胞松弛素D (100 nM)和拉琴库素A (2 μM)在抑制胶原凝胶内肌动蛋白聚合的浓度下的作用进行了评估gydF4y2Ba26gydF4y2Ba.camp升高剂8-溴camp (300 μM)和沙丁胺醇(10-1000 nM)以及糖皮质激素、地塞米松(10-1000 nM)和布地奈德(100 nM)在适当浓度下也进行了测试gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba.所有潜在抑制剂均在ET-1前30分钟添加(10 nM)。gydF4y2Ba
ASM凝胶区最初由24个铸型孔培养板的直径确定。然后用图像分析系统(柯达图像站440CF;伊士曼柯达,罗切斯特,纽约,美国)。通过重复测量同一凝胶的面积确定的变异系数<3%。gydF4y2Ba
ASM凝胶的扫描电镜gydF4y2Ba
在0.1 M PBS中2.5%戊二醛固定2小时的胶原凝胶中的ASM细胞被冲洗(3×15 min),并在1%四氧化锆中固定1小时。冲洗(PBS, 3×15 min)后,标本在分级乙醇系列(30,50,70,90和100%乙醇在水中,各20分钟)中脱水,在bar - tec 030 CPD (bar - tec a.g., Balzers, Lichtenstein)中进行关键干燥,并安装在25mm带双面碳标签的铝根上。样品在Edwards S150B溅射涂布机(Edwards High Vacuum Ltd, Crawley, West Sussex, UK)中镀金,并在Philips XL30 (Eindhoven, Netherlands)场发射扫描电子显微镜下2kv成像。gydF4y2Ba
用MTT法测量ASM密度gydF4y2Ba
含asm的凝胶与3-[4,5 -二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化铵(MTT,终浓度为1 mg·mL)孵育gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,隔夜,37°C),洗净(PBS两次),用胶原酶(0.25 mg·mL)消化gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba, 37°C, 2 h)。离心后(10000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba, 5 min),在细胞球中加入400 μL二甲基亚砜使蓝色甲醛甲腈产品溶解,在550 nm处用吸光度法定量(方法由gydF4y2Ba27gydF4y2Ba).增加细胞密度和吸光度之间的线性关系,在密度高达3.75×10的ASM种子凝胶中测量gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba72 h后维持(补充图A)。gydF4y2Ba
上清液基质金属蛋白酶-2活性测定gydF4y2Ba
用明胶酶谱法测定凝胶上清液中蛋白水解基质金属蛋白酶(MMP)的活性,以人培养ASM的条件培养基作为内对照。如前所述,使用柯达1D软件(伊士曼柯达)进行图像捕获和密度测定gydF4y2Ba28gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
测定凝胶重量和羟脯氨酸含量gydF4y2Ba
如前所述,收集凝胶以确定湿重,随后测定冷冻干燥凝胶的酸裂解液中的总羟脯氨酸作为胶原蛋白含量的指标gydF4y2Ba29gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
ASM迁移测量gydF4y2Ba
用伤口试验评估ASM的迁移gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba.细胞在24孔板中培养至融合,然后在不完全培养基中进行血清饥渴24小时,然后用200 nM Mitotracker Green(分子探针2小时)处理。用PBS洗涤细胞两次,加入新鲜的不完全培养基。用移液管尖端刮取细胞层,然后将细胞在ET-1不存在和存在(10 nM)的条件下孵育18小时。使用活细胞成像技术观察伤口边缘并拍照(徕卡DMI 6000B;徕卡,米兰,意大利)每隔30分钟。使用VideoSavant™软件(IO Industries Inc., London, ON, Canada)分析伤口面积随时间的变化。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
所有数据均以均数±表示gydF4y2Ba扫描电镜gydF4y2Ban个不同原代培养的反应,每个原代培养来自不同的供体,并使用GraphPad Prism™软件4.0版(GraphPad software, La Jolla, CA, USA)进行分析。用双向重复测量方差分析(ANOVA)检验时间、细胞密度或药物浓度对原始面积值的影响。通过配对t检验或单向重复测量方差分析检查抑制剂的作用,然后采用BonferronigydF4y2Ba事后gydF4y2Ba多重比较测试。p<0.05为差异有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
asm介导的胶原重构依赖于时间和细胞密度gydF4y2Ba
为了确定ASM是否能介导胶原重构,我们以不同的数值密度在ASM细胞不存在和存在的情况下制备凝胶。72小时内无细胞胶原凝胶面积无变化(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba和b).使用ASM制备的凝胶在增加细胞密度(0.625-3.75×10)时,面积明显减少了50%gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
用扫描电镜观察了凝胶内ASM的形态。投胶后即刻可见ASM与周围胶原纤维的多重相互作用(t = 0,gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba).虽然ASM细胞最初呈圆形,但72 h后明显拉长(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba).随着时间的推移,凝胶内胶原纤维密度明显增加(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba和b)随着ASM密度的增加(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba和d)。gydF4y2Ba
随后的研究在ASM密度为2.5×10的情况下进行gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在最初的4小时内,初始凝胶面积减少了13±3% (n = 19,与t = 0相比p<0.05)。选择这个密度是为了评估凝胶面积次最大减少的增强或抑制。gydF4y2Ba
ET-1增强了胶原蛋白重塑gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体,但可能独立于主动肌肉收缩gydF4y2Ba
为了确定ASM的主动收缩对ASM介导的凝胶面积减少的潜在贡献,我们评估了ET-1和组胺的影响。为了证明这些收缩激动剂的功能受体表达,在培养的ASM中测量了它们对钙动员的影响。在胶原凝胶试验测试的浓度范围内,ET-1和组胺存在时,细胞内钙在几分钟内明显增加,其中ET-1更有效(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
尽管两种激动剂都能诱导钙动员,但只有ET-1 (0.1-10 nM)以浓度依赖的方式增强胶原重构,(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba方法的方差分析;p<0.05),组胺(0.01 ~ 100 μM)无显著影响(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
使用选择性拮抗剂BQ123和BQ788检测ET-1反应的受体依赖性,BQ123和BQ788对ET显示出>万倍的选择性gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和等gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体分别gydF4y2Ba25gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba).在缺乏ET-1的情况下,拮抗剂不影响凝胶面积(数据未显示)。通过与ET预孵育,可以阻止对10 nM ET-1 (t = 72 h时凝胶面积:42±3%初始面积,n = 5)的反应gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba拮抗剂BQ123 (0.1 μM,与ET-1单独比较p<0.05)。相比之下,BQ788仅在10 μM时有效,浓度是其pA的100倍gydF4y2Ba2gydF4y2BaET值gydF4y2BaBgydF4y2Ba受体。gydF4y2Ba
胶原重塑与ASM增生无关gydF4y2Ba
通过测量MTT代谢作为细胞密度的标志,评估了凝胶内持续的ASM增殖的潜在贡献。在凝胶中注入ASM,初始密度为2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba在胶原重构过程中,MTT转化的吸光值没有改变(t = 0时为2.3±0.4,t = 72 h时为2.7±0.6,n = 8;P >0.05,配对t检验)。虽然ET-1存在72 h后凝胶面积减少更大,但吸光度值没有增加(对照为2.0±0.5,ET-1为1.6±0.4,n = 8, p>0.05,配对t检验)。gydF4y2Ba
胶原重塑可能与ASM迁移有关gydF4y2Ba
在不存在ET-1和存在ET-1的情况下进行伤口测定,以确定当ASM在I型胶原凝胶中播种时,ASM迁移是否有助于减少凝胶面积。在测试的四种ASM培养物中,有三种使用ET-1治疗后,在控制条件下超过18小时的伤口面积减少增加(gydF4y2Ba图4 a egydF4y2Ba).gydF4y2Ba
为了研究凝胶收缩对单体肌动蛋白组装成肌动蛋白丝的依赖性,凝胶在细胞松弛素D和拉赤库菌素a的存在下孵育,这两种肌动蛋白聚合抑制剂都抑制凝胶收缩,细胞松弛素D在控制条件下减少了42±11%的凝胶面积变化(n = 4;p < 0.05)。拉琴库林A更有效,在ET-1不存在和存在的情况下,完全消除了凝胶面积随时间的变化(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
与凝胶面积减少相关的信号通路也进行了评估。SB203580抑制p38 MAPK, LY294002抑制PI3K,分别抑制对照组凝胶面积减少69±21%和31±7% (n = 4, p<0.05,配对t检验)。在这两种抑制剂的存在下,对ET-1的增强反应仍然明显,而MEK1/2抑制剂U0126在没有或存在ET-1的情况下对胶原重构没有可检测到的影响(数据未显示)。gydF4y2Ba
胶原蛋白重构与胶原蛋白凝聚有关,而不是降解gydF4y2Ba
考虑到未经处理的ASM凝胶随着时间的推移面积显著减少,还测量了凝胶重量的变化。对照组72 h后凝胶湿重(凝胶体积)显著降低60±11%(与t = 0相比p<0.01)。gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba).ET-1处理的湿重损失进一步降低至72±8%(与对照组相比p<0.01)。gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
为了确定体重的减轻是否是由于胶原蛋白和水的损失,对ASM凝胶的羟脯氨酸含量进行了测定。初始羟脯氨酸含量平均为干凝胶重量的7.4±0.4% (n = 4)。72 h收集的上清液中无法检测到羟脯氨酸,凝胶内含量不随时间或ET-1处理而变化(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
然后研究了基质金属蛋白酶在胶原重构调控中的作用。在72 h收集的ASM凝胶上清液中检测到MMP-2的潜在活性和活性,但没有检测到MMP-9活性(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba).ET-1存在时,凝胶上清液中MMP活性未检测到增加(n = 8,gydF4y2Ba图5度gydF4y2Bad).非选择性MMP抑制剂伊洛司他(ilomastat)没有抑制ASM凝胶面积随时间的减少(gydF4y2Ba图5 egydF4y2Ba).gydF4y2Ba
用于治疗哮喘的药物不能调节胶原蛋白的重塑gydF4y2Ba
还评估了放松ASM的药物和糖皮质激素对凝胶收缩的潜在调节。与β预孵育gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-肾上腺素受体激动剂沙丁胺醇不影响对照或et -1处理凝胶的凝胶面积减少率或程度(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba).这种camp提升剂的缺乏效果与使用稳定类似物8-溴- camp (gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba).在浓度高达1000 nM时,糖皮质激素地塞米松在ET-1不存在或不存在时都不能调节凝胶收缩的程度(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba).布地奈德单独或联合沙丁胺醇预孵育不影响对照或et -1处理凝胶的凝胶面积减少(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在本研究中,ASM接种的三维I型胶原凝胶面积的减少是细胞密度依赖性的,并通过ET-1作用而增加gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体。这一过程似乎不涉及肌细胞收缩,因为它发生的时间比通常与平滑肌缩短和力量发展相关的时间长得多。此外,组胺不能模拟反应,也不能通过放松ASM的药物来阻止反应。ASM与周围基质之间的相互作用与胶原纤维密度增加有关,而不是胶原降解,与ASM通过胶原凝胶迁移时的牵引力重塑一致。这种胶原蛋白重构对糖皮质激素治疗有抗性,并可能有助于增加ASM束中的胶原蛋白密度gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba在哮喘呼吸道。这一过程有可能影响不同的气道平滑肌功能,包括增殖、迁移和细胞因子的产生,除了改变细胞的物理特性,以防止肌肉缩短和延长。gydF4y2Ba
细胞介导的胶原凝胶收缩已被广泛应用于临床gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在纤维化疾病的背景下,研究成纤维细胞的组织重塑和伤口愈合的模型gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba.很少有研究研究asm介导的胶原凝胶重构gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba.鉴于ASM- ecm相互作用的改变可能影响呼吸道疾病中ASM的收缩和合成功能,我们试图探索这一点gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba过程及其调控的潜在机制。gydF4y2Ba
在没有外源性收缩刺激的情况下,注入ASM的漂浮胶原凝胶的面积在数小时内自发减少。在使用成纤维细胞凝胶的研究中,这种面积减少归因于应用于胶原原纤维的等距张力,因为成纤维细胞发展成肌细胞样缩短gydF4y2Ba34gydF4y2Ba.然而,在目前的研究中,在没有外源性刺激的情况下,ASM凝胶面积在数天内逐渐减少,这与急性ASM缩短并不一致。虽然这种明显的“收缩”随着ASM密度的增加而增加,但在收缩的凝胶中扫描电镜显示,无论凝胶面积减少的程度如何,凝胶内细胞的外观都保持拉长。gydF4y2Ba
尽管有证据表明,ET-1和组胺都是ASM的收缩激动剂,可以在培养的ASM中引起钙的动员,但ET-1增加了ASM凝胶面积的减少,而组胺没有。这些数据表明,et -1诱导的胶原重构也可能独立于胶原凝胶内ASM的主动收缩。为了支持这一点,ET-1的反应是介导的gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba的等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而不是ETgydF4y2BaBgydF4y2Ba负责ASM收缩的受体gydF4y2Ba35gydF4y2Ba.此外,稳定的cAMP类似物8-溴-cAMP和βgydF4y2Ba2gydF4y2Ba-肾上腺素受体激动剂沙丁胺醇作为功能性拮抗剂来反对ASM收缩能够抑制反应。这些药剂扩散到凝胶中的限制似乎不能解释这种效果的缺乏,因为凝胶面积的减少被各种化学上不同的药剂预孵育所抑制,而对ET-1的反应可以被选择性ET所抑制gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba拮抗剂BQ123。gydF4y2Ba
组胺没有引起ASM凝胶面积减少的发现与先前的报道相反gydF4y2Ba36gydF4y2Ba其中,对100 μM组胺的反应,凝胶面积在20分钟内明显减少了10-20%gydF4y2Ba等gydF4y2Ba.gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,凝胶要么附着在铸板上过夜(所谓的“预应力”凝胶),要么在药物添加前已经达到asm介导的最大还原。在目前的研究中,在添加组胺之前,初始凝胶区域没有稳定,因此如果在新铸凝胶释放时同时发生,对组胺的小急性反应可能没有被检测到。然而,在ET-1不存在或存在的情况下,凝胶面积在数天内持续减少高达75%,这证明了肌肉的主动收缩并不是观察到的胶原基质长期重塑的主要机制。gydF4y2Ba
正如这里描述的ASM凝胶和之前使用成纤维细胞的研究gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,细胞密度的增加导致更大的胶原蛋白重塑。ASM增殖的贡献是可能的,因为变性(非纤原性)I型胶原已被证明能促进ASM增殖gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba.然而,ASM凝胶面积的显著减少发生在24小时内,远远早于ASM的种群倍增时间36-48小时gydF4y2Ba27gydF4y2Ba.此外,我们已经证明了在这些凝胶收缩实验中使用的纤原性I型胶原基质是抗有丝分裂的gydF4y2Ba37gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
据报道ET-1可引起ASM中DNA合成的小幅增加gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba等gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba受体,但似乎需要共同有丝分裂原显著增加细胞数量gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba.在目前的研究中,凝胶重塑对ET-1的反应对抑制PI3K或细胞外信号调节激酶通路不敏感,而这些通路是ASM增殖所必需的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba.此外,无论ET-1是否存在,细胞数量和活力在实验期间都是稳定的。因此,凝胶内的胶原重塑似乎与ASM增殖无关。gydF4y2Ba
胶原蛋白凝胶面积减少的替代机制包括凝胶脱水和/或胶原蛋白分解gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba.在目前的研究中,扫描电镜显示收缩的ASM凝胶在细胞周围有胶原原纤维的凝结。由于凝胶湿重随时间的减少并没有伴随羟脯氨酸含量的减少,因此胶原原纤维不太可能正在降解。之前的一项研究也使用ASM在胶原凝胶中播种,但没有检测到ECM降解,除非ASM与单核细胞共培养或与中性粒细胞弹性蛋白酶孵育gydF4y2Ba33gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
细胞介导的凝胶收缩的另一种机制是胶原晶格的牵引力重塑,这是细胞通过基质迁移的结果,正如已描述的成纤维细胞gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba.与此一致,我们已经证明了在凝胶实验中使用的ASM培养物在伤口实验中迁移的能力。迁移对ASM介导的胶原重构的潜在贡献是由本研究中发现的凝胶面积的自发减少被SB203580部分抑制所支持的,因为p38 MAPK途径先前已涉及ASM迁移gydF4y2Ba41gydF4y2Ba.关键的是,凝胶收缩也被肌动蛋白聚合的抑制剂阻止,它破坏了ASM牵引和迁移所需的细胞骨架元件gydF4y2Ba42gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
ASM胶原凝胶的重塑可能依赖于MMP活性,从而将细胞从其基质连接中释放出来,正如已报道的成纤维细胞凝胶一样gydF4y2Ba43gydF4y2Ba.虽然在ASM凝胶的上清液中检测到MMP-2活性,但非选择性MMP抑制剂伊洛司他不能抑制ASM介导的凝胶面积减少。尽管ET-1已被证明上调MMPs的表达与血管重塑相关gydF4y2Ba44gydF4y2Ba, ET-1增强ASM凝胶的胶原重塑与MMP-2活性的增加无关。研究结果表明,MMP活性不是ASM重塑胶原蛋白的必要条件。gydF4y2Ba
鉴于ASM介导的胶原重塑可能对呼吸道中不同的ASM细胞功能有潜在影响,因此确定ASM凝胶收缩是否由用于治疗哮喘的药物调节是有兴趣的。导致ASM松弛的沙丁胺醇无效的发现与已经提出的证据一致,即ASM凝胶面积的减少是由于胶原重塑而不是急性ASM缩短。然而,如果胶原凝胶的凝结确实需要ASM的牵引重塑和迁移,那么沙丁胺醇的抑制作用可能是可以预期的,因为先前有报道称,动员cAMP的药物抑制了人类ASM的迁移gydF4y2Ba45gydF4y2Ba.缺乏对ASM凝胶面积减少的影响需要进一步研究,以确定是否通过β信号传导gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-肾上腺素受体激动剂在嵌入三维胶原基质的ASM中受损,正如已报道的糖皮质激素信号传递时,ASM在胶原蛋白上生长gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
地塞米松和布地奈德都不能调节ASM凝胶面积的减少。这类药物对ASM介导的胶原重构缺乏影响,这与其他检查类固醇调节不同ASM功能的研究一致。糖皮质激素不能调节ASM对促纤维化介质的ECM产生gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,在胶原蛋白存在的情况下,由于α增加,它们对ASM增殖和迁移的抑制作用受损gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-βgydF4y2Ba1gydF4y2Ba整合素信号gydF4y2Ba13gydF4y2Ba.然而,ASM胶原凝胶的发现与布地奈德或氢化可的松增强HFL-1凝胶收缩的研究相反gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba.虽然成纤维细胞和ASM在介导胶原重构方面有共同的作用,但肺间充质细胞对这一过程的不同调节可能决定了它们在健康和疾病中对持续重构的相对贡献。gydF4y2Ba
总之,这项研究证明了ASM在ECM的动态调节及其在抗糖皮质激素和β作用的气道疾病中的异常调节中具有额外的潜在作用gydF4y2Ba2gydF4y2Ba肾上腺素能受体受体激动剂。这一细胞依赖性过程可增加ASM束的胶原密度gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba,并进一步促进ASM-ECM相互作用,可能对气道功能产生深远影响。最终,asm介导的凝胶收缩可能为识别选择性药物提供有用的筛选,以防止包括哮喘在内的肺部疾病的细胞介导的胶原重塑。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢J. Wilson(澳大利亚墨尔本阿尔弗雷德医院过敏、免疫和呼吸医学系)和阿尔弗雷德医院(墨尔本)的解剖病理学家为提供人类肺部样本提供便利,感谢S. Langenbach(墨尔本大学药理学系)在羟脯氨酸测量方面的初步协助,感谢S. Crawford(墨尔本大学药理学系)在电子显微镜样品制备方面的协助。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这篇文章有补充资料可从gydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
支持声明gydF4y2Ba
这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会的支持(资助299823,509001,509239);澳大利亚学术与科学(CASS)基金会;澳新银行医学研究与技术维多利亚基金,澳大利亚科学院和维多利亚哮喘基金会。gydF4y2Ba
权益声明书gydF4y2Ba
A. g . Stewart的权益声明可在gydF4y2Bawww.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtmlgydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2009年1月16日gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2010年6月9日gydF4y2Ba
- ©2011人队gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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